基于SLAF-Seq技術的辣椒抗炭疽病QTL定位分析及SSR分子標記開發

摘要：【目的】利用SLAF-Seq技術對辣椒抗炭疽病QTL進行定位分析，開發與炭疽病抗性QTL緊密連鎖的分子標記，為辣椒抗炭疽病分子標記輔助選擇育種提供理論參考。【方法】以抗病材料PPTC26-3-1-1-1-1-1和感病材料1287為親本構建F2代群體，并采用SLAF-Seq技術進行分子標記開發，構建高密圖遺傳連鎖圖譜。結合表型數據，利用復合區間作圖法（CIM）對辣椒果實轉色期的炭疽病抗性進行QTL分析。利用Microsatellite（MISA）在定位區間識別SSR位點。【結果】從親本和子代樣品共獲得423351627條Reads，其中，來自PPTC26-3-1-1-1-1-1和1287分別為8130516和6621396條，F2代群體120個子代樣品的平均Reads數量為34049987個。構建包含4671個SNP分子標記、分布于12個連鎖群、總圖距為1567.53 cM、平均圖距為0.34 cM的辣椒高密度遺傳圖譜，檢測到1個炭疽病抗性相關的QTL（CaR10.1），位于10號連鎖群上187930592～189766111 bp物理區間內。共有23個基因定位在關聯區域內，根據基因功能注釋，其中1個基因編碼假定晚疫病抗性蛋白同源物R1B-23異構體X2，1個基因編碼PPR蛋白，可能與辣椒果實轉色期炭疽病抗性相關。在關聯到的QTL區間內開發出SSR分子標記T482，在F2代群體中的驗證結果顯示，T482引物在F2代群體單株中擴增結果與表型鑒定結果一致。F2代群體抗病和中抗單株中有53株具有抗病親本的條帶，有25株同時具有抗病親本和感病親本的條帶；F2代群體感病單株中，有42株具有感病親本的條帶。【結論】構建高密度遺傳連鎖圖譜，將辣椒果實轉色期炭疽病抗性定位于10號連鎖群，在關聯區間開發出SSR分子標記T482，可初步鑒別辣椒果實轉色期炭疽病抗性，同時結合針刺接種法鑒定，可提高鑒定的準確率。

關鍵詞：辣椒；SLAF-Seq；遺傳圖譜；炭疽病；QTL；SSR分子標記

中圖分類號：S641.303.6文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0633-10

QTL localization analysis and SSR molecular marker develop?ment of pepper resistance to anthracnose by SLAF-Seqtechnology

LI Yi-fei1，DUAN Min-jie1，HUANG Ren-zhong1，HUANG Qi-zhong1，WANG Chun-ping2，ZHANG Shi-cai1*

（1Vegetable and Flower Research Institute，Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 401329，China；2Chongqing Key Laboratory of Adversity Agriculture，Biotechnology Research Institute，Chongqing Academyof Agricultural Sciences，Chongqing 401329，China）

