不同發育階段馬鈴薯塊莖蛾可培養內生細菌多樣性及對消化作用的影響

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2025.01.021

摘要：【目的】明確馬鈴薯塊莖蛾［Phthorimaea operculella（Zeller）］可培養內生細菌隨宿主生長發育的變化動態及對取食消化功能的影響，為昆蟲腸道微生物功能研究和微生物資源的開發利用打下理論基礎。【方法】以不同發育階段的馬鈴薯塊莖蛾為研究對象，通過傳統分離培養技術對不同發育階段的馬鈴薯塊莖蛾體內（卵、1齡和2齡幼蟲）或腸道（3齡和4齡幼蟲、雌雄蛹、雌雄成蟲）進行可培養內生細菌分離培養，通過16S rDNA序列分析對分離菌株進行種屬鑒定；通過重飼喂優勢細菌和常駐細菌，采用重量法測定馬鈴薯塊莖蛾營養指標，分析優勢細菌和常駐細菌對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食及消化的影響。【結果】馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段的可培養內生細菌組成及多樣性不同，其中從卵中分離到的可培養內生細菌種類數量最少，幼蟲可培養內生細菌種類最豐富，且隨著齡期的增加其可培養內生細菌數量逐漸增多，化蛹后開始下降。馬鈴薯塊莖蛾可培養內生細菌共有3門13科17屬30種，其中卵可培養內生細菌有2門3科3屬3種，1～4齡幼蟲、蛹和成蟲可培養內生細菌分別有2門2科2屬3種、2門4科5屬6種、3門9科10屬11種、3門10科10屬11種、3門5科5屬7種、3門8科8屬10種。不同發育階段的馬鈴薯塊莖蛾可培養內生細菌優勢種不同，其中1齡幼蟲可培養細菌優勢種為路氏腸桿菌（Enterobacter ludwigii），而卵、2～4齡幼蟲、雌雄蛹和雌雄成蟲可培養內生細菌優勢種均為蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）。蒙氏腸球菌在不同發育階段馬鈴薯塊莖蛾中均穩定存在，深紅沙雷氏菌（Serratia rubidaea）在3齡和4齡幼蟲、雌雄蛹和雌雄成蟲中存在。蒙氏腸球菌、路氏腸桿菌和深紅沙雷氏菌能促進馬鈴薯塊莖蛾消化。【結論】馬鈴薯塊莖蛾可培養內生細菌種類豐富，不同發育階段馬鈴薯塊莖蛾可培養內生細菌組成結構不同，幼蟲期可培養內生細菌種類明顯高于卵和蛹，但優勢種無明顯差異。內生細菌優勢種能通過促進幼蟲的消化而促進宿主的生長發育。

關鍵詞：馬鈴薯塊莖蛾；內生細菌；可培養細菌；消化作用；營養指標

中圖分類號：S435.32文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）01-0236-14

Diversity of culturable endophytic bacteria at different develop? mental stages of Phthorimaea operculella（Zeller）and its effects on digestion

FU Qiao-si1，XIAO Guan-li2，CHEN Bin1，WANG Wen-qian1*，DU Guang-zu1*

（1College of Plant Protection，Yunnan Agricultural University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources in Yunnan，Kunming，Yunnan 650201，China；2College of Agronomy and Biotechnology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China）

