白斑狗魚(yú)LADD 2基因克隆及其組織表達(dá)特征分析

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2025.01.027

摘要：【目的】克隆白斑狗魚(yú)（Esox lucius）LADD 2基因并分析其組織表達(dá)特征，為揭示LADD 2基因在白斑狗魚(yú)性腺發(fā)育中的作用提供理論依據(jù)。【方法】利用白斑狗魚(yú)性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選得到126日齡雌性白斑狗魚(yú)高表達(dá)基因LADD 2。克隆LADD 2基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用DNAMAN 9.0、NCBI ORF finder、BLAST、ClustalX、ExPASy、ProtParam、PSORT II、SOMPA、SWISS-MODEL等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。基于魚(yú)類梯型凝集素同源物及C型凝集素受體的氨基酸序列，使用MEGA 5.1中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LADD 2基因在126日齡、188日齡和320日齡白斑狗魚(yú)性腺、腸道、肌肉、肝臟、鰓、腦、腎臟及頭腎中的相對(duì)表達(dá)量。【結(jié)果】成功克隆獲得白斑狗魚(yú)LADD 2基因CDS序列，全長(zhǎng)609 bp，編碼85個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為9.78 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為7.30，分子式為C8635H13504N2334O2404S115，為親水性蛋白。LDDA 2蛋白中亮氨酸（11.86%）含量最高，色氨酸（2.28%）含量最低。蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LADD 2蛋白含有147個(gè)絲氨酸位點(diǎn)，98個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)，44個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LADD 2蛋白主要由β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋和β-折疊構(gòu)成，存在2個(gè)保守的PRT1結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列同源比對(duì)分析結(jié)果顯示，白斑狗魚(yú)與阿拉斯加黑魚(yú)（Dallia pectoralis）LADD 2蛋白的相似性最高為99%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，白斑狗魚(yú)LADD 2蛋白與魚(yú)類梯型凝集素同源物聚為一支，與大西洋鮭（Salmo salar）、銀大麻哈魚(yú)（Oncorhynchuskisutch）及鯡形白鮭（Coregonus clupeaformis）的親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，隨著發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)，LADD 2基因在白斑狗魚(yú)卵巢中的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，與精巢中LADD 2基因相對(duì)表達(dá)量差異越來(lái)越小，且在鰓和腦中也有一定表達(dá)。【結(jié)論】LADD 2基因在進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性和穩(wěn)定性，其在白斑狗魚(yú)早期卵巢發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LADD 2蛋白可能在白斑狗魚(yú)發(fā)育后期鰓和腦中具有免疫活性。LADD 2蛋白可能具有免疫功能，進(jìn)而對(duì)白斑狗魚(yú)肝胰腺發(fā)育具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：白斑狗魚(yú)；LADD 2基因；梯型凝集素；組織表達(dá)特征

中圖分類號(hào)：S965.199文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2025）01-0305-09

Cloning and tissue expression characteristics analysis of LADD 2 gene in Esox lucius

LIU Yi1，WANG Shun-zhe1，LIU Ying-hui2，YANG Qian1，WANG Yong-chang3，SUN Hao-ran1，LI Sheng-zhong1，ZHANG Jun-jie1*

（1Xinjiang Key Laboratory for Ecological Adaptation and Evolution of Extreme Environment Biology/College of Life Scien-ces，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830000，China；2College of Animal Science，Xinjiang Agricul-tural University，Urumqi，Xinjiang 830052，China；3Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fishery Resources Application and Cultivation，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Guangzhou，Guangdong 510380，China）