Abstract：【Objective】The QTL localization analysis for resistance to anthracnose of pepper was analyzed by SLAF-Seq technology，and the molecular markers closely linked with the QTL for resistance to anthracnose were developed to provide theoretical reference for molecular marker assisted selection breeding for resistance to anthracnose of pepper.【Method】The F2 generation population was constructed with the resistant material PPTC26-3-1-1-1-1-1 and susceptible material 1287 as the parents，and the molecular marker was developed by SLAF-Seq technology，and the high-density ge-netic linkage map was constructed，combined with the phenotypic data.QTL analysis was performed for anthracnose re-sistance of pepper fruit during the color transition stage by composite interval mapping（CIM），and SSR loci were identi-fied by Microsatellite（MISA）.【Result】A total of 423351627 reads were obtained from parent and offspring samples，of which 8130516 reads were from PPTC26-3-1-1-1-1-1 and 6621396 reads were from 1287.The average number of reads from 120 offspring samples ofF2 generation was 34049987.A high-density genetic map of pepper was constructed，which contained 4671 SNP molecular markers distributed in 12 linked groups with a total map distance of 1567.53 cM and an average map distance of 0.34 cM.One QTL（CaR10.1）related to anthracnose resistance was detected.It was located in the physical range of 187930592-189766111 bp on chain group number 10.A total of 23 genes were located in the asso-ciated region.According to the gene function annotation，1 gene encoded the isoform X2 of the presumed late blight resis-tance protein homolog R1B-23，and 1 gene encoded PPR protein，which might be related to the resistance to anthracnose during the color transition stage of pepper fruit.SSR marker T482 was developed within the associated QTL interval，and verification in F2 population showed that the bands amplified by T482 primer in F2 population individual were consistent with phenotypic identification.In the F2 generation，53 strains had bands of resistant parents and 25 strains had bands of both resistant and susceptible parents.In F2 generation infected individuals，42 strains contained bands of infected parents.【Conclusion】A high-density genetic linkage map is constructed.The resistance to anthracnose during the color transition stage of pepper fruits is localized on chain group number 10，and an SSR molecular marker T482 is developed in the asso-ciated interval.The results can be used to identify the resistance to anthracnose of pepper fruit during color transition stage，and can be combined with needle inoculation method to improve the identification accuracy.

Key words：pepper；SLAF-Seq；genetic map；anthracnose；QTL；SSR molecular marker

Foundation items：Chongqing-Sichuan Joint Implementation Key Research and Development Project of Chongqing（cstc2021jscx-cylhX0002）；General Project of Chongqing Natural Science Foundation（CSTB2022NSCQ-MSX0591）；2023 Municipal Financial Special Major Core Technology Research Project（cqaas2023sjczhx002）