Abstract：【Objective】To clarify the dynamic changes of culturable endophytic bacteria of Phthorimaea operculella（Zeller）with the growth and development of the host and their effects on feeding and digestive function，which could pro-vide theoretical basis for exploring the interaction between symbiotic bacteria and hosts.【Method】Taking Phthorimaea operculella（Zeller）at different developmental stages as the research object，the culturable endophytic bacteria were iso-lated and cultured in the body（eggs，1st and 2nd instar larvae）or intestine（3rd and 4th instar larvae，male and female pu-pae，male and female adults）of Phthorimaea operculella（Zeller）at different developmental stages by traditional isola-tion and culture technology.The isolated strains were identified by 16S rDNA sequence analysis，through refeeding domi-nant bacteria and resident bacteria，the nutritive indexes of Phthorimaea operculella（Zeller）were detected by gravimetric method，and effects of dominat bacteria and resident bacteria on the feeding and digestion of Phthorimaea operculella（Zeller）larvae were analyzed.【Result】The composition and diversity of culturable endophytic bacteria at different deve-lopmental stages of Phthorimaea operculella（Zeller）were different.The number of culturable endophytic bacteria iso-lated from eggs was the least，and the number of culturable endophytic bacteria isolated from larvae was the most abun-dant.With the increase of age，the number of culturable endophytic bacteria gradually increased，and began to decline af-ter pupation.There were 3 phyla，13 families，17 genera and 30 species of culturable endophytic bacteria in Phthorimaea operculella（Zeller）.Among them，there were 2 phyla，3 families，3 genera and 3 species of culturable endophytic bacte-ria in eggs.There were 2 phyla，2 families，2 genera and 3 species；2 phyla，4 families，5 genera and 6 species；3 phyla，9 families，10 genera and 11 species；3 phyla，10 families，10 genera and 11 species；3 phyla，5 families，5 genera and 7 species；3 phyla，8 families，8 genera and 10 species of culturable endophytic bacteria in 1st-4th instar larvae，pupae and adults respectively.The dominant species of endophytic bacteria in Phthorimaea operculella（Zeller）at different develop-mental stages were different.The dominant species of culturable bacteria of the 1st instar larvae was Enterobacter ludwi-gii，while the dominant species of culturable bacteria of eggs，2nd-4th instar larvae，pupae，and adults were Enterococcus mundtii.Enterococcus mundtii was stable at all developmental stages of the Phthorimaea operculella（Zeller），and Serra-tia rubidaea was found in the 3rd and 4th instar larvae，pupae and adults.Enterococcus mundtii，Enterobacter ludwigii and Serratia rubidaea can promote the digestion of Phthorimaea operculella（Zeller）.【Conclusion】The species of culturable endophytic bacteria in Phthorimaea operculella（Zeller）are abundant.The composition and structure of culturable endo-phytic bacteria in Phthorimaea operculella（Zeller）at different developmental stages are different.The species of cultura-ble endophytic bacteria in larvae are greatly higher than those in eggs and pupae，but there is no obvious difference in dominant species.The dominant species of endophytic bacteria can promote the growth and development of the host by promoting the digestion of larvae.

Key words：Phthorimaea operculella（Zeller）；endophytic bacteria；cultural bacteria；digestion function；nutritive index

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32360711）；Young Talent Basic Research Project of Scientific Research Fund of Yunnan Education Department（2024J0407）

