意大利蜜蜂化學感受蛋白AmelCSP2序列分析及表達特性研究

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2025.01.025

摘要：【目的】探究意大利蜜蜂（Apis mellifera）化學感受蛋白CSP2（AmelCSP2）序列特征及AmelCSP2基因組織表達特性，為闡明AmelCSP2蛋白的生物學功能提供理論參考。【方法】利用ProtParam、ProtScal、SignalP-5.0、TMHMM-2.0、PSORTb 3.0.3、DictyOGlyc-1.1、NetNGlyc-1.0、NetPhos 3.1、SWISS-MODEL、CD-search、SMART和STRING等生物信息學軟件預測AmelCSP2蛋白理化性質、親/疏水性、信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位、O-糖基化位點、N-糖基化位點、磷酸化位點、高級結構、模體、結構域和蛋白互作網絡。采用實時熒光定量PCR檢測AmelCSP2基因在意大利蜜蜂觸角、頭（不含觸角）、胸、腹、足、翅中的相對表達量。【結果】AmelCSP2蛋白編碼117個氨基酸殘基，理論分子量約13.06 kD，理論等電點（pI）為9.27，分子脂肪系數為92.56，不穩定系數為59.68，平均親水性指數為-0.254，為兩性不穩定蛋白。AmelCSP2蛋白在第1～21位氨基酸殘基處有信號肽，不含跨膜結構域，主要定位于細胞周質、細胞質和細胞外膜。AmelCSP2蛋白不存在糖基化位點，但存在20個磷酸化位點。AmelCSP2蛋白二級結構中無規則卷曲占42.74%，α-螺旋占38.46%，延伸鏈占18.80%，蛋白三級結構較穩定。AmelCSP2蛋白屬于OS-D超家族，在第32～116位氨基酸殘基處存在唯一蛋白結構域OS-D。AmelCSP2蛋白可能與PYX2、ASP3、OBP3c、NT-7及OBP14蛋白存在相互作用。AmelCSP2基因在意大利蜜蜂的觸角、頭（不含觸角）、胸、腹、足、翅中均有表達，觸角中AmelCSP2基因相對表達量顯著高于其他組織（Plt;0.05）。【結論】AmelCSP2蛋白具有典型的OS-D超家族結構域，并含有多個磷酸化位點，可能通過磷酸化修飾調控其功能。AmelCSP2蛋白可能與PYX2、ASP3、OBP3c、NT-7及OBP14蛋白相互作用，參與化學感受信號傳導。AmelCSP2基因在意大利蜜蜂觸角中高表達，其可能在嗅覺感受系統中承擔氣味分子運輸功能。

關鍵詞：意大利蜜蜂；AmelCSP2蛋白；生物信息學；表達特性

中圖分類號：S893.3文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）01-0287-08

Sequence analysis and expression characteristics of chemosen?sory protein AmelCSP2 in Apis mellifera

ZHANG Yu1，SONG Yan-ting1，GUO Li-na1*，GUO Yuan2*

（1College of Animal Science，Shanxi Agricultural University，Jinzhong，Shanxi 030801，China；2College of Horticulture，Shanxi Agricultural University，Jinzhong，Shanxi 030801，China）