0引言

【研究意義】辣椒（Capsicum annuum L.）起源于中美洲和南美洲熱帶及亞熱帶地區，是世界上種植面積最大的蔬菜作物之一（雷建軍等，2023）。根據國家大宗蔬菜產業技術體系統計，2018年我國辣椒種植面積達213.3萬ha，約占蔬菜年種植總面積的10%（鄒學校等，2020；王立浩等，2021）。近年來，隨著辣椒規模化種植，使得辣椒病害頻繁發生（Linu and Jisha，2013；楊佳文等，2017；Ridzuan et al.，2018），其中，炭疽病已成為危害辣椒的主要病害，是由半知菌亞門炭疽菌屬（Colletotrichum）內的數個種引起的（汪愛娥，2005；Almeida et al.，2019）。辣椒炭疽病多發生在果實采收前后，表現為黑色或褐色壞死斑點。大果型辣椒果實上炭疽病的病斑直徑可達3～4 cm，炭疽病造成的產量損失達80%，對辣椒生產造成嚴重的經濟損失，阻礙辣椒產業的健康發展（Mahasuk et al.，2009；滿益龍等，2016；Osman Abdelrazig et al.，2020）。目前，生產上多采用化學藥劑防治辣椒炭疽病，該方法不僅給消費者和環境造成嚴重的影響，還使病原菌產生耐藥性或抗藥性。培育抗性品種是減少辣椒損失的最經濟、最重要的策略之一。開發與抗炭疽病基因緊密連鎖的分子標記，將其與常規育種相結合可明顯提高抗病育種的效率。因此，分析辣椒抗炭疽病QTL定位，并進行分子標記開發，對辣椒抗炭疽病分子標記輔助選擇育種具有重要意義。【前人研究進展】近年來，眾多國內外研究人員致力于辣椒炭疽病遺傳圖譜構建和炭疽病抗性QTL定位。Voorrips等（2004）利用F2代群體構建辣椒抗炭疽病分子遺傳圖譜，并進行QTL定位，在B連鎖群上定位到與Colletotri-chum gloeosporioides抗性相關的1個主效QTL（B1）、3個微效QTL（B2、H1和D1）。Kim等（2010）利用F2代群體構建了抗炭疽病的分子遺傳圖譜，將尖孢炭疽菌C3菌株的炭疽病抗性定位到2個主效QTL和16個微效QTL，其中An8.1位于第4個連鎖群的18.7 cM。Lee等（2010）利用種間雜交群體BC1F2構建了分子遺傳圖譜并進行QTL定位，利用針刺法進行接種鑒定，鑒定出位于12號連鎖群上的1個抗尖孢炭疽菌的主效QTL（CaR12.2）和1個微效QTL（CaR12.1）。Lee等（2011）采用AFLP標記和分離群體分組分析法將主效QTL區域的分子標記進一步加密，將與主效QTL（CaR12.2和CcR9）連鎖的AFLP標記（EtagMcgt04和EtacMccg13）轉換為基于PCR的分子標記CaR12.2M1-CAPS和CcR9M1-SCAR。Sun等（2015）以PBC932為抗性材料，將辣椒炭疽病抗性主效QTL定位于5號染色體上。Mahasuk等（2016）利用2種不同的致病菌和1種不同的接種方法（顯微注射法和高壓噴霧法），定位與抗炭疽病相關的QTL，包括3個主效QTL和2個微效QTL。劉議蔚等（2016）對綠熟期抗炭疽病主效基因進行精細定位，將果實綠熟期的抗炭疽病主效基因AnRGO5定位在KASPar標記P5L P 81和P5L P 137之間508 kb內（物理區間為227.07～226.56 Mb）。Zhao等（2020）以PCB932為抗病材料構建的BC4S1群體，采用KASPar和InDel分子標記構建抗炭疽病遺傳圖譜，并進行QTL定位，縮小了炭疽病的抗性定位區間。Kethom和Mongkolporn（2021）構建重組自交系，采用SNP標記構建遺傳圖譜并進行QTL定位，獲得3個主效QTL，分別為RA80f6_r 1、RA80f6-g1和RA80f6-g2，其中辣椒果實紅熟期炭疽病抗性的主效QTL RA80f6_r 1位于4號連鎖群，而辣椒青熟期炭疽病抗性的主效QTL RA80f6-g1和RA80f6-g2分別位于8號連鎖群和3號連鎖群。【本研究切入點】雖然辣椒炭疽病抗性QTL的研究較多，但主要集中在辣椒紅熟果和青熟果期炭疽病抗性研究方面，而辣椒果實轉色期作為果實發育的關鍵時期，目前鮮見有關該時期辣椒炭疽病的抗性QTL定位的研究報道。【擬解決的關鍵問題】以抗病親本PPTC26-3-1-1-1-1-1和感病親本1287構建的F2代群體，采用SLAF-Seq技術構建辣椒高密度遺傳圖譜，在表型性狀鑒定的基礎上對辣椒果實轉色期的炭疽病抗性進行QTL定位，開發與辣椒果實轉色期的炭疽病抗性緊密連鎖的分子標記，為辣椒抗炭疽病分子標記輔助選擇育種打下基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

以高感甜椒材料1287（母本，由中國農業科學院選育的中椒808轉育而來）和高抗炭疽病材料PPTC26-3-1-1-1-1-1（父本，亞洲蔬菜研究發展中心王添成博士饋贈）為親本，與其雜交F2代群體（120株）為試驗材料。辣椒尖胞炭疽菌是從國家農作物改良中心（重慶分中心）基地的辣椒炭疽病病果中分離并純化。

1.2 SLAF文庫構建及高通量測序

取1287×PPTC26-3-1-1-1-1-1雜交F2代群體（120株子代）及雙親的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因組DNA。利用SLAF技術對合格的DNA樣品構庫測序，以完成測序的遵椒1號辣椒作為參考基因組（http：//peppersequence.genomics.cn/page/spe-cies/download.jsp#5）。對各樣品基因組DNA進行Hae III酶切，將長度為314～364 bp的酶切片段定義為SLAF標簽，再進行3'端加A處理、連接Dual-index測序接頭、PCR擴增、純化、混樣，選取314～364 bp目的片段，文庫質量合格后用Illumina HiSeqTM 2500平臺進行測序。選用日本粳水稻（Oryza sativa L.）作為對照（Control）參與SLAF文庫構建和測序，并進行準確性評估，日本粳水稻測序數據下載網址為http：//rice.Plantbiology.msu.edu/。