0引言

【研究意義】馬鈴薯塊莖蛾［Phthorimaea opercu-lella（Zeller）］又名煙草潛葉蛾，隸屬于鱗翅目（Lepi-dotera）麥蛾科（Gelechiidae），在世界范圍內廣泛分布（Rondon，2010）。該蟲主要危害茄科植物（杜霞等，2021），尤其在煙草和馬鈴薯上危害較嚴重（王文倩等，2020）。馬鈴薯塊莖蛾對環境的適應性強，繁殖能力強且能進行孤雌生殖，造成的經濟損失較大（Gao，2018；Liu et al.，2018）。目前該蟲在我國南方馬鈴薯產區普遍發生，且有分布面積不斷擴大的趨勢（高玉林，2021）。昆蟲腸道內棲息著大量的微生物群體，其與宿主在長期協同進化過程中形成了緊密的共生關系（Engel and Moran，2013；易春燕等，2024）。因此，明確馬鈴薯塊莖蛾各發育階段可培養內生細菌的組成結構有助于了解其腸道細菌隨宿主生長發育的消長規律，探究調控昆蟲變態的關鍵菌株，從而進一步發掘共生菌在宿主體內的生理功能，為腸道微生物與宿主昆蟲之間的互作關系研究打下理論基礎。【前人研究進展】腸道微生物能通過發揮各種重要功能參與調控宿主的各項生命活動（Doug-las，2015；李文紅等，2023），如解毒免疫（Wu et al.，2020）、協助宿主營養代謝（Li etal.，2021）、促進繁殖（Bai etal.，2024）、影響宿主覓食行為（Liberti etal.，2024）、提高宿主對環境的適應性（Vernier et al.，2024）等。近年來，腸道微生物在開發生物防治藥劑、生物降解和阻斷蟲媒疾病傳播方面顯示出良好的應用前景（Zhang et al.，2022）。目前研究發現，腸道微生物在宿主體內的組成結構存在很多影響因素，在不同因素影響下昆蟲的腸道微生物處于動態變化中（馬玲等，2023）。昆蟲種類不同其腸道微生物也存在差異（Liu et al.，2019），同時，季節變化（Higuita Palacio et al.，2021）、取食食物改變（Yang et al.，2022）、光周期改變（楊雨馨等，2023）、地理位置不同（Zhao et al.，2023）、交配方式不同（Zhao et al.，2023）等均會對腸道微生物群落結構產生影響。此外，全變態昆蟲每個階段的內部構造和外部形態均發生極大變化，因此在不同發育階段其腸道細菌的組成結構也有差異（Sontowski and Dam，2020）。如，蜜蜂幼蟲腸道中內生細菌優勢菌厚壁菌門（Fir-micutes）的豐度隨蜜蜂的生長發育逐漸減少（Lanh et al.，2022）；食蚜蠅幼蟲、蛹、成蟲腸道細菌優勢菌也不同（Changetal.，2024）；綠盲蝽成蟲腸道沙雷氏菌豐度顯著高于若蟲（Guo et al.，2024）。Sevim等（2016）、鄭亞強等（2017）采用傳統的分離培養技術從馬鈴薯塊莖蛾4齡幼蟲腸道內分離到4門7科8屬10種細菌；樊清艷等（2020）采用培養組學技術從取食馬鈴薯塊莖的馬鈴薯塊莖蛾腸道分離到4門8科10屬15種細菌，從取食馬鈴薯葉片的馬鈴薯塊莖蛾腸道分離到4門10科10屬16種細菌。昆蟲通過取食和營養代謝獲得生長發育所需的基本能量，寄主植物的營養成分和昆蟲本身的營養代謝能力與昆蟲的生長發育、繁殖能力和免疫功能之間存在相互作用（Wilson et al.，2019；李傳明，2021），而昆蟲營養指標的測定能直觀反映昆蟲的取食消化和代謝能力（藍波妙，2016）。薛釗鴻等（2018）發現致死劑量的茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺可能會刺激害蟲取食，加速新陳代謝，促進生長發育；唐慶峰等（2020）對草地貪夜蛾各項營養指標進行測定，發現取食玉米的花絲、雌穗和心葉等幼嫩組織更適合草地貪夜蛾的生長發育和營養獲取；丁新華等（2023）研究發現，飼料中食物氮素含量的增加會顯著提高亞洲玉米螟4齡和5齡幼蟲的食物利用率、相對取食率和氮利用率。【本研究切入點】目前有研究明確了馬鈴薯塊莖蛾4齡幼蟲的腸道可培養細菌種類（鄭亞強等，2017；樊清艷等，2020），但對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲其他齡期和不同發育階段的腸道細菌組成結構，以及其中的優勢及常駐細菌對宿主營養代謝的作用尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】以不同發育階段的馬鈴薯塊莖蛾為研究對象，通過傳統分離培養技術和分子生物學技術對不同發育階段的馬鈴薯塊莖蛾可培養內生細菌進行分離培養及形態和分子鑒定，選取分離培養得到的優勢細菌及常駐細菌飼喂馬鈴薯塊莖蛾幼蟲并測定其營養指標，以明確馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段可培養內生細菌的組成結構、各發育階段的優勢細菌及優勢細菌對宿主取食消化功能的影響，為昆蟲腸道微生物功能研究和微生物資源的開發利用打下理論基礎。

1材料與方法

1.1供試蟲源

馬鈴薯塊莖蛾采集自云南省宣威市板橋鎮（26°05′52.3″N，104°04′27.5″E）馬鈴薯田，并在云南農業大學植物保護學院昆蟲實驗室室內飼養繁殖建立穩定種群。

1.2供試馬鈴薯葉片

供試馬鈴薯品種為合作88。將合作88馬鈴薯種植于花盆中，放置于自然條件下生長至高30 cm，采摘健康、無病蟲害的葉片清洗備用。

1.3馬鈴薯塊莖蛾各發育階段可培養內生細菌的分離培養

收集卵、1～4齡幼蟲、雌雄蛹和雌雄成蟲樣本，選取200枚卵、1齡和2齡幼蟲各100頭、3齡和4齡幼蟲各50頭、雌雄蛹各50頭、雌雄成蟲各50頭，在無菌水中漂洗1 min，移入75%乙醇溶液消毒30 s，再移入無菌水中漂洗2次，每次1 min，所有操作均在超凈工作臺中進行。表面消毒后，卵、1齡和2齡幼蟲直接置于裝有0.2 mL PBS緩沖液的無菌離心管中研磨，添加無菌水至1 mL備用；3齡和4齡幼蟲及雌雄蛹在超凈工作臺中解剖，將解剖出的腸道放入裝有0.2 mL PBS緩沖液的無菌離心管中研磨，添加無菌水至1 mL備用；雌雄成蟲在顯微鏡下解剖，將解剖出的腸道放入裝有0.2 mL PBS緩沖液的無菌離心管中研磨，添加無菌水至1 mL備用。將上述制備好的懸浮液分別稀釋成1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7 CFU/mL不同濃度梯度懸浮液，用移液槍吸取100μL懸浮液于LB培養基上涂布，每個濃度涂3個培養皿，置于30℃培養箱中培養36～72 h，挑取顏色、形態、大小各異的單菌落在LB培養基上純化4～5次，純化后置于4℃冰箱中保存備用（鄭亞強等，2017）。統計各培養基上的菌落數，計算各菌株的相對豐度。

