熱帶睡蓮藍鳥瓶插過程中彎莖生理變化及轉(zhuǎn)錄組分析

摘要：【目的】探究藍鳥睡蓮切花在瓶插過程中的花莖生理變化并進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，為揭示睡蓮在瓶插過程中花莖彎曲的分子機制及培育抗莖稈彎曲睡蓮品種提供理論依據(jù)。【方法】以藍鳥睡蓮為試驗材料進行切花瓶插，每天固定時間測定瓶插睡蓮的生理指標(biāo)，根據(jù)睡蓮彎莖程度分為4個時期，截取花莖4個時期彎莖樣本（分別標(biāo)記為Dor-sal_1、Dorsal_2、Dorsal_3和Dorsal_4），測定不同樣本中可溶性糖和淀粉含量，基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選差異表達基因（DEG），對DEGs進行GO功能注釋分析、KEGG信號通路富集分析和K-means分析，挖掘?qū)е滤徢谢◤澢o的關(guān)鍵代謝通路及關(guān)鍵基因，并通過實時熒光定量PCR驗證基因相對表達量與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的一致性。【結(jié)果】睡蓮的吸水量、失水量、水分平衡值均呈先上升后下降的變化趨勢，睡蓮花莖的平均伸長量為4.45 cm，占原始長度的17.8%。Dorsal_1和Dorsal_2樣本中淀粉含量無顯著差異（Pgt;0.05），但二者均顯著高于Dorsal_3和Dorsal_4（Plt;0.05，下同），且Dorsal_3樣本中淀粉含量顯著高于Dorsal_4。Dorsal_1 vs Dorsal_2組、Dorsal_1 vs Dorsal_3組、Dorsal_1 vs Dorsal_4組、Dorsal_2 vs Dorsal_3組、Dorsal_3 vs Dorsal_4組DEGs數(shù)分別為5149、6903、5483、2456和269個，其中下調(diào)表達基因分別為2826、3822、3068、1313和113個，上調(diào)表達基因分別為2323、3081、2415、1143和156個。4個不同彎莖時期樣本間共有112個DEGs。GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，睡蓮彎莖中DEGs主要富集在與光合作用、細胞壁合成和植物激素與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的生物途徑中。K-means分析結(jié)果顯示，DEGs被聚類為9類（Class 1～Class 9），通過Class 1與Venn圖共篩選出25個DEGs，Class 5篩選到19個調(diào)控睡蓮彎莖相關(guān)基因。實時熒光定量PCR驗證結(jié)果顯示，DEGs相對表達量與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基因表達基本一致。【結(jié)論】水分、淀粉和可溶性糖含量以及光照響應(yīng)、植物激素、細胞壁形成與分解等因素的相互作用共同導(dǎo)致睡蓮彎莖。推測與生長素及細胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因是影響睡蓮彎莖的關(guān)鍵基因群。

關(guān)鍵詞：熱帶睡蓮；彎莖；生理指標(biāo)；轉(zhuǎn)錄組；DEGs

中圖分類號：S682.32文獻標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0355-13

Physiological changes and transcriptome analysis of stem bending in tropical Nymphaea‘Blue Bird’during vase life

LIN Xiu-ya，LI Ting-ge，LI Mei-er，WANG Jian*

（College of Tropical Agriculture and Forestry，Hainan University/Key Laboratory of Germplasm Resources Biology ofTropical Special Ornamental Plants of Hainan/Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of TropicalForest Trees and Ornamental Plants，Ministry of Education，Haikou，Hainan 570228，China）