Abstract：【Objective】To clone LADD 2 gene of Esox lucius and analyze its tissue expression characteristics，which could provide theoretical basis for revealing the role of LADD 2 gene in the gonadal development of E.lucius.【Method】Using the gonadal transcriptome data of E.lucius，the highly expressed gene LADD 2 in 126-day-old female E.lucius wasscreened.The coding region（CDS）sequence of LADD 2 gene was cloned，and bioinformatics analysis was performed using online tools such as DNAMAN 9.0，NCBI ORF finder，BLAST，ClustalX，ExPASy，ProtParam，PSORT II，SOMPA and SWISS-MODEL.Based on the amino acid sequences of fish ladder-type lectin homologs and C-type lectin re-ceptors，a phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining（NJ）method in MEGA 5.1.The relative expres-sion levels of LADD 2 gene in the gonads，intestines，muscles，liver，gills，brain，kidneys and head kidneys of E.lucius at 126，188，and 320 day-old were detected using real-time fluorescence quantitative PCR.【Result】The CDS sequence of LADD 2 gene in E.lucius was successfully cloned，with a total length of 609 bp，encoding 85 amino acids residues.The protein molecular weight was 9.78 kD，the theoretical isoelectric point（pI）was 7.30，and the molecular formula was C8635H13504N2334O2404S115，indicating a hydrophilic protein.The LADD 2 protein had the highest content of leucine（11.86%），and the lowest content of tryptophan（2.28%）.Phosphorylation site prediction showed that LADD 2 protein contained 147 serine sites，98 threonine sites and 44 tyrosine sites.Protein structure prediction revealed that LADD 2 pro-tein mainly consisted of random coilsβ-turns，α-helices andβ-folds，with 2 conserved PRT1 domains.Amino acid se-quence homology analysis showed that the similarity between the LADD 2 protein of E.lucius and that of Dalliapectora-lis was the highest at 99%.The phylogenetic tree indicated that LADD 2 protein of E.lucius clustered with fish ladder-type lectin homologs and was closely related to Salmo salar，Oncorhynchus kisutch and Coregonus clupeaformis.Real-time fluorescence quantitative PCR results showed that the relative expression of LADD 2 gene in the ovaries of E.lucius gradually decreased with developmental time，and the difference in relative expression between the ovaries and testes be-came smaller.Additionally，LADD 2 gene was expressed in the gills and brain.【Conclusion】The function of LADD 2 gene exhibits certain conservation and stability during evolution.LADD 2 protein may play an important role in the early ovarian development of E.lucius and may have immune activity in gills and brain during later developmental stages.LADD 2 protein may possess immune functions，thereby protecting the hepatopancreatic development of E.lucius.

Key words：Esox lucius；LADD 2 gene；ladder-type lectin；tissue expression characteristics

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32260915）；Xinjiang Natural Science Foundation（2022D01A66）