相對豐度（%）=某菌株個體數/總株數×100

1.4細菌鑒定

觀察分離純化后的單克隆菌落，記錄單菌落的顏色、形態、大小、邊緣形狀、隆起度等。參照《伯杰細菌鑒定手冊》（布坎南和吉本斯，1984）鑒定細菌的細胞形態。采用革蘭氏染色法對細菌進行染色，在顯微鏡下觀察細菌的細胞形態及革蘭氏陰/陽性（常呂恕等，2022）。其中，分離自卵的菌株字母編號為E，1～4齡幼蟲菌株字母編號依次為A、B、C、D，雌雄蛹菌株字母編號分別為PF和PM，雌雄成蟲菌株字母編號分別為AF和AM。

采用凍融法提取分離純化后的細菌DNA，將單克隆菌落用槍頭挑至裝有500μL無菌水的1.5 mL離心管中，渦旋振蕩1 min后于液氮冷凍10min，再煮沸5 min，最后12000 r/min離心2 min，取上清液作為PCR模板。使用細菌16SrDNA通用引物27F：5'-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R：5'-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3'對DNA片段進行PCR擴增（徐天梅等，2021）。PCR反應體系25.0μL：2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1.0μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 9.5μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃1 min，53℃30 s，72℃2 min，進行32個循環；72℃延伸10min。電泳檢測合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列結果拼接處理后上傳至NCBI，與已知序列進行比對，下載相似性最高的序列，通過MEGA 11.0進行序列比對，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹（李永萍等，2022）。

1.5馬鈴薯塊莖蛾幼蟲營養指標測定

試驗設5個（CK、AT、EM、SR和EL）處理，以正常葉片（CK）和抗生素混合溶液處理葉片（AT）飼喂幼蟲作為對照，對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲營養指標進行測定。先用新鮮馬鈴薯葉片飼喂馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲，飼養至3齡備用；將新鮮馬鈴薯葉片置于500μg/mL頭孢哌酮、500μg/mL氯霉素、500μg/mL硫酸鏈霉素和500μg/mL環丙沙星混合溶液中浸泡30 min（Wang et al.，2022），晾干后飼喂3齡幼蟲48 h后饑餓6 h稱量幼蟲鮮重，再用正常葉片飼喂48 h（AT）。將新鮮馬鈴薯葉片分別在蒙氏腸球菌（Entero-coccus mundtii）（EM）、深紅沙雷氏菌（Serratia rubi-daea）（SR）和路氏腸桿菌（Enterobacter ludwigii）（EL）菌懸液中浸泡1min后晾干備用；將用抗生素混合溶液浸泡后的葉片飼喂3齡幼蟲48h后饑餓6h稱量幼蟲鮮重，再用各菌懸液浸泡后的葉片飼喂48 h，將剩余食物、糞便及蟲體在85℃下烘干至恒重。各處理15頭幼蟲，5個重復。通過重量法即對飼喂前后食物干重、幼蟲干重和糞便干重稱重后帶入營養指標計算公式，測定幼蟲食物利用率、食物轉化率、近似消化率、幼蟲相對取食量和相對生長率（丁新華等，2023）：

食物利用率（%）=（D?C）/（A?B）×100

食物轉化率（%）=（D?C）/（A?B?E）×100

近似消化率（%）=（A?B?E）/（A?B）×100

相對取食量［g/（g·d）］=（D?C）/［（C+D）/2×T］

相對生長率［g/（g·d）］=（D?C）/［（C+D）/2×T］

式中，A為飼喂前食物干重；B為飼喂后食物干重；C為飼喂前幼蟲干重；D為飼喂后幼蟲干重；E為糞便干重；T為試驗天數。

1.6統計分析

采用Excel 2017進行數據整理，使用SPSS 27.0進行數據分析，在方差正態性和齊性假設的基礎上，進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用LSD法進行組間兩兩比較，使用GraphPad Prism 8.0繪圖。

2結果與分析

2.1馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段可培養內生細菌菌落形態

從馬鈴薯塊莖蛾所有發育階段中共分離到58株細菌，其中卵和1齡幼蟲各分離到3株、2齡幼蟲分離到6株、3齡和4齡幼蟲各分離到11株、雌雄蛹各分離到5株、雌雄成蟲各分離到7株。菌落形態均為圓形，邊緣整齊或不整齊，顏色包括白色、乳白色、黃色、乳黃色；革蘭氏陽性菌37株、革蘭氏陰性菌21株；菌體形狀為球形的有22株、桿狀36株（表1）。