Abstract：【Objective】To investigate the physiological changes and transcriptome sequencing in the stems of Nym-phaea‘Blue Bird’cut flowers during vase life，which could elucidate the molecular mechanisms underlying stem ben-ding during vase life and provide theoretical reference for breeding water lily varieties resistant to stem bending.【Method】Cut flowers of Nymphaea‘Blue Bird’were subjected to vase-holding experiments.Physiological parameters were mea-sured daily at fixed intervals.Based on bending severity of water lily，stems were categorized into 4 developmental pe-riods（designated as Dorsal_1，Dorsal_2，Dorsal_3 and Dorsal_4）.Soluble sugar and starch contents were detected in dif-ferent samples.Transcriptome sequencing was performed to screen differentially expressed genes（DEGs）.GO functional annotation analysis，KEGG signaling pathway enrichment analysis and K-means analysis were performed on DEGs to explore the key metabolic pathways and key genes that led to the stem bending of cut water lily.Quantitative real-time fluorescence quantitative PCR validated the consistency between gene relative expression and transcriptome data.【Result】Water absorption，water loss and water balance value exhibited an initial increase followed by a decline.The average stem elongation was 4.45 cm，accounting for 17.8%of original length.Starch content showed no significant difference between Dorsal_1 and Dorsal_2（Pgt;0.05），but both were significantly higher than Dorsal_3 and Dorsal_4（Plt;0.05，the same be-low），the starch content of Dorsal_3 samples was significantly higher than that of Dorsal_4.The numbers of DEGs in Dor-sal_1 vs Dorsal_2 group，Dorsal_1 vs Dorsal_3 group，Dorsal_1 vs Dorsal_4 group，Dorsal_2 vs Dorsal_3 group，Dor-sal_3 vs Dorsal_4 group were 5149，6903，5483，2456 and 269，in which down-regulated genes nembers were 2826，3822，3068，1313 and 113，up-regulated genes numbers were 2323，3081，2415，1143 and 156 respectively.There were 112 shared DEGs in samples of 4 different stem bending periods.GO functional annotation and KEGG signaling pathway enrichment analysis showed that DEGs in stem bending water lily was mainly enriched in biological pathways related to photosynthesis，cell wall synthesis，plant hormones and signal transduction.The results of K-means analysis showed that DEGs were clustered into 9 classes（Class 1-Class 9），25 DEGs were screened by Class 1 and Venn diagram，and 19 genes related to the regulation of water lily stem bending were screened by Class 5.The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the relative expression of DEGs was basically consistent with the transcriptome data.【Con-clusion】The bending of water lily stems arises from the synergistic interactions among multiple factors，including water，starch and soluble sugar contents，light responsiveness，phytohormones，cell wall biosynthesis and degradation.It is hypothesized that auxin related genes and cell wall structural related genes form critical gene clusters responsible for regu-latingstem bending of water lily.

Key words：tropical water lily；stem bending；physiological indicators；transcriptome；DEGs

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32160719，32060365）；Haikou Key Science and Technology Innovation Project（2022-013）

0引言

【研究意義】睡蓮為隸屬于睡蓮科（Nymphaea-ceae）睡蓮屬（Nymphaea）的多年生水生草本植物，因其晝開夜合的特性而得名，又稱水浮蓮和子午蓮（Agnihotri etal.，2008）。在廣義分類上，睡蓮包含3個科近100個種，即莼菜科（Cabombaceae）、獨蕊草科（Hydatellaceae）及睡蓮科（Nymphaeaceae），而在狹義上，僅指睡蓮科睡蓮屬中5個亞屬的70多個物種（Pareek and Kumar，2016）。睡蓮因豐富的花色、優(yōu)美的姿態(tài)深受人們喜愛，在多個國家的宗教文化中象征著神圣、莊嚴(yán)和純潔。睡蓮也是泰國、孟加拉國和埃及的國花。作為一種古老的植物，睡蓮的化石記錄顯示其在地球上的存在可追溯至1億年前（倪學(xué)明等，1995；Friis et al.，2001；索志立，2006）。睡蓮藍鳥是一種熱帶睡蓮，因其花色鮮艷、形態(tài)優(yōu)美、植株生長迅速、繁殖能力強和產(chǎn)量高等優(yōu)點被引入熱帶地區(qū)作為特色經(jīng)濟花卉和鮮切花品種。但是在瓶插過程中，睡蓮藍鳥的花期較短，且莖稈易彎曲，嚴(yán)重影響其觀賞性。因此，深入研究睡蓮在瓶插過程中花莖彎曲的分子機制，對于提升睡蓮產(chǎn)業(yè)的競爭力和市場價值具有重要的理論及實踐意義。【前人研究進展】植物莖彎曲涉及復(fù)雜的基因分子遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，多項研究已提出多個可能影響莖彎曲的因素。Zhao等（2012）通過研究芍藥（Paeonia lacti-flora Pall.）花序莖的機械強度、形態(tài)指標(biāo)和顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)纖維素與花序莖的機械強度無明顯相關(guān)，而木質(zhì)素則對其有顯著影響，并發(fā)現(xiàn)基因PlPAL和PlCCoAOMT可在基因工程中用于提高芍藥花序莖的機械強度。Ge等（2019）研究發(fā)現(xiàn)切花非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）的莖彎曲可能由水分脅迫和脫落酸（ABA）調(diào)節(jié)引起，且這一過程可能不需要依賴乙烯。Wan等（2020）研究發(fā)現(xiàn)在芍藥彎曲初期（S3期），木髓中的木質(zhì)素、半纖維素和可溶性糖含量、厚壁組織和木質(zhì)部面積以及細胞壁增厚均存在顯著差異，并通過WGCNA鑒定了參與木質(zhì)素、纖維素和木聚糖生物合成的hub基因以及調(diào)控這些代謝過程的轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果顯示提供細胞壁剛性的化合物含量是影響芍藥花序莖直度的重要因素。Li等（2023）通過對睡蓮彎莖背腹部進行轉(zhuǎn)錄組及激素組代謝比較，結(jié)果表明彎莖受光照不均、重力、機械強度及激素等多種因素影響。Ren等（2024）進一步揭示了芍藥莖稈直立性受纖維素和其他細胞壁材料影響，且觀察到直立品種和彎曲品種間吲哚乙酸（IAA）的含量有差異。Zhao等（2024）通過比較非洲菊、荷花（Nelumbo nucifera）、睡蓮等植物切花直立莖與彎莖，發(fā)現(xiàn)彎莖機械性能和細胞壁強度降低，彎莖中的細胞變得更加松散，細胞壁厚度減少。【本研究切入點】莖稈彎曲與木質(zhì)素、纖維素、生長激素等均有關(guān)，可能受復(fù)合多元因素的影響，調(diào)控機理較為復(fù)雜，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以全面、完整地展現(xiàn)睡蓮切花彎莖過程中諸多基因及其代謝通路的變化情況，有利于挖掘影響切花彎莖的主要基因和機制，但目前有關(guān)熱帶睡蓮藍鳥在整個瓶插過程中莖稈彎曲的轉(zhuǎn)錄組分析鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以熱帶睡蓮藍鳥為試驗材料，采集瓶插過程中4個不同彎莖時期的花莖，測定其生理指標(biāo)并進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，探究睡蓮藍鳥在瓶插過程中的植物生理變化，對其進行GO功能注釋及KEGG信號通路富集分析，篩選影響睡蓮藍鳥切花彎莖的關(guān)鍵代謝通路，挖掘影響彎莖的相關(guān)基因，為揭示睡蓮在瓶插過程中花莖彎曲的分子機制及培育抗莖稈彎曲睡蓮品種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用的藍鳥睡蓮（Nymphaea‘Blue Bird’）采自海南省海口市大致坡大道湖，大田種植，水深約50 cm。每天早晨定時在湖中采摘第1 d開放的睡蓮為研究對象，采摘后將其放入清水中運回備用。將采摘的睡蓮統(tǒng)一裁切成花莖為25 cm的鮮切花，將其置入同樣高度為22 cm、容量550 mL的礦泉水瓶中，每瓶瓶插1支切花，在室溫25℃，光照周期為12h/12 h（晝/夜），光照強度2000～3000 lx的室內(nèi)環(huán)境中培養(yǎng)。按照彎莖程度分為4個時期：Dorsal_1期為直立狀態(tài)，Dorsal_2期稍微彎曲，Dorsal_3期明顯彎曲，Dor-sal_4期嚴(yán)重彎曲（圖1）。