0引言

【研究意義】白斑狗魚(yú)（Esox lucius）隸屬于鮭形目（Salmoniformes）狗魚(yú)科（Esocidae）狗魚(yú)屬（Esox），主要分布于北半球高緯度地區(qū)，在我國(guó)僅見(jiàn)于新疆北部額爾齊斯河流域（李思發(fā)等，2004）。該物種體型較大（可達(dá)130 cm）、壽命較長(zhǎng)（約20年），為典型的兇猛肉食性魚(yú)類，是生態(tài)學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)研究的重要生物（Forsman et al.，2015）。雌性白斑狗魚(yú)的生長(zhǎng)速度快于雄魚(yú)，性成熟時(shí)間延后且體型更大，體現(xiàn)出明顯的性別二態(tài)性（Mei and Gui，2015）。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，利用性別控制技術(shù)實(shí)現(xiàn)單一性別養(yǎng)殖（全雄或全雌）已在全雄羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）（Beardmore etal.，2001）、全雄黃顙魚(yú)（Pelteobagrus fulvidraco）（Dan etal.，2013）、全雌翹嘴鱖（Siniperca chuatsi）（Liu et al.，2021）等魚(yú)種中獲得應(yīng)用。因此，深入解析白斑狗魚(yú)性別分化及調(diào)控機(jī)制，對(duì)提高其養(yǎng)殖效率及實(shí)現(xiàn)品種改良具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】性別分化作為生物界普遍存在且多樣化的現(xiàn)象，其調(diào)控機(jī)制具有多樣性和復(fù)雜性（Hayes，1998）。Pan等（2019）利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、功能敲除和過(guò)表達(dá)等手段，在白斑狗魚(yú)24號(hào)染色體上鑒定出雄性決定基因Amhby；唐露等（2020）、李菁等（2021，2023）、張俊杰等（2021）對(duì)魚(yú)類Foxl2、Dmrta1、StAR和Wnt4等性別相關(guān)基因進(jìn)行了克隆及組織表達(dá)分析，為闡明性別決定及分化的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。LADD 2蛋白是一種梯型凝集素，因在雌性中高表達(dá)而引起關(guān)注，梯型凝集素最早在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）中被發(fā)現(xiàn)，作為一種血漿蛋白，在非還原SDS-PAGE下呈現(xiàn)典型的階梯狀條帶（Jensen et al.，1997）。隨后，來(lái)自多種魚(yú)類的梯型凝集素同源物陸續(xù)被報(bào)道，其研究結(jié)果均表明該類蛋白在宿主免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Hoover et al.，1998；Russell et al.，2008；Magnadottir et al.，2019；Feng et al.，2022）。Russell（2008）研究表明，虹鱒中梯型凝集素被鑒定為VII組C型血漿蛋白，除存在于血漿中外，還表現(xiàn)出甘露糖特異性和鈣依賴性結(jié)合病原菌的能力；Magnadot-tir等（2019）研究表明，大西洋大比目魚(yú)（Hippoglos-sushippoglossus）中梯型凝集素同源物主要在參與黏膜免疫的組織中表達(dá)，與Feng等（2022）在雜交鯽魚(yú)（Carassius auratus）中發(fā)現(xiàn)的梯型凝集素在保護(hù)腸道完整性及增強(qiáng)抗菌感染中的作用相符。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)雌性和雄性白斑狗魚(yú)性腺轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)基因（DEGs），其中LADD 2基因是雌性和雄性白斑狗魚(yú)間高度差異表達(dá)的基因，但關(guān)于LADD 2基因在白斑狗魚(yú)性別分化及發(fā)育過(guò)程中的功能鮮見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】克隆白斑狗魚(yú)LADD 2基因cDNA序列，分析其序列同源性，預(yù)測(cè)其開(kāi)放閱讀框（ORF）及氨基酸序列，并構(gòu)建蛋白三維結(jié)構(gòu)模型。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LADD 2基因在白斑狗魚(yú)不同組織中的表達(dá)分布。為揭示LADD 2基因在雌性白斑狗魚(yú)性腺發(fā)育中的潛在功能及應(yīng)用基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)性別控制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試白斑狗魚(yú)仔魚(yú)購(gòu)自新疆北屯額爾齊斯河特種魚(yú)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室。選取126日齡、188日齡和320日齡雌性和雄性個(gè)體各3尾，取性腺、腸道、肌肉、肝臟、鰓、腦、腎臟及頭腎等組織，立即置于無(wú)菌凍存管中，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

TRIzol試劑和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

利用白斑狗魚(yú)性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選得到126日齡雌性白斑狗魚(yú)高表達(dá)基因LADD 2。采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 RNA提取及cDNA合成

各組織樣本在液氮中使用研缽充分研磨后溶解于DEPC水中，采用TRIzol法提取總RNA。利用Infinite?200 PRO酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA濃度，并采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Per‐fect Real Time）反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 LADD 2基因克隆

以雌性白斑狗魚(yú)性腺（卵巢）cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25.0μL：cDNA模板3.0μL，2×SanTaq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各1.0μL，ddH?O補(bǔ)足至25.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 LADD 2基因生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 9.0對(duì)測(cè)序獲得的cDNA序列進(jìn)行剪接；采用NCBI ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)LADD 2基因ORF；使用BLAST進(jìn)行氨基酸序列同源比對(duì)分析，并利用ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì)分析；利用ExPASy（https：//www.expasy.org）分析LADD 2蛋白結(jié)構(gòu)與功能；使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)；采用PSORT II（https：//psort.hgc.jp/form2.html）預(yù)測(cè)蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)；通過(guò)SOMPA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)LADD 2蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN 9.0進(jìn)行白斑狗魚(yú)與其他11種魚(yú)類［阿拉斯加黑魚(yú)（Dallia pectoralis）、美洲紅點(diǎn)鮭（Salvelinus fontinalis）、虹鱒、大西洋鮭（Salmo salar）、鯡形白鮭（Coregonus clupeaformis）、駝背大麻哈魚(yú)（Oncorhynchusgorbuscha）、紅大麻哈魚(yú)（On-corhynchus nerka）、大馬哈魚(yú)（Oncorhynchusketa）、北極嘉魚(yú)（Salvelinus alpinus）、銀大麻哈魚(yú)（Onco-rhynchuskisutch）］LADD 2蛋白氨基酸序列同源比對(duì)分析；基于魚(yú)類梯型凝集素同源物及C型凝集素受體（外群）的氨基酸序列，采用MEGA 5.1中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，以大西洋鮭魚(yú)、虹鱒和白斑狗魚(yú)C型凝集素受體序列為外群，通過(guò)自舉法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)取樣值設(shè)為1000。