2.2馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段可培養內生細菌分子鑒定結果

經16S rDNA序列比對，分離培養的58株細菌分屬3門13科17屬30種，其中厚壁菌門（Bacillota）細菌23株，包含10株腸球菌科（Enterococcaceae）腸球菌屬（Enterococcus）細菌、7株葡萄球菌科（Staphylococcaceae）葡萄球菌屬（Staphylococcus）和2株動物球菌屬（Mammaliicoccus）細菌、4株芽孢桿菌科（Bacillaceae）芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌；變形菌門（Proteobacteria）細菌21株，包含8株腸桿菌科（Enterobacteriaceae）腸桿菌屬（Enterobacter）和1株勒克氏菌屬（Leclercia）細菌、7株耶爾森菌科（Yer-siniaceae）沙雷氏菌屬（Serratia）細菌、2株莫拉氏菌科（Moraxellales）不動桿菌屬（Acinetobacter）細菌、3株歐文氏菌科（Erwiniaceae）泛菌屬（Pantoea）細菌；放線菌門（Actinobacteria）細菌14株，包含2株擬諾卡氏菌科（Nocardiopsaceae）擬諾卡氏菌屬（Nocardiop-sis）細菌、2株棒桿菌科（Corynebacteriaceae）棒桿菌屬（Corynebacterium）細菌、2株微球菌科（Micrococ-caceae）節桿菌屬（Arthrobacter）和1株檸檬球菌屬（Citricoccus）細菌、3株皮桿菌科（Dermabacteraceae）短桿菌屬（Brachybacterium）細菌、2株束村氏菌科（Tsukamurellaceae）束村氏菌屬（Tsukamurella）細菌、1株微桿菌科（Microbacteriaceae）微桿菌屬（Micro-bacterium）細菌和1株農球菌屬（Agrococcus）細菌（表2）。

分子鑒定結果顯示，卵內可培養內生細菌有2門3科3屬3種，1～4齡幼蟲、蛹和成蟲可培養內生細菌分別有2門2科2屬3種、2門4科5屬6種、3門9科10屬11種、3門10科10屬11種、3門5科5屬7種、3門8科8屬10種。其中卵期分離到的可培養內生細菌種類最少，僅分離到3株菌，隨齡期增長可培養內生細菌種類開始逐漸增多，3齡和4齡幼蟲時達最高值，各分離到11株細菌，到蛹期開始下降。

2.3馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段可培養內生細菌系統發育分析結果

馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段可培養內生細菌菌株的系統發育進化樹分為三大支（圖1）。第一大支主要由厚壁菌門組成，其中芽孢桿菌屬的B10、C4、C17和AM2聚為一支；腸球菌屬的E1和A3聚為一支；動物球菌屬的B8與葡萄球菌屬的E5和B6聚為一支。第二大支由放線菌門組成，其中束村氏菌屬的C8和D10先聚為一小支，然后與棒桿菌屬的C2聚為一支；微桿菌屬的C13與農球菌屬的PM6單獨聚為一支；擬諾卡氏菌屬的E3與短桿菌屬的C7先聚為一小支，然后與節桿菌屬的C5和檸檬球菌屬的AF5聚為一支。第三大支由變形菌門組成，其中沙雷氏菌屬的B7和C14與泛菌屬的PF6先聚為一支，然后與腸桿菌屬的PM3、PF1、AM8、AM4、PF7、AF9及勒克氏菌屬的D8共同聚為一支。

根據系統發育進化樹可看出，動物球菌屬的B8與葡萄球菌屬的E5和B6、束村氏菌屬的C8和D10與棒桿菌屬的C2、微桿菌屬的C13與農球菌屬的PM6、節桿菌屬的C5與檸檬球菌屬的AF5、腸桿菌屬的PM3、PF1、AM8、AM4、PF7、AF9與勒克氏菌屬的D8分別聚為一支，表明其親緣關系較近。

2.4馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段可培養內生細菌組成差異分析結果

在門水平上，馬鈴薯塊莖蛾1齡幼蟲可培養內生細菌中變形菌門為優勢菌門，相對豐度為63.06%，次優勢菌門為厚壁菌門，相對豐度為36.94%；在卵、2齡、3齡、4齡、雌蛹、雄蛹、雌成蟲和雄成蟲可培養內生細菌中，厚壁菌門均占優勢，相對豐度分別為98.78%、99.64%、85.27%、93.88%、79.81%、66.26%、74.27%和97.48%。3齡和4齡幼蟲、雄蛹和雌成蟲腸道可培養內生細菌放線菌門分別占14.64%、0.58%、15.45%和8.77%，變形菌門分別占0.09%、5.54%、18.29%和16.96%（圖2-A）。