主要試劑：植物可溶性糖試劑盒（A145-1-1）和淀粉含量試劑盒（A48-1-1）購自南京建成生物工程研究所有限公司。多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2試驗方法

1.2.1樣本采集Dorsal_1期以花下7.5 cm花莖處為中心點，上、下各1.5 cm將其用手術(shù)刀平切下；Dorsal_2期、Dorsal_3期、Dorsal_4期彎曲后以花莖實際彎曲點為中心，每時期用手術(shù)刀取上、下各1.5 cm莖。將花莖切成厚度約0.1 cm的薄片混勻裝入離心管中，迅速放入液氮中速凍3～5 min，隨后放至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩orsal_1期～Dorsal_4期樣本分別標(biāo)記為Dorsal_1、Dorsal_2、Dorsal_3和Dorsal_4。

1.2.2生理指標(biāo)測定對瓶插的藍鳥睡蓮于每天固定時間（上午9：00—11：00）使用電子天平稱重，使用直尺測量睡蓮花莖長度。設(shè)3個重復(fù)，連續(xù)測定5 d。通過公式計算睡蓮花莖吸水量、花莖失水量、水分平衡值和伸長量，計算公式如下：

花莖吸水量（g）=（當(dāng)天水瓶重量+當(dāng)天溶液重量）-（后一天水瓶重量+后一天溶液重量）

花莖失水量（g）=（當(dāng)天水瓶重量+當(dāng)天溶液重量+當(dāng)天切花重量）-（后一天水瓶重量+后一天溶液重量+后一天切花重量）

水分平衡值（g）=當(dāng)天睡蓮切花的吸水量-當(dāng)天睡蓮切花失水量

伸長量（cm）=當(dāng)天睡蓮花莖長度-前一天睡蓮花莖長度

1.2.3可溶性糖及淀粉含量測定參照植物可溶性糖試劑盒（A145-1-1）及淀粉含量試劑盒（A48-1-1）說明書測定4個藍鳥睡蓮彎莖時期樣本中可溶性糖和淀粉含量，每處理3個重復(fù)。