Abstract：【Objective】To explore the sequence characteristics of the chemosensory protein CSP2 of Apis mellifera（AmelCSP2）and the tissue expression characteristics of the AmelCSP2 gene，which could provide theoretical referencefor clarifying the biological function of AmelCSP2 protein.【Method】The physicochemical properties，hydrophilicity/hy-drophobicity，signal peptide，transmembrane domain，subcellular localization，O-glycosylation sites，N-glycosylationsites，phosphorylation sites，advanced structure，motif，domain and protein interaction network of AmelCSP2 protein were predicted by using bioinformatics softwares such as ProtParam，ProtScal，SignalP-5.0，TMHMM-2.0，PSORTb 3.0.3，DictyOGlyc-1.1，NetNGlyc-1.0，NetPhos 3.1，SWISS-MODEL，CD-search，SMART and STRING.The relative expression levels of AmelCSP2 gene in the antennae，head（excluding antennae），thorax，abdomen，leg and wing of A.mellifera were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】The AmelCSP2 protein encoded 117 amino acid residues，with a theoretical molecular weight of approximately 13.06 kD，a theoretical isoelectric point（pI）of 9.27，a molecular fat coefficient of 92.56，an instability coefficient of 59.68，and an average hydrophilicity index of-0.254，being an amphoteric and unstable protein.The AmelCSP2 protein had a signal peptide atamino acid residues positions 1-21，did not contain transmembrane domain，and was mainly located in the periplasm，cytoplasm and extracellular membrane.The AmelCSP2 protein had no glycosylation sites but had 20 phosphorylation sites.In the secondary structure of AmelCSP2 protein，random coils accounted for 42.74%，α-helices accounted for 38.46%，and extended chains accountedfor 18.80%，and the tertiary structure of the protein was relatively stable.The AmelCSP2 protein belonged to the OS-Dsuperfamily and had the only protein domain OS-D atamino acid residues positions 32-116.The AmelCSP2 protein mightinteract with PYX2，ASP3，OBP3c，NT-7 and OBP14 proteins.The AmelCSP2 gene was expressed in the antennae，head（excluding antennae），thorax，abdomen，leg and wing ofA.mellifera，and the relative expression level of the AmelCSP2 gene in the antennae was significantly higher than that in other tissues（Plt;0.05）.【Conclusion】AmelCSP2 protein has atypical OS-D superfamily domain and contains multiple phosphorylation sites，which may regulate its function through phosphorylation modification.AmelCSP2 protein may interact with PYX2，ASP3，OBP3c，NT-7 and OBP14 proteins and participate in chemical sensory signal transduction.AmelCSP2 gene is highly expressed in the antennae of A.mel-lifera，and may play the role of odor molecule transport in the olfactory perception system.

Key words：Apis mellifera；AmelCSP2 protein；bioinformatics；expression characteristics

Foundation items：National Key Research and Development Program of China（2022YFD1600201-3）；China Agri-culture Research System（CARS-44-KXJ2）；Shanxi University Science and Technology Innovation Project（2021L098）