在科分類水平上，卵期可培養內生細菌由腸球菌科、擬諾卡氏菌科和葡萄球菌科組成，其中腸球菌科的相對豐度最高，為98.17%；1齡幼蟲可培養內生細菌由腸球菌科和腸桿菌科組成，其中腸桿菌科的相對豐度最高，為63.06%；2齡幼蟲可培養內生細菌由腸球菌科、葡萄球菌科、芽孢桿菌科和耶爾森菌科組成，其中腸球菌科的相對豐度最高，為99.17%；3齡幼蟲腸道可培養內生細菌由腸球菌科、葡萄球菌科、芽孢桿菌科、耶爾森菌科、棒桿菌科、微球菌科、皮桿菌科、束村氏菌科和微桿菌科組成，其中腸球菌科的相對豐度最高，為76.50%；4齡幼蟲腸道可培養內生細菌由腸球菌科、葡萄球菌科、耶爾森菌科、棒桿菌科、微球菌科、腸桿菌科、擬諾卡氏菌科、皮桿菌科、束村氏菌科和莫拉氏菌科組成，其中腸球菌科的相對豐度最高，為93.87%；雌蛹腸道可培養內生細菌由腸球菌科、耶爾森菌科、腸桿菌科和歐文氏菌科組成，其中腸球菌科的相對豐度最高，為79.81%；雄蛹腸道可培養內生細菌由腸球菌科、耶爾森菌科、微桿菌科和腸桿菌科組成，其中腸球菌科的相對豐度最高，為66.26%；雌成蟲腸道可培養內生細菌由腸球菌科、葡萄球菌科、耶爾森菌科、微球菌科、皮桿菌科、腸桿菌科和歐文氏菌科組成，其中腸球菌科的相對豐度最高，為71.93%；雄成蟲腸道可培養內生細菌由腸球菌科、芽孢桿菌科、葡萄球菌科、耶爾森菌科、腸桿菌科和歐文氏菌科組成，其中腸球菌科的相對豐度最高，為95.03%。腸桿菌科在1齡幼蟲可培養內生細菌中相對豐度最高，腸球菌科在卵、2～4齡幼蟲、雌雄蛹、雌雄成蟲可培養內生細菌中相對豐度最高（圖2-B）。

在屬分類水平上，卵期可培養內生細菌由腸球菌屬、擬諾卡氏菌屬和葡萄球菌屬組成，其中腸球菌屬的相對豐度最高，為98.17%；1齡幼蟲可培養內生細菌由腸球菌屬和腸桿菌屬組成，其中腸桿菌屬的相對豐度最高，為63.06%；2齡幼蟲可培養內生細菌由腸球菌屬、葡萄球菌屬、動物球菌屬、沙雷氏菌屬和芽孢桿菌屬組成，其中腸球菌屬的相對豐度最高，為99.17%；3齡幼蟲腸道可培養內生細菌由腸球菌屬、葡萄球菌屬、動物球菌屬、沙雷氏菌屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、節桿菌屬、短桿菌屬、束村氏菌屬和微桿菌屬組成，其中腸球菌屬的相對豐度最高，為76.50%；4齡幼蟲腸道可培養內生細菌由腸球菌屬、葡萄球菌屬、沙雷氏菌屬、棒桿菌屬、節桿菌屬、勒克氏菌屬、擬諾卡氏菌屬、短桿菌屬、束村氏菌屬和不動桿菌屬組成，其中腸球菌屬的相對豐度最高，為93.87%；雌蛹腸道可培養內生細菌由腸球菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬組成，其中腸球菌屬的相對豐度最高，為79.81%；雄蛹腸道可培養內生細菌由腸球菌屬、沙雷氏菌屬、腸桿菌屬和農球菌屬組成，其中腸球菌屬的相對豐度最高，為66.26%；雌成蟲腸道可培養內生細菌由腸球菌屬、沙雷氏菌屬、短桿菌屬、檸檬球菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬組成，其中腸球菌屬的相對豐度最高，為71.93%；雄成蟲腸道可培養內生細菌由腸球菌屬、沙雷氏菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬組成，其中腸球菌屬的相對豐度最高，為95.03%（圖2-C）。