1.7不同組織中LADD 2基因表達(dá)分析

利用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和SYBR Green I染料檢測(cè)LADD 2基因在126日齡、188日齡和320日齡雌性和雄性白斑狗魚(yú)腦、肌肉、腎臟、性腺、頭腎、鰓、腸道和肝臟中的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0μL：cDNA模板1.0μL，2×SuperReal PreMix Plus 10.0μL，上、下游引物各0.8μL，ddH?O 7.4μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)；95℃延伸30 s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以β-Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），并以LSD多重比較進(jìn)行組間差異分析。

2結(jié)果與分析

2.1白斑狗魚(yú)LADD 2基因克隆及序列特征分析結(jié)果克隆獲得白斑狗魚(yú)LADD 2基因編碼區(qū)（CDS）序列，全長(zhǎng)609 bp，編碼85個(gè)氨基酸殘基（圖1），蛋白分子量為9.78 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為7.30。

2.2白斑狗魚(yú)LADD 2蛋白理化性質(zhì)、互作網(wǎng)絡(luò)及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

蛋白氨基酸組成預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，LADD 2蛋白中亮氨酸（11.86%）含量最高，色氨酸（2.28%）含量最低，親水性氨基酸占52.10%，疏水性氨基酸占47.90%，分子式為C8635H13504N2334O2404S115。蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，LADD 2蛋白第0～10位氨基酸處有最大疏水值（3.70），第130～140位氨基酸處有最大親水值（-3.00），平均親水性指數(shù)為-0.15，為親水性蛋白。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果（圖4）表明，與LADD 2（LOC105007138）相似度達(dá)91.3的蛋白LOC105007136與LOC105026773、LOC105030280、LOC105008204、LOC105007111、LOC105006821、LOC105007110、LOC105026769、LOC105008205、ENSELUP00000036623和ENSELUP00000025954構(gòu)成了復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)。蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，LADD 2蛋白含有147個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、98個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)和44個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。

2.3白斑狗魚(yú)LADD 2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，LADD 2蛋白主要由β-轉(zhuǎn)角（23%）、α-螺旋（14%）、β-折疊（12%）構(gòu)成。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，LADD 2蛋白存在2個(gè)保守的PRT1結(jié)構(gòu)域。LADD 2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖8所示，藍(lán)色表示一致性大于70%，置信度高；紅色表示一致性小于50%，置信度低；紫色表示一致性為60%～70%，置信度適中。

2.4白斑狗魚(yú)LADD 2蛋白氨基酸序列同源比對(duì)分析與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

BLAST查詢白斑狗魚(yú)LADD 2基因編碼蛋白的同源序列，發(fā)現(xiàn)LADD 2基因僅存在于魚(yú)類中。蛋白氨基酸序列同源比對(duì)分析結(jié)果（圖9）顯示，白斑狗魚(yú)LADD 2蛋白與阿拉斯加黑魚(yú)、美洲紅點(diǎn)鮭、虹鱒、大西洋鮭、鯡形白鮭、駝背大麻哈魚(yú)、紅大麻哈魚(yú)、大馬哈魚(yú)、北極嘉魚(yú)、銀大麻哈魚(yú)LADD 2蛋白的同源性均較高，且都含有梯型凝集素同源物的特征，其中與阿拉斯加黑魚(yú)的相似性最高，為99%，提示LADD 2基因功能在進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性和穩(wěn)定性。基于魚(yú)類梯型凝集素同源物及C型凝集素受體的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖10所示，魚(yú)類梯型凝集素同源物聚為一支，白斑狗魚(yú)LADD 2蛋白也歸于此支，且與大西洋鮭、銀大麻哈魚(yú)及鯡形白鮭的親緣關(guān)系較近。