0引言

【研究意義】意大利蜜蜂（Apis mellifera）作為社會性昆蟲，為適應采食、繁殖、防御和群體信息交流等復雜生命活動，進化出一套精密的嗅覺系統（Gonget al.，2008）。該系統主要依賴于觸角上的嗅覺感受器來識別環境中的信號分子。氣味結合蛋白（Odorant binding protein，OBP）和化學感受蛋白（Chemosensory protein，CSP）均為水溶性蛋白，在感受器淋巴液中負責選擇性地將氣味分子及其他化學刺激物傳遞至嗅覺受體（謝翠琴等，2016）。氣味分子穿過觸角微孔后，首先與OBP和CSP結合，形成氣味復合物，氣味復合物既可直接作用于嗅覺受體，也可釋放氣味分子后與受體結合，從而將化學信息轉化為電信號，經軸突傳遞至中樞神經系統（胡穎穎等，2013）。值得注意的是，與OBP相比，CSP對常見環境氣味分子的結合能力較低，而對信息傳遞相關的化學信號則展示出更高的特異性（杜亞麗等，2020）。因此，探究意大利蜜蜂CSP蛋白（AmelCSP）序列與表達特性，有助于揭示昆蟲與環境化學信息間的相互作用機制，對深入闡明意大利蜜蜂行為反應的分子基礎及AmelCSP蛋白在蜜蜂化學感受器中的作用機理具有重要意義。【前人研究進展】CSPs通常由100～120個氨基酸組成，具有4個高度保守的半胱氨酸殘基，分子量12～14 kD，其二級結構中常形成由相鄰半胱氨酸構成的二硫鍵（劉孝賀等，2020）。McKenna等（1994）、Pikielny等（1994）從黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）觸角中分離出可溶性蛋白OS-D和A-10，揭示了昆蟲CSPs基因的存在。此后，CSPs在雙翅目、膜翅目、鱗翅目等多個目、科、種的昆蟲中被廣泛鑒定，顯示出高度保守的序列和結構特征（Gu et al.，2012；Li et al.，2021；Wang et al.，2021）。此外，CSPs不僅在觸角、跗節、上顎須和下唇須等典型化學感受器中參與氣味識別，還存在于足、翅、胸部、信息素腺及復眼等非傳統感受器中，參與調控昆蟲發育、繁殖、營養物質運輸、降低殺蟲劑敏感性及群體分工等多種生理功能（Zhang et al.，2013；Li etal.，2015；Zhang et al.，2020；Agnihotrietal.，2021）。在棉鈴蟲中，CSP2能通過擴展其疏水性結合腔來結合和運輸大分子β-胡蘿卜素（劉金香等，2005）；而在綠盲蝽中，CSP2對棉鈴蟲抵抗昆蟲取食而釋放的次生代謝物表現出較高的親和力，提示其可能參與植物脅迫響應（周巧玲等，2021）。【本研究切入點】目前，AmelCSP的生化特性、生理功能、信號傳導及信息轉換機制尚未明確，特別是信息轉換與信號傳導過程的研究較少。【擬解決的關鍵問題】對AmelCSP2蛋白進行生物信息學分析，探究其理化性質、親/疏水性、信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位、糖基化位點、磷酸化位點等，并利用實時熒光定量PCR檢測AmelCSP2基因在意大利蜜蜂各組織中的相對表達量，以期為闡明AmelCSP2蛋白在意大利蜜蜂體內的化學感受機制提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試意大利蜜蜂由山西農業大學動物科學學院實驗蜂場提供，選取健康、群勢旺盛的蜂群，在巢門口采集足夠數量的采集蜂，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存備用。主要試劑：TRNzol Universal總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；TB Green?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒、PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒、無水乙醇、三氯甲烷、氯仿及異丙醇購自日本TaKaRa公司。主要儀器設備：高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、96孔熱循環儀（美國應用生物系統公司）、實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2試驗方法

1.2.1生物信息學分析從NCBI數據庫中檢索AmelCSP2基因推導氨基酸序列，利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預測AmelCSP2蛋白理化性質；使用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）預測AmelCSP2蛋白親/疏水性；采用Sig-nalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測AmelCSP2蛋白信號肽；使用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測AmelCSP2蛋白跨膜結構域；利用PSORTb 3.0.3（https：//www.psort.org/psortb/）預測AmelCSP2蛋白亞細胞定位；采用DictyOGlyc-1.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/DictyOGlyc-1.1/）預測Ame-lCSP2蛋白O-糖基化位點；使用NetNGlyc-1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預測AmelCSP2蛋白N-糖基化位點；采用NetPhos 3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）預測AmelCSP2蛋白磷酸化位點；利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）預測AmelCSP2蛋白三級結構；使用CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測AmelCSP2蛋白模體；采用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預測AmelCSP2蛋白結構域；利用STRING（https：//cn.string-db.org/）預測AmelCSP 2蛋白互作網絡。

1.2.2 RNA提取與實時熒光定量PCR樣品組織先利用液氮研磨破碎，利用TRIzol法提取各組織總RNA，并測定RNA濃度和純度。按照Prime-ScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒說明反轉錄合成cDNA。在NCBI數據庫中檢索獲得引物序列信息，利用Primer Premier 5.0設計熒光定量PCR引物（表1）。使用TB Green?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行實時熒光定量PCR。反應體系10.0μL：TB Green?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）5.0μL，上、下游引物各0.5μL，cDNA模板500 ng，ddH2O補足至10.0μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃5 s，57℃30 s，72℃30 s，進行40個循環。每個樣品設3個技術重復。采用2?ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3統計分析

試驗數據采用SPSS 27.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），使用GraphPad Prism 8.0.2制圖。2結果與分析

2.1 AmelCSP2蛋白理化性質預測結果

ProtParam預測結果顯示，AmelCSP2蛋白編碼117個氨基酸殘基，含20種氨基酸；理論分子量約13.06 kD，理論等電點（pI）為9.27，分子結構式為C569H941N167O169S7，原子總數1853；分子脂肪系數為92.56，不穩定系數為59.68，為不穩定蛋白。