在種分類水平上，1齡幼蟲可培養內生細菌優勢菌種為路氏腸桿菌，相對豐度63.06%，次優勢菌種為蒙氏腸球菌，相對豐度36.04%。除1齡幼蟲外，卵、2～4齡幼蟲、雌蛹、雄蛹、雌成蟲和雄成蟲可培養內生細菌的優勢菌種均為蒙氏腸球菌，相對豐度分別為98.17%、99.17%、76.50%、93.87%、79.81%、66.26%、71.93%和95.03%，除蒙氏腸球菌在馬鈴薯塊莖蛾所有蟲態中穩定存在外，其次是深紅沙雷氏菌在3齡幼蟲、4齡幼蟲、雌雄蛹和雌雄成蟲中均存在，嗜甘氨酸棒桿菌（Corynebacterium glyciniphi-lum）和Arthrobacter woluwensis僅存在于3和4齡幼蟲腸道中，鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）僅存在于1齡幼蟲中，食奎尼酸沙雷氏菌（Serratia quinivorans）和南海芽孢桿菌（Bacillus australi-maris）僅存在于2齡幼蟲中，嗜氣芽孢桿菌（Bacillus aerophilus）、Tsukamurella ocularis、Microbacterium excoecariae和暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）僅存在于3齡幼蟲腸道中，皮特不動桿菌（Acineto-bacter pittii）、Tsukamurella conjunctivitidis、乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）和非脫羧勒克氏菌（Leclerciaadecarboxylata）僅存在于4齡幼蟲腸道中，羅根腸桿菌（Enterobacter quasiroggenkampii）僅存在于雌蛹腸道中，產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）和光神農球菌（Agrococcus baldri）僅存在于雄蛹腸道中，Citricoccus lacusdiani和神戶腸桿菌（Enterobacter kobei）僅存在于雌成蟲腸道中，阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）、阿氏腸桿菌（Enterobacter asburiae）和生癌腸桿菌（Enterobacter cancerogenus）僅存在于雄成蟲腸道中（圖2-D）。綜上表明，除1齡幼蟲可培養內生細菌優勢種為路氏腸桿菌外，其他蟲態的可培養內生細菌優勢種均為蒙氏腸球菌，并且蒙氏腸球菌在所有發育階段中均穩定存在，而深紅沙雷氏菌為馬鈴薯塊莖蛾腸道內的常駐菌。

2.5重飼喂內生細菌對馬鈴薯塊莖蛾幼蟲營養指標的影響

根據分離結果，選擇優勢菌路氏腸桿菌、蒙氏腸球菌及常駐菌深紅沙雷氏菌進行馬鈴薯塊莖蛾幼蟲重飼喂試驗。分別經CK、AT、EM、SR和EL飼喂處理后，馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的各項營養指標均存在顯著差異（Plt;0.05，下同）。CK的食物利用率顯著高于AT及各菌株處理，為32.52%，其次是AT和EM處理，SR和EL處理顯著低于CK和AT處理（圖3-A）。CK和AT處理的食物轉化率均顯著高于各菌株處理，分別為61.39%和53.07%（圖3-B）。CK的相對生長率顯著高于其他處理，為32.20 g/（g·d）（圖3-C）。CK的相對取食量與其他處理間無顯著差異（Pgt;0.05），其中SR和EL處理的相對取食量較高，分別為1.40和1.41 g/（g·d），且顯著高于AT和EM處理（圖3-D）。3株菌處理（EM、SR和EL）的近似消化率均高于CK和AT處理，且3株菌間差異不顯著，其中SR處理的近似消化率最高，為78.83%，顯著高于CK和AT處理（圖3-E）。

3討論

本研究通過傳統分離培養技術從馬鈴薯塊莖蛾卵、1～2齡幼蟲體內及3～4齡幼蟲、雌雄蛹、雌雄成蟲腸道中共分離得到3門13科17屬30種內生細菌，在1齡幼蟲可培養內生細菌中變形菌門為優勢菌門，其他發育階段的優勢菌門均為厚壁菌門，表明馬鈴薯塊莖蛾腸道細菌主要由變形菌門和厚壁菌門組成，與其他鱗翅目昆蟲的研究結果一致（Paniagua Voirol et al.，2018）。本研究結果顯示，腸桿菌科在1齡幼蟲可培養內生細菌中相對豐度最高，腸球菌科在卵、2～4齡幼蟲、雌雄蛹、雌雄成蟲可培養內生細菌中相對豐度最高。腸球菌和腸桿菌具有豐富的代謝途徑以適應腸道內的復雜環境，是鱗翅目昆蟲腸道內的核心微生物群（Shao et al.，2024），本研究也得到相同結果。常呂恕等（2023）對馬鈴薯塊莖蛾同科害蟲番茄潛葉蛾馬鈴薯種群3齡幼蟲腸道細菌進行分離培養，鑒定到5屬6種細菌，該5屬細菌在本研究3齡幼蟲中僅腸桿菌屬未分離到，且優勢種均為蒙氏腸球菌，表明取食相同食物的同科不同種害蟲腸道細菌高度相似。鄭亞強等（2017）對馬鈴薯塊莖蛾4齡幼蟲腸道細菌進行了分離培養，共鑒定到8屬10種細菌，分別為不動桿菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬、節桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、寡養單胞菌屬、束村氏菌屬和克雷白氏桿菌屬，而在本研究中4齡幼蟲腸道分離到10屬11種細菌，分離出的可培養細菌共同屬僅有不動桿菌屬、節桿菌屬、葡萄球菌屬和束村氏菌屬4屬；樊清艷等（2020）在取食馬鈴薯塊莖的馬鈴薯塊莖蛾幼蟲腸道中獲得可培養細菌10屬15種，與本研究分離到的共同屬為沙雷氏菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌和短桿菌屬5屬。以上結果出現的差異，可能是培養基不同、供試蟲體所處環境的溫濕度和光周期差異等原因造成。