1.2.4 cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序樣本的總RNA提取和質(zhì)檢、cDNA文庫構(gòu)建和質(zhì)檢以及轉(zhuǎn)錄組測序等工作均由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。使用fastpv0.19.3過濾原始數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量的Reads為有效序列（Clean reads）。從NCBI下載侏儒盧旺達睡蓮參考基因組［Nymphaea thermarum（ID 508901）-BioProject-NCBI（nih.gov）］及其注釋文件，使用HISAT v2.1.0構(gòu)建索引，將Clean reads比對到侏儒盧旺達睡蓮參考基因組。采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達水平的指標(biāo)。使用DESeq2 v 1.22.1進行兩兩組間的差異表達分析，以∣log2 Fold Change∣gt;1且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）lt;0.05為閾值篩選差異表達基因（DEG）。將篩選得到的DEGs進行GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析。將所有DEGs并集的FPKM使用R語言的scale函數(shù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用K-means進行聚類分析。

1.2.5 DEGs實時熒光定量PCR驗證在DEGs中隨機選取8個參與植物激素信號傳導(dǎo)、光合、重力響應(yīng)、細胞壁合成等相關(guān)代謝的基因，采用實時熒光定量PCR檢驗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。使用Primer Premier 5.0設(shè)計引物（表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。利用X960熒光定量PCR儀（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）進行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系10.0μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5.0μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.2μL，cDNA模板1.0μL，RNase free ddH2O 3.6μL。擴增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃10 s，60℃30 s，進行40個循環(huán)。以β-Actin為內(nèi)參基因（盛玉輝，2020），目的基因的相對表達量計算使用2-ΔΔCt法，設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3統(tǒng)計分析

利用SPSS 27.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Duncan’s法進行多重比較，采用GraphPad Prism 8.0.2進行繪圖。

2結(jié)果與分析

2.1瓶插睡蓮生理指標(biāo)分析結(jié)果

如圖2所示，睡蓮的花莖吸水量、花莖失水量和水分平衡值均呈先增加后減少的變化趨勢，3個生理指標(biāo)的峰值均出現(xiàn)在花期第3 d（Dorsal_2期），隨后隨著瓶插天數(shù)的增加均逐漸降低。在瓶插過程中，花莖吸水量和花莖失水量最小值均出現(xiàn)在花期末，即瓶插第5 d（Dorsal_4期），而水分平衡值在睡蓮瓶插第1 d（Dorsal_1期）即為負值（-0.44 g），瓶插第4 d（Dorsal_3期）和第5 d均為負值，表明此時花莖失水量大于花莖吸水量，且隨著瓶插時間的延長，睡蓮體內(nèi)水分平衡值失衡，花瓣開放程度降低，直至無法開放。睡蓮在瓶插過程中花莖仍持續(xù)伸長，但隨著瓶插時間的增加，伸長量逐漸減少，伸長速度最快的時期為瓶插第1 d至第2d。在整個瓶插過程中，睡蓮花莖的平均伸長量為4.45 cm，占原始長度的17.8%。切花睡蓮瓶插過程中水分平衡值下降快，且花莖明顯伸長，說明其對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的需求較高。

2.2 4個時期睡蓮樣本中可溶性糖及淀粉含量變化

如圖3所示，在4個時期睡蓮樣本中可溶性糖含量和淀粉含量均呈先增加后減少的變化趨勢，其峰值均出現(xiàn)在瓶插彎莖的Dorsal_2期，均在Dorsal_4期達到最低值。睡蓮在瓶插彎莖過程中，不同時期樣本間可溶性糖含量均存在顯著差異（Plt;0.05，下同）。Dorsal_1期和Dorsal_2期樣本中淀粉含量無顯著差異（Pgt;0.05），二者樣本中淀粉含量均顯著高于Dorsal_3期和Dorsal_4期，Dorsal_3期樣本中淀粉含量顯著高于Dorsal_4期。

2.3轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量分析結(jié)果

對藍鳥睡蓮瓶插過程中4個時期的花莖樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得78.7 Gb的Clean data，每個樣本的Clean data均達到6.1 Gb，Q20≥97%，Q30≥93%，GC含量≥47%，說明測序質(zhì)量良好，可滿足后續(xù)分析需求。

2.4數(shù)據(jù)組裝及轉(zhuǎn)錄本比對率統(tǒng)計

利用Trinity軟件對Clean data進行組裝。4組樣本中能定位到參考基因組上的Clean reads分別約有30864298、31294812、32283627和31815641條，占比分別為74.30%、70.51%、72.73%和71.37%；唯一比對上參考基因組的Clean reads數(shù)分別約為30389571、31706679、30527141和31717303條，占比分別為73.45%、71.2%、73.06%和71.79%。