2.2 AmelCSP2蛋白親/疏水性、信號肽、跨膜結構域與亞細胞定位預測結果

ProtScale預測結果（圖1-A）顯示，AmelCSP2蛋白平均親水性指數為-0.254，介于-0.5～0.5，為兩性蛋白。SignalP-5.0預測結果（圖1-B）顯示，AmelCSP2蛋白在第1～21位氨基酸殘基處有信號肽。TMHMM-2.0預測結果（圖1-C）顯示，AmelCSP2蛋白不含跨膜結構域。PSORTb 3.0.3預測結果顯示，AmelCSP2蛋白主要定位于細胞周質、細胞質和細胞外膜，得分分別為2.116、1.297和0.974，而細胞內膜與細胞外壁得分較低，分別為0.326與0.287。

2.3 AmelCSP2蛋白糖基化位點與磷酸化位點預測結果

DictyOGlyc-1.1和NetNGlyc-1.0預測結果（圖2-A和圖2-B）顯示，AmelCSP2蛋白不存在O-糖基化位點和N-糖基化位點。NetPhos 3.1預測結果（圖2-C）顯示，AmelCSP2蛋白共存在20個磷酸化位點，包括14個絲氨酸位點、4個蘇氨酸位點和2個酪氨酸位點。

2.4 AmelCSP2蛋白高級結構預測結果

蛋白二級結構預測結果（圖3-A）顯示，AmelCSP2蛋白二級結構中無規則卷曲占42.74%，“-螺旋占38.46%，延伸鏈占18.80%。蛋白三級結構預測結果如圖3-B所示，以空腸彎曲桿菌糖蛋白作為模板，模型相似度為80.00%，GMQE值為0.82，表明AmelCSP2蛋白三級結構預測結果可信。拉氏圖分析結果（圖3-C）顯示，模型構象均位于立體化學允許區域，進一步驗證了AmelCSP2蛋白三級結構的穩定性。

2.5 AmelCSP2蛋白模體與結構域預測結果

從NCBI數據庫下載AmelCSP2蛋白氨基酸序列，利用CD-search預測AmelCSP2蛋白模體，結果（圖4）顯示，AmelCSP2蛋白屬于OS-D超家族。SMART預測結果（圖5）顯示，AmelCSP2蛋白在第32～116位氨基酸殘基處存在唯一蛋白結構域，即OS-D蛋白結構域。

2.6 AmelCSP2蛋白互作網絡預測結果

STRING預測結果（圖6）顯示，AmelCSP2蛋白可能與多種蛋白發生相互作用，包括受體蛋白PYX2、特異蛋白ASP3、氣味結合蛋白OBP3c和OBP14與運輸蛋白NT-7，提示AmelCSP2在化學信號傳遞及相關生理過程中可能發揮多重作用。

2.7不同組織中AmelCSP2基因的表達特性

實時熒光定量PCR檢測結果（圖7）顯示，AmelCSP2基因在意大利蜜蜂的觸角、頭（不含觸角）、胸、腹、足、翅中均有表達，觸角中AmelCSP2基因相對表達量顯著高于其他組織（Plt;0.05）。提示AmelCSP2基因可能在觸角中承擔主要的化學感受功能。

3討論

本研究顯示，AmelCSP2蛋白編碼117個氨基酸殘基，理論分子量約13.06 kD，pI為9.27，分子脂肪系數為92.56，不穩定系數為59.68，平均親水性指數為-0.254，為兩性不穩定蛋白，其在第1～21位氨基酸殘基處有信號肽，不含跨膜結構域，主要定位于細胞周質、細胞質和細胞外膜，提示AmelCSP2可能為分泌蛋白，主要參與細胞構成及物質運輸，而非跨膜信號傳遞。蛋白翻譯后修飾在調控功能中具有關鍵作用，蛋白磷酸化有助于維持蛋白結構穩定和細胞間信號傳遞，蛋白糖基化則與特異性結合密切相關（王家紅等，2011；姜錚等，2009）。本研究顯示，AmelCSP2蛋白不存在N-糖基化位點和O-糖基化位點，但存在20個磷酸化位點，提示磷酸化可能在維持其結構穩定性及調控細胞間信號傳遞中發揮作用，而缺乏糖基化位點和跨膜結構域則表明AmelCSP2蛋白不具備直接特異性識別氣味分子的能力，也不參與免疫應答。