本研究發現，不同發育階段馬鈴薯塊莖蛾的內生細菌組成結構存在差異，但優勢種較一致，除1齡幼蟲體內可培養內生細菌優勢種為路氏腸桿菌外，其他發育階段的可培養內生細菌優勢種均為蒙氏腸球菌，并且蒙氏腸球菌在所有發育階段中均穩定存在，其次為深紅沙雷氏菌，是馬鈴薯塊莖蛾腸道內的常駐菌。據報道，地中海粉螟（Ephestia kuehniella）腸道內共生蒙氏腸球菌能幫助宿主抵抗病原菌蘇云金芽孢桿菌（Grau et al.，2017），斜紋夜蛾（Spodop-tera litura）幼蟲腸道內共生蒙氏腸球菌能通過合成賴氨酸而促進宿主斜紋夜蛾幼蟲的生長發育（Mazumdar etal.，2021）。本研究發現馬鈴薯塊莖蛾幼蟲內生蒙氏腸球菌能通過提高馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的取食而促進其生長發育，但對于其促進取食的機理還有待深入探究。黏質沙雷氏菌（Serratia mar-cescens）是昆蟲體內共生菌的常見種類，能幫助宿主抵抗寄生蜂寄生的生物脅迫及高溫條件引起的非生物脅迫（劉艷紅等，2019），也可通過解毒作用而介導提高宿主對殺蟲劑的抗藥性（王俊峰，2020），同時對一些昆蟲還具有致病作用（馬曉燕等，2015；蘇造堂等，2020；袁梓涵等，2024）。沙雷氏菌作為馬鈴薯塊莖蛾體內常駐細菌，其功能也將是下一步深入研究的重要內容。

對幼蟲營養指標的測定能直接反映腸道微生物對宿主取食消化的影響，昆蟲腸道內生菌組成結構的變化能影響其宿主昆蟲的取食和生長（Xia et al.，2020；Lüet al.，2023）。樊清艷等（2021）研究發現，黏質沙雷氏菌、嗜鹽谷氨酸桿菌（Glutamicibacter halophytocola）、糞產堿菌（Alcaligenes faecalis）、琥珀葡萄球菌（Staphylococcus succinus）和阿氏腸桿菌能顯著提高馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的攝食量。本研究發現，蒙氏腸球菌、深紅沙雷氏菌和路氏腸桿菌均能明顯提高馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的近似消化率，深紅沙雷氏菌和路氏腸桿菌還能明顯提高馬鈴薯塊莖蛾的相對取食量，表明蒙氏腸球菌、深紅沙雷氏菌和路氏腸桿菌可通過提高馬鈴薯塊莖蛾的取食和消化來補償對食物的低利用率和低轉化率。然而，3株細菌如何協助宿主進行營養代謝以及在宿主體內是否具有協同作用和其他生理功能還有待進一步探究。

4結論

馬鈴薯塊莖蛾可培養內生細菌種類豐富，在整個生活史過程中可培養細菌種數存在顯著變化，馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段其可培養內生細菌組成及多樣性存在差異，其中從卵中分離到的可培養內生細菌種類數量最少，幼蟲可培養內生細菌種類最豐富，且隨著齡期的增加其可培養內生細菌數量逐漸增多，化蛹后開始下降。馬鈴薯塊莖蛾不同發育階段可培養內生細菌優勢種較一致，除1齡幼蟲優勢菌為路氏腸桿菌外，其他發育階段優勢種均為蒙氏腸球菌。內生細菌優勢種能通過促進幼蟲的消化而促進宿主的生長發育。

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（責任編輯：麻小燕）