1.3 SNP開發及基因型編碼

為了確保所開發SNP的準確性，根據其在遵辣1號參考基因組測序數據上的定位結果，同時結合GATK和Samtools方法得到的交際變異位點。采用遺傳學通用的等位編碼規則，對多態性的SLAF標簽進行基因型編碼，從而進行遺傳分析。

1.4 SLAF-Seq數據分析及高密度遺傳圖譜繪制

利用Dual-index對測序獲得的原始數據進行識別，從而獲得各樣品的Reads，然后對過濾完接頭的測序Reads進行測序質量和數據量的評估。通過Reads之間聚類的方法從親本和子代中開發SLAF標簽，篩選出多態性高的SLAF標簽。對多態性高的SLAF標簽進行基因型編碼后，通過HighMap構建遺傳圖譜，并進行準確性評估（Li etal.，2008）。

1.5炭疽病抗性鑒定及QTL定位

1.5.1炭疽病抗性鑒定采用張世才等（2022）的離體果實針刺接種法鑒定炭疽病抗性，于辣椒結果期盛期采摘轉色期果實，將離體果實表面進行消毒（75%酒精），將6μL用無菌水配制的孢子懸浮液（濃度為1×106個/mL）用移液槍滴于果實表面，然后用直徑1 mm的昆蟲針刺穿液滴中心。每份材料接種10個果實，每個果實接種3個點，分別位于果實的肩部、中部和尖端。置于25～28℃、12 h光照/12 h黑暗、相對濕度（RH）≥95%的條件下培養，第7 d調查發病情況。病斑直徑≥4mm的視為發病，統計發病率，即病斑數占接種點總數的百分率。抗性劃分標準：免疫，發病率為0；高抗，發病率≤3%；抗病，3%lt;發病率≤10%；中抗，10%lt;發病率≤30%；感病，發病率gt;30%。

1.5.2 QTL定位根據所構建的遺傳圖譜與子代的抗炭疽病表型數據相結合，采用復合區間作圖法（CIM）法進行QTL分析（Wang et al.，2012）。使用1000次排列檢驗表型數據，設置P=0.05，取似然函數比值對數值（LOD）gt;2.5作為閾值判斷QTL的存在。若LODgt;2.5，即認為該置信區間可能存在1個QTL。

1.6 SSR分子標記開發

根據遵椒1號的參考基因組序列，利用SLAF-Seq高通量測序結果確定調控辣椒炭疽病抗性的物理區間。利用Microsatellite（MISA）軟件（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對定位區間內多態性SLAF標簽序列進行SSR位點搜索（2個SSR位點序列間隔≥100 bp）。利用Primer 5.0設計SSR引物。從設計的88對SSR引物中篩選出60對引物（表1），引物合成后用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進行純化。PCR反應體系20.0μL：基因組DNA 0.5μL，上、下游引物各1.0μL，2×PCR Master Mix 10.0μL，ddH2O補足至20.0μL。擴增程序：95℃預變性2min；95℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，共進行30個循環，4℃保存。PCR產物用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1 SLAF-Seq數據分析結果

利用SLAF-Seq技術對親本和子代進行測序，測序數據提交至NCBI中的SRA數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/accessed on：20 October 2020），登錄號為PRJNA684005。從親本和子代樣品共獲得423351627條Reads，其中來自PPTC26-3-1-1-1-1-1和1287分別為8130516和6621396條，F2代群體120個子代樣品的平均Reads數量為34049987個（表2）。測序數據的Q30均大于96.00%，各樣品的GC含量差異不明顯，為37.76%～38.27%。PPTC26-3-1-1-1-1-1和1287的SLAFs標簽數分別為174496和189426個，平均測序深度為35.97X和40.75X；F2代群體子代的SLAFs標簽數為170846個，平均測序深度為17.70X（表2），表明測序質量高，可用于下一步分析。