多肽鏈盤旋或折疊構成的蛋白質二級結構與蛋白穩定性直接相關，AmelCSP2蛋白主要由無規則卷曲（42.74%）、α-螺旋（38.46%）和延伸鏈（18.80%）構成，拉氏圖驗證了蛋白三級結構模型處于立體化學允許區域，表明AmelCSP2蛋白三級結構較穩定。AmelCSP2蛋白中大量的無規則卷曲，使其肽鏈從整體上呈球狀構象，α-螺旋結構也符合一般昆蟲CSPs蛋白特征（姚瑋宸等，2022）。蛋白中非極性氨基酸殘基的聚集有助于形成疏水性結合腔，使得AmelCSP2蛋白具有結合蛋白的典型特征，而極性氨基酸殘基分布于表面，使得意大利蜜蜂AmelCSP2蛋白有較強的水溶性，這種結構特征符合化學感受蛋白運輸脂溶性分子穿過淋巴液的功能需求（錢荷英和徐安英，2007；趙慧婷等，2012）。

昆蟲中高豐度表達并參與氣味分子轉運的OBPs，根據在嗅覺反應中結合的氣味分子不同，可分為性信息素結合蛋白（Pheromone binding protein，PBP）和普通氣味結合蛋白（General odorant binding protein，GOBP）（劉金香等，2005），其中PBP主要在雄性觸角中表達，具有專一性信息素結合功能（修偉明等，2005），其作用包括利用專一性過濾信息素分子、轉運脂溶性信息素分子、通過還原—氧化過程使信號分子失活、與樹突膜上受體偶聯并參與信號傳遞過程等（朱彬彬等，2005；張玉等，2019）。AmelCSP2蛋白雖也參與化學信號的運輸，但其缺乏糖基化位點和跨結構域，表明其不能通過與受體偶聯直接傳遞信號，而更側重于通過淋巴液運送氣味分子。CD-search和STRING預測結果進一步將AmelCSP2歸于OS-D超家族，并可能與PYX2、ASP3、OBP3c、NT-7與OBP14蛋白構成互作網絡，這為其在細胞間物質運輸中的協同奠定了基礎。

觸角是蜜蜂重要的感覺器官，嗅覺感知是大多數昆蟲進行個體辨別與定位食物來源的重要方式，蜜蜂嗅覺敏感度的差異與觸角的形態和電生理特性有關（Jung etal.，2014）。本研究顯示，AmelCSP2基因在意大利蜜蜂觸角、頭（不含觸角）、胸、腹、足、翅中均有表達，但觸角中AmelCSP2基因相對表達量顯著高于其他組織，進一步說明其在觸角中承擔主要的化學感受功能（Jianget al.，2024）。此外，AmelCSP2基因在意大利蜜蜂足部相對表達量也較高，可能反映該部位存在一定的化學感應器，為蜜蜂環境信息采集提供輔助（Forêt etal.，2007）。齊磊（2017）研究表明，AmelCSP2基因在采集蜂頭部和哺育蜂觸角中表達水平高于其他部位，進一步佐證了AmelCSP2基因在化學感受過程中的重要作用。

4結論

AmelCSP2蛋白具有典型的OS-D超家族結構域，并含有多個磷酸化位點，可能通過磷酸化修飾調控其功能。AmelCSP2蛋白可能與PYX2、ASP3、OBP3c、NT-7與OBP14蛋白相互作用，參與化學感受信號傳導。AmelCSP2基因在意大利蜜蜂觸角中高表達，其可能在嗅覺感受系統中承擔氣味分子運輸功能。

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（責任編輯：蘭宗寶，張博）