2.5 DEGs篩選分析結(jié)果

以∣log2 Fold Change∣gt;1且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）lt;0.05為閾值篩選DEGs，結(jié)果如圖4所示。Dorsal_1 vs Dorsal_2組共有5149個DEGs，其中2826個表達下調(diào)，2323個表達上調(diào)；Dorsal_1 vs Dorsal_3組共有6903個DEGs，其中3822個表達下調(diào)，3081個表達上調(diào)。Dorsal_1 vs Dorsal_4組共有5483個DEGs，其中3068個表達下調(diào)，2415個表達上調(diào)；Dorsal_2 vs Dorsal_3組共有2456個DEGs，其中1313個表達下調(diào)，1143個表達上調(diào)；Dorsal_3 vs Dorsal_4組共有269個DEGs，其中156個表達上調(diào)，113個表達下調(diào)。DEGs較多的3個組（Dorsal_1 vs Dorsal_2組、Dor-sal_2 vs Dorsal_3組、Dorsal_3 vs Dorsal_4組）共有112個DEGs。

2.6 DEGs的GO功能注釋分析結(jié)果

在GO數(shù)據(jù)庫中對睡蓮4個彎曲時期的花莖樣本中篩選得到的DEGs進行GO功能注釋分析，結(jié)果由圖5可知，Dorsal_1 vs Dorsal_2組主要注釋到光合作用（Photosynthesis，GO：0015979）、光收集（Photo-synthesis，light harvesting，GO：0009765）、光反應(yīng)（Photosynthesis，light reaction，GO：0019684）和木葡聚糖代謝過程（Xyloglucan metabolic process，GO：0010411）等GO功能條目（圖5-A），說明在瓶插初期，睡蓮對光照的變化十分敏感。Dorsal_1 vs Dorsa_3組主要注釋在細胞多糖代謝過程（Cellular polysac-charide metabolic process，GO：0044264）、α-氨基酸代謝過程（Alpha-amino acid metabolic process，GO：1901605）和細胞葡聚糖代謝過程（Cellular glucan metabolic process，GO：0006073）等GO功能條目（圖5-B）。Dorsal_1 vs Dorsal_4組主要注釋在細胞多糖代謝過程（Cellular polysaccharide metabolic process，GO：0044264），光合作用（Photosynthesis，GO：0015979）、細胞葡聚糖代謝過程（Cellular glucan metabolic process，GO：0006073）等GO功能條目（圖5-C）。

Dorsal_2 vs Dorsal_3組主要注釋到木葡聚糖代謝過程（Xyloglucan metabolic process，GO：0010411）、生長素激活的信號通路（Auxin-activated signaling pathway，GO：0009734）和細胞對生長素刺激的反應(yīng)（Cellular response to auxin stimulus，GO：0071365）等GO功能條目（圖5-D）。Dorsal_3 vs Dorsal_4組主要注釋到氨基聚糖分解代謝過程（Aminoglycan cata-bolic process，GO：0006026）、甲殼素代謝過程（Chitin metabolic process，GO：0006030）和幾丁質(zhì)分解代謝過程（Chitin catabolic process，GO：0006032）等GO功能條目，反映了生長素等對花莖彎曲的影響。

2.7 DEGs的KEGG信號通路富集分析結(jié)果

為進一步解析睡蓮瓶插過程中莖稈彎曲的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對DEGs進行KEGG信號通路富集分析，在Dorsal_1 vs Dorsal_2組、Dorsal_1 vs Dorsal_3組、Dorsal_1 vs Dorsal_4組、Dorsal_2 vs Dorsal_3組和Dorsal_3 vs Dorsal_4組中分別注釋到138、140、138、125、66條信號通路。Dorsal_1 vs Dorsal_2組、Dorsal_1 vs Dorsal_3組、Dorsal_1 vs Dorsal_4組均顯著富集在光合作用—天線蛋白（Photosynthesis-antenna pro-teins），光合作用（Photosynthesis）和脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis）等信號通路上，其中脂肪酸生物合成、脂肪酸代謝在比較組中富集程度均較高，說明光照相關(guān)基因及脂肪酸合成代謝相關(guān)基因與睡蓮發(fā)生彎莖密切相關(guān)（圖6-A、圖6-B和圖6-C）。在Dorsal_2 vs Dorsal_3組中，DEGs顯著富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、MAPK信號通路—植物（MAPK signaling pathway-plant）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）信號通路上（圖6-D）。在Dorsal_3 vs Dorsal_4組中，DEGs顯著富集在維生素B6代謝（Vitamin B6 metabolism）和苯丙烷類生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）信號通路上（圖6-E）。在5個比較組中，DEGs集中富集在光合作用—天線蛋白、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等信號通路中，表明光照環(huán)境及植物激素在睡蓮花莖彎曲過程中具有重要調(diào)控作用。