2.5白斑狗魚(yú)LADD 2基因組織表達(dá)分析結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在126日齡，LADD 2基因在雌性白斑狗魚(yú)肌肉中有少量表達(dá)，雌性白斑狗魚(yú)性腺（卵巢）LADD 2基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于雄性性腺（精巢）（Plt;0.01）（圖11）。在188日齡，LADD 2基因在雌性白斑狗魚(yú)鰓中有少量表達(dá)，卵巢LADD 2基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于精巢（Plt;0.05）（圖12）。在320日齡，LADD 2基因在雄性白斑狗魚(yú)腦中有表達(dá)，卵巢LADD 2基因相對(duì)表達(dá)量和精巢無(wú)顯著差異（Pgt;0.05）（圖13）。提示白斑狗魚(yú)卵巢中的LADD 2基因相對(duì)表達(dá)量隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。

3討論

凝集素是一類結(jié)構(gòu)多樣的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域，能特異性結(jié)合寡糖，參與多種生物識(shí)別過(guò)程（Sharon and Lis，1989）。盡管植物和微生物中的凝集素早已被發(fā)現(xiàn)，但直到1995年，動(dòng)物凝集素的普遍存在才被廣泛報(bào)道（Lis and Sharon，1991；Hughes，1992；Hirabayashi and Kasai，1993；Barondes et al.，1994a；Goldstein and Poretz，2012）。動(dòng)物凝集素家族包括C型凝集素、S型凝集素和P型凝集素（Drickamer，1988；Drickamer and Taylor，1993；Barondes et al.，1994b）。梯型凝集素是一種獨(dú)特的C型凝集素，迄今僅在硬骨魚(yú)中發(fā)現(xiàn)（Wang et al.，2022）。梯型凝集素在孵化后119～1050日齡的大西洋庸鰈（Atlantic Halibut）皮膚、鰓和腸道黏膜細(xì)胞中高表達(dá)，提示其可能在黏膜免疫防御中發(fā)揮作用，同時(shí)在肝臟、腎臟、骨髓和大腦中也有一定表達(dá)，表明其可能具有更廣泛的功能（Magnadottiretal.，2019；Junkunlo etal.，2020）。香魚(yú)（Plecoglossus altivelis）梯型凝集素樣基因（PaLL-like）具有免疫調(diào)節(jié)活性，是先天免疫的重要組成部分，具有預(yù)防細(xì)菌感染的作用（Wang et al.，2022）。大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）梯型凝集素基因在頭部、腎臟和鰓中表達(dá)量最高，具有先天性免疫功能，提示其可能在水蛭對(duì)細(xì)菌和寄生蟲(chóng)攻擊的先天免疫中發(fā)揮了重要作用（Tang et al.，2023）。提示梯型凝集素在魚(yú)類免疫防御中具有多重功能，可能通過(guò)不同的組織特異性表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)育時(shí)間延長(zhǎng)，LADD 2基因在白斑狗魚(yú)卵巢中的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，與精巢中LADD 2基因相對(duì)表達(dá)量差異越來(lái)越小，且在鰓和腦中也有一定表達(dá)，提示LADD 2基因在白斑狗魚(yú)早期卵巢發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可能在白斑狗魚(yú)發(fā)育后期鰓和腦中具有免疫活性。與魚(yú)類性別分化和免疫系統(tǒng)發(fā)育的研究相符，此外，魚(yú)類腦和鰓作為重要的免疫器官，其免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化可能反映了魚(yú)類在不同發(fā)育階段對(duì)環(huán)境壓力的適應(yīng)性（Fjelldalet al.，2007）。