2.2高密度遺傳連鎖圖譜的綜合分析結果

通過與參考基因組的定位，將過濾后獲得的高質量SNP分子標記進行分析，構建辣椒連鎖圖譜。遺傳圖譜包含4671個SNP分子標記，覆蓋12個連鎖群，總圖距為1567.53 cM，平均圖距為0.34 cM。其中，3號連鎖群連鎖圖圖距最長（144.36 cM），標記最多是10號連鎖群（552個），標記間平均距離為0.20 cM，連鎖圖圖距最短（107.67 cM），標記間最大距離為0.55 cM，位于5號連鎖群（表3和圖1）。

為評估遺傳圖譜的質量，先將SLAF標簽定位到辣椒基因組12個連鎖群上，再對SLAF標簽在遺傳圖譜上的遺傳距離及其在基因組的物理位置進行共線性分析，結果如圖2所示。12個連鎖群中，有8個連鎖群的Spearman相關系數在0.9900以上，其余4個連鎖群的Spearman相關系數均在0.9500以上，表明12個連鎖群的圖譜與物理圖共線性均很好（表3）。

2.3辣椒QTL定位結果

經過1年的針刺接種鑒定發現，在F2代群體120株中表現為抗病的植株有39株，占32.5%；38株發病率為10%～30%，表現為中抗，占31.7%；43株發病率gt;30%，表現為感病，占35.8%。結合表型數據，采用CIM方法進行QTL分析，檢測到1個抗炭疽病QTL位點。該位點的表型貢獻率為9.713%，位于10號連鎖群上，物理區間為187930592～189766111 bp，遺傳距離為78.887～79.304 cM，定位區間為0.417 cM；最大LOD值為4.080，加性效應為-0.669，顯性效應為-13.185，將該QTL位點命名為CaR10.1（表4和圖3）。

根據遵辣一號基因組的注釋，在10號連鎖群CaR10.1的物理區間內確定了23個預測的候選基因，在COG數據庫中有8個基因被注釋，KEGG庫中有13個基因被注釋，Swiss-Prot數據庫中有17個基因被注釋，其中Capana10g001856基因編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶，Capana10g001848基因編碼細胞分裂周期蛋白48同系物，Capana10g001872基因編碼轉錄因子MYB48，Capana10g001854基因編碼假定晚疫病抗性蛋白同源物R1B-23異構體X2，Capana10g001846基因編碼PPR蛋白，Capana10g00 1847基因編碼CLIP相關蛋白。

2.4多態性SSR引物篩選

將60對SSR引物對1287和PPTC26-3-1-1-1-1-1進行擴增，結果發現有5對引物在雙親間具有多態性，分別為T049、T482、T592、T643和T715（圖4和表5），將篩選的5對SSR引物在F2代群體中進一步驗證。

2.5 SSR引物在F2代群體中的擴增驗證

利用篩選的5對SSR引物對F2代群體的120株單株進行擴增，結果（圖5）顯示，T482引物在F2代群體單株中擴增出的條帶與表型鑒定一致。F2代群體抗病和中抗單株中有53株具有抗病親本的條帶，有25株同時具有抗病親本和感病親本的條帶；F2代群體感病單株中，有42株表現感病親本的條帶。因此，判定T482引物可用于初步鑒別辣椒果實轉色期炭疽病抗性，同時可結合針刺接種方法鑒定，從而提高鑒定的準確率。

3討論

目前，遺傳連鎖圖譜作為一種關鍵技術，不僅用于植物遺傳學，還可通過QTL定位明確與農藝性狀和品質性狀相關的基因組區域。近年來，SLAF-Seq已被用于辣椒遺傳連鎖圖譜的構建，Zhu等（2019）利用SLAF-Seq技術對辣椒開花時間和始花節位性狀QTL進行定位研究，構建了包含9038個SLAF標簽的子遺傳連鎖圖，總圖距為1586.78 cM；Zhang等（2019）通過SLAF-Seq技術對辣椒的花節位QTL位點進行定位研究，構建辣椒遺傳圖譜，該圖譜包含分布于12個連鎖群的9328個SLAF標簽，總圖距2009.69 cM；Sun等（2020）利用SLAF-Seq技術對蚜蟲抗性和產量QTL進行定位研究，構建了包含167個SNP分子標記的遺傳圖譜；Li等（2021）利用SLAF-Seq技術對辣椒疫病QTL進行定位研究，構建了包含5565個SNP分子標記的遺傳圖譜，總圖距為1535.69 cM。本研究采用離體果實針刺接種法鑒定F2代群體單株的炭疽病抗病性，并采用SLAF-Seq技術開發出4671個多態性SLAF標簽作為上圖標記，構建了總圖距為1567.53 cM，且標記間的平均圖距為0.34 cM的高密度遺傳圖譜，該遺傳圖譜的多態性標記覆蓋率高，在此基礎上進行QTL定位，結果更準確。

目前，辣椒炭疽病抗性相關QTL定位的報道較多，但多數研究采用PBC80、PBC81和PBC932作為抗源（Lee et al.，2010；Sun et al.，2015；Mahasuk et al.，2016；Zhao et al.，2020；Kethom and Mongkolporn，2021）。Lee等（2010）以PBC81為抗原，將尖孢炭疽病抗性主效QTL（CaR12.2）和微效QTL（CaR12.1）定位在12號染色體。Sun等（2015）以PBC932為抗性材料，將辣椒炭疽病抗性主效QTL定位在5號染色體上。Mahasuk等（2016）以PBC80和PBC932為抗性材料，將綠熟期和紅熟期的QTL均定位到2號染色體的同一位點。劉議蔚等（2016）以PBC932為抗性材料進行炭疽病抗性QTL定位，將綠熟期炭疽病抗性的主效基因定位在5號染色體上。Zhao等（2020）以PCB932的衍生群體為供試材料，將辣椒果實綠熟期炭疽病抗性定位在5號連鎖群。Kethom和Mongkolporn（2021）以PBC80作為抗源，獲得3個主效QTL，其中辣椒果實紅熟期炭疽病抗性的主效QTL（RA80f6_r 1）位于4號連鎖群，而辣椒青熟期炭疽病抗性的主效QTL（RA80f6-g1和RA80f6-g2）分別位于8號連鎖群和3號連鎖群。本研究以PPTC26-3-1-1-1-1-1抗病材料，將辣椒果實轉色期炭疽病抗性定位到10號連鎖群，與前人的將辣椒紅熟期和綠熟期炭疽病抗性QTL定位在2、3、4、5、8和12號連鎖群（Lee et al.，2010；Sun et al.，2015；Maha-suk et al.，2016；Kethom and Mongkolporn，2021）不一致，推測是由于本研究所用的抗病材料（PPTC26-3-1-1-1-1-1）、果實成熟期（果實轉色期）與前人（Lee et al.，2010；Sun et al.，2015；Mahasuk et al.，2016；Zhao et al.，2020；Kethom and Mongkolporn，2021）不同，或接種方法的不同而引起的。該推測與眾多前人（Lin etal.，2002；Pakdeevaraporn etal.，2005；Yoon et al.，2009；Mahasuk etal.，2009；劉議蔚等，2016）研究關于炭疽病的復雜遺傳機制復雜不謀而合，辣椒炭疽病抗性受抗性材料、病原菌類型、果實成熟期和接種方法的不同而存在差異，其遺傳機制較復雜。

4結論

通過SLAF-Seq技術構建包含4671個上圖標記的高密度遺傳連鎖圖譜，將辣椒果實轉色期炭疽病抗性QTL在1.83 Mb區間內，包含23個基因。開發的SSR分子標記（T482）可用于鑒定辣