2.8影響睡蓮彎莖的關(guān)鍵DEGs篩選

通過對睡蓮4個彎莖時期的DEGs進行K-means分析結(jié)果，DEGs被聚類為9類（Class 1～Class 9）。其中Class 1呈在Dorsal_1期高表達在其他時期低表達的特征，與Dorsal_1期花莖直立，而其他3個時期花莖均彎曲的表型相一致，因此Class 1與其他3個時期的DEGs更多地體現(xiàn)了與直立相關(guān)的DEGs，Class 1共聚類了2384個DEGs，將其與Dorsal_1 vs Dorsal_2組、Dorsal_2 vs Dorsal_3組、Dorsal_3 vs Dorsal_4組的Venn圖進行交叉篩選（圖7-A），共篩選出25個基因，主要涉及細胞壁結(jié)構(gòu)基因，其中果膠酯酶基因PME3和PME18，多聚半乳糖醛酸酶抑制劑基因PGIP2及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因等在Dorsal_2期、Dorsal_3期和Dorsal_4期彎莖中表達量均降低，可見細胞壁的特征可能與睡蓮花莖的直立密切相關(guān)。

Class 5是唯一表達量持續(xù)升高的類，與隨著瓶插過程中睡蓮彎曲角度持續(xù)增大密切相關(guān)，推測Class 5包含較多與睡蓮彎曲相關(guān)的DEGs。結(jié)合GO功能注釋分析、KEGG信號通路富集分析結(jié)果，聚焦光合作用—天線蛋白、光合作用、植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、木葡聚糖及木葡糖基轉(zhuǎn)移酶等通路，共篩選到19個基因（圖7-B），其中光合作用—天線蛋白、光合作用共有5個基因，包括PSBE、CB2G、CB2D、CB23基因。植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因共有12個，包括SAUR32、SAUR36、LSH3、LSH4、CTR1等基因，同時涉及bHLH029和ERF95轉(zhuǎn)錄因子基因和木葡聚糖及木葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因XTH1、XTH23等。這些基因均與彎莖角度增加密切相關(guān)，可能在彎莖中發(fā)揮了積極的作用。

另外，此外對其他與細胞壁、激素等密切相關(guān)的DEGs進行了重點分析（圖7-C和圖7-D）。如在直立變彎曲的敏感期（Dorsal_1期和Dorsal_2）期中，發(fā)現(xiàn)若干木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（XTH）家族基因成員，如XTH2、XTH3、XTH6、XTH7、XTH10、XTH15、XTH22，XTH23、XTH28、XTH30、XTH32、XTH33等XTH家族基因在不同瓶插時期間表達量差異明顯，其中XTH3（EJ110_NYTH42695）、XTH22（EJ110_NYTH27383、EJ110_NYTH27384、EJ110_NYTH273 88）在Dorsal_1期和Dorsal_2期呈明顯上調(diào)。另有1個甘露聚糖內(nèi)切-1，4-β-甘露糖苷酶基因4（Man 4）（EJ110_NYTH02340）其在Dorsal_1期和Dorsal_2期變化異常顯著，其在第1期FPKM為0.53，而在剛發(fā)生彎莖的Dorsal_2期其FPKM升高至3052.07，log2 Fold Change則超過12倍。在植物激素方面，在植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Dorsal_1 vs Dorsal_2組、Dorsal_1 vs Dorsal_3組、Dorsal_1 vs Dorsal_4組中，共有52個基因表達持續(xù)下調(diào)，40個基因表達持續(xù)上調(diào)。生長素合成代謝相關(guān)的生長素反應(yīng)蛋白基因SAUR32（EJ110_NYTH22894、EJ110_NYTH05125），細胞周期蛋白基因CCD33（EJ110_NYTH53712）在睡蓮彎莖時期中隨著睡蓮彎莖程度加大，其表達量增加，且在Dorsal_1期至Dorsal_2期其表達量差異最為明顯，猜測其調(diào)控睡蓮的彎曲生長；而赤霉素不敏感突變蛋白基因GAI1（EJ110_NYTH11846）、吲哚-3-乙酸-酰胺合成酶基因GH38（EJ110_NYTH28046）、生長素誘導(dǎo)蛋白基因AX22C（EJ110_NYTH41203）、生長素響應(yīng)蛋白基因IAA26（EJ110_NYTH19985、EJ110_NYTH19991）在4個時期中呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，可能導(dǎo)致酰胺連接型IAA的形成減少，進而增加游離生長素的可用性，有利于生長素在莖部的積累，促進莖的彎曲生長。

2.9實時熒光定量PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機選取8個DEGs進行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，實時熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組表達趨勢基本一致，說明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠（圖8）。

3討論

莖稈直立性是評價鮮切花品質(zhì)的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)之一，而莖稈彎曲問題普遍影響著鮮切花的觀賞價值和瓶插壽命。例如月季（Rosa chinensis）（李龍，2013）和芍藥（Paeonia lactiflora）（趙琳等，2015）、非洲菊（Gerbera jamesonii）（祝小云等，2016）等均面臨彎莖的問題。水分是植物生長和生存的基本條件之一，對植物整個生命期均具有重要影響。本研究中睡蓮水分平衡值在瓶插第1 d即為負值（-0.44 g），推測原因是在睡蓮采摘和運輸過程中的離體水分失衡，睡蓮失水量多于吸水量導(dǎo)致。睡蓮作為典型的水生花卉，對水分的依賴性高于一般陸生花卉，離體采摘后若未能及時保水保鮮，易發(fā)生失水彎莖、萎蔫甚至死亡現(xiàn)象。可溶性糖與淀粉是植物光合作用的重要產(chǎn)物，是體內(nèi)重要的碳水化合物及能量來源（周瑞蓮等，2015；Shao et al.，2023）。在植物細胞中，植物在缺少能量及逆境響應(yīng)時，淀粉通過轉(zhuǎn)化為可溶性糖調(diào)節(jié)滲透壓影響植物細胞滲透壓，進而影響植物水分平衡值，間接對莖的形態(tài)產(chǎn)生影響。可溶性糖還可以作為合成纖維素等構(gòu)成植物莖細胞重要成分的生物大分子前體及作為信號分子參與植物生長發(fā)育調(diào)控（McFarlane et al.，2014；溫興等，2021）。淀粉和可溶性糖作為重要的能量來源，在睡蓮生命周期中提供關(guān)鍵能量支持。在4個時期睡蓮樣本中淀粉含量總體呈下降趨勢，而可溶性糖含量呈先上升后下降的變化趨勢，其峰值均出現(xiàn)在瓶插彎莖的Dorsal_2期，與水分平衡值表達趨勢基本一致，并與花開放程度的變化相對應(yīng)。說明淀粉和可溶性糖與睡蓮開花具有一定相關(guān)性，睡蓮切花初期對糖的消耗量大，淀粉不斷轉(zhuǎn)化為可溶性糖以加強供給，而到了瓶插后期，淀粉和可溶性糖含量均明顯下降，供應(yīng)不足，導(dǎo)致切花衰老，可能間接影響到睡蓮花莖彎曲。同時在GO功能注釋分析中，在瓶插后期DEGs主要參與調(diào)控多糖、糖和氨基酸代謝過程，而多糖如纖維素等是構(gòu)成細胞壁的重要成分，與睡蓮的彎莖過程及淀粉、可溶性糖含量降低相一致。

光照對絕大多數(shù)花卉的生長和開花均是十分重要的環(huán)境因素，本研究通過對睡蓮彎莖不同時期樣本中的DEGs進行GO功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)Dorsal_1 vs Dorsal_2組、Dorsal_1 vs Dorsal_4組均注釋到與光合作用有關(guān)的GO功能條目，Dorsal_1 vs Dorsal_2組、Dorsal_1 vs Dorsal_3組、Dorsal_1 vs Dorsal_4組均顯著富集在光合作用—天線蛋白和光合作用和脂肪酸等信號通路上，與本課題組前期對睡蓮彎莖背腹部DEGs的GO功能注釋分析中DEGs主要富集在光合作用—天線蛋白和光合作用通路基本一致（Li et al.，2023），與王亞坤等（2024）研究發(fā)現(xiàn)遮陰處理會影響胎生睡蓮的生長發(fā)育和生理過程基本一致。趙鑫月等（2024）研究表明LHCA/LHCB基因家族是植物光合作用中2個重要的捕光色素蛋白復(fù)合體家族，其在光能的捕獲、傳遞及響應(yīng)各種非生物脅迫中發(fā)揮重要作用。在睡蓮從直立（Dorsal_1期）到彎莖狀態(tài)（Dorsal_2期、Dorsal_3期和Dorsal_4期）的轉(zhuǎn)變下，光合作用相關(guān)基因，如PSBE、CB2G、CB2D、CB23等色素蛋白和葉綠素結(jié)合蛋白基因的表達量均呈現(xiàn)上調(diào)。說明在此過程中催化了更多光合作用相關(guān)的酶和蛋白，提高了睡蓮的光合效率，促進了睡蓮花莖的伸長。

植物激素在植物的生根發(fā)芽、細胞分裂及器官分化、向性運動、開花結(jié)實和衰老死亡等生長發(fā)育過程中均起著重要調(diào)控作用。Cui等（2005）研究發(fā)現(xiàn)赤霉素的不對稱分布影響分蘗角度的變化，而生長素與赤霉素共同調(diào)控的木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基乙烯（XET）引發(fā)的細胞壁松動有助于重力生長，進而影響分蘗角。李曉偉（2019）研究發(fā)現(xiàn)在重力刺激下，擬南芥近地側(cè)的生長素含量高于遠地側(cè)，導(dǎo)致兩側(cè)細胞生長伸長不一致，最終引起花序莖的彎曲生長，張鳳（2020）研究發(fā)現(xiàn)生長素不對稱分布會引起莖的彎曲變化。本研究通過Class 5篩選到12個植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因（圖4-B），包括SAUR32、SAUR36、LSH3、LSH4、CTR1等基因，同時涉及bHLH29和ERF95轉(zhuǎn)錄因子，均呈上調(diào)趨勢。Dorsal_1 vs Dor-sal_2組、Dorsal_1 vs Dorsal_3組和Dorsal_1 vs Dor-sal_4組中，植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共有52個基因呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)，40個呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)，生長素合成代謝相關(guān)的生長素反應(yīng)蛋白基因SAUR32_、細胞周期蛋白基因CCD33上調(diào)，赤霉素不敏感變蛋白基因GAI1、吲哚-3-乙酸酰胺合成酶CH38、生長素誘導(dǎo)蛋白基因AX22C、生長素響應(yīng)蛋白基因IAA26在時期中呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，與前人研究結(jié)果一致。

植物細胞壁由初生細胞壁和次生細胞壁組成，是圍繞在植物原生質(zhì)體外的細胞結(jié)構(gòu)，對維持植物莖的直立具有重要作用，細胞壁強度低，易造成植物彎莖。細胞壁是由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠等多糖及結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（肖銀燕等，2020）。在Class 1與Venn圖中共篩選出25個主要涉及細胞壁結(jié)構(gòu)的DEGs，如果膠酯酶基因PME3、PME18、多聚半乳糖醛酸酶抑制劑基因PGIP2及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因等，均是細胞壁結(jié)構(gòu)與發(fā)育的重要基因，對細胞壁的結(jié)構(gòu)強度具有重要影響。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因通過磷酸化調(diào)控細胞壁代謝，表達量低可能導(dǎo)致磷酸化調(diào)控能力降低。PME3、PME18基因?qū)儆诠z修飾酶家族，可能參與細胞壁的果膠去脂化，其在Dorsal_2期、Dorsal_3期、Dorsal_4期彎莖中表達量降低，易導(dǎo)致果膠的甲酯化程度升高，減少Ca2+的形成，細胞壁結(jié)構(gòu)變得松散。PGIP2基因表達量降低，抑制多聚半乳糖醛酸酶（PG）能力降低，導(dǎo)致果膠代謝失衡，進一步加劇細胞壁破壞程度，導(dǎo)致睡蓮花莖機械強度降低，衰老加速。甘露聚糖內(nèi)切-1，4-β-甘露糖苷酶4（Man 4）為主要分解細胞壁半纖維素組分中的甘露聚糖的一種內(nèi)切水解酶，在直立期（Dorsal_1期）與彎莖期（Dor-sal_2期、Dorsal_3期和Dorsal_4期）之間差異非常顯著，其可能對調(diào)控睡蓮彎莖具有重要意義。

此外，XTH是植物細胞壁重構(gòu)和瓦解過程中的關(guān)鍵酶，通過內(nèi)切木葡聚糖并將還原性末端連接至另一木葡聚糖鏈上，促進細胞壁重構(gòu)；或者直接水解木葡聚糖鏈，削弱其與纖維素的交聯(lián)，導(dǎo)致細胞壁結(jié)構(gòu)解體，具體發(fā)揮的作用受到激素的影響（Becnel et al.，2006）。在擬南芥中，XTH基因家族可控制次生細胞壁的形成，介導(dǎo)下胚軸的伸長，同時可調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)基因，響應(yīng)生長素、脫落酸、細胞分裂素和油菜素甾醇等植物激素和其他環(huán)境信號，在植物生長調(diào)控中起重要作用，同時XTH基因家族可調(diào)控彎曲部位的細胞壁松動，有助于向重力性生長（Sasidharan et al.，2010；Kaewthai et al.，2013；Shi et al.，2014；Cao et al.，2019；Kushwahetal.，2020）。本研究中睡蓮的XTH基因家族大多數(shù)基因表達差異明顯，其中XTH3、XTH22基因表達量在Dorsal_1期和Dorsal_2期樣本中呈明顯上調(diào)，推測這些基因在睡蓮彎莖過程中能通過調(diào)控細胞壁變化，在睡蓮花梗彎曲過程中發(fā)揮重要作用，但具體機制有待進一步研究。

4結(jié)論

水分、淀粉和可溶性糖含量以及光照響應(yīng)、植物激素、細胞壁形成與分解等因素的相互作用共同導(dǎo)致睡蓮彎莖。推測生長素及細胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)基因是影響睡蓮彎莖的關(guān)鍵基因群。

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（責(zé)任編輯：陳燕，李洪艷）