魚(yú)類凝集素可通過(guò)糖脂、糖蛋白和蛋白聚糖識(shí)別并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，實(shí)現(xiàn)宿主—病原體互作和細(xì)胞間通訊（Ogawa et al.，2011）。Vasta等（2011）研究表明，硬骨魚(yú)類凝集素具有識(shí)別外源配體的功能，同時(shí)可能還具有其他功能，如作為抗凍蛋白和預(yù)防多精癥；Huang等（2013）研究表明，魚(yú)皮膚與病原體接觸時(shí)，會(huì)分泌黏液，作為保護(hù)性的機(jī)械和生化屏障，進(jìn)一步證實(shí)了凝集素在魚(yú)類黏膜免疫中的重要作用；Kumar等（2018）研究表明，魚(yú)類凝集素能識(shí)別病毒表面的糖蛋白，抑制病毒的感染，揭示了魚(yú)類凝集素在抗病毒免疫中的作用。

蘇氨酸是魚(yú)類生長(zhǎng)不可或缺的氨基酸，其在免疫反應(yīng)中的作用也與蘇氨酸缺陷病中所報(bào)道的一致（Li etal.，1999）。蘇氨酸能通過(guò)增加酶的抗氧化能力來(lái)改善鈍吻鯛（Bluntnose snapper）的抗氧化防御系統(tǒng)，從而保護(hù)肝胰腺的結(jié)構(gòu)和功能（Habte-Tsionet al.，2016）。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LADD 2蛋白具有98個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)，推測(cè)LADD 2蛋白可能具有免疫功能，或?qū)Π装吖肤~(yú)肝胰腺發(fā)育具有一定保護(hù)作用。與近年來(lái)對(duì)氨基酸代謝與免疫系統(tǒng)關(guān)系的研究趨勢(shì)一致，蘇氨酸不僅是蛋白質(zhì)合成的必需氨基酸，還通過(guò)其代謝產(chǎn)物參與免疫調(diào)節(jié)（Koo and Noh，2007）。因此，LADD 2蛋白的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)可能為其免疫功能提供了分子基礎(chǔ)。

同一基因在不同生物體、不同組織和不同發(fā)育時(shí)期可能具有不同功能，這種多功能性為魚(yú)類提供了更強(qiáng)的適應(yīng)能力，使其能在復(fù)雜的自然環(huán)境中生存繁衍（Epstein and Beckwith，1968）。在丁鱥（Tincatinca）中，凝集素在其早期卵黃前卵母細(xì)胞的外周細(xì)胞質(zhì)中第一個(gè)皮質(zhì)囊泡出現(xiàn)后不久被檢測(cè)到，而在其血清中的凝集素也為先天免疫的C型凝集素補(bǔ)體提供了途徑（Nosek et al.，1983），提示凝集素在魚(yú)類生殖和免疫系統(tǒng)中具有雙重功能。虹鱒中STL2和STL3凝集素僅在卵巢中發(fā)現(xiàn)，且其含量在孵化后立即急劇下降，并在魚(yú)卵中具有不同功能（Tateno et al.，2001），表明凝集素在魚(yú)類生殖和免疫系統(tǒng)中具有多功能性。本研究結(jié)果表明，LADD 2基因可能對(duì)白斑狗魚(yú)早期性別分化起一定作用，并在腦、鰓中具有一定功能，后續(xù)可結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)深入探究LADD 2基因在魚(yú)類性別分化和免疫應(yīng)答中的分子機(jī)制，或通過(guò)比較不同魚(yú)類凝集素的功能差異，揭示其在進(jìn)化過(guò)程中的適應(yīng)性變化。

4結(jié)論

LADD 2基因在進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性和穩(wěn)定性，其在白斑狗魚(yú)早期卵巢發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。LADD 2蛋白可能在白斑狗魚(yú)發(fā)育后期鰓和腦中具有免疫活性。LADD 2蛋白可能具有免疫功能，進(jìn)而對(duì)白斑狗魚(yú)肝胰腺發(fā)育具有保護(hù)作用。

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（責(zé)任編輯：蘭宗寶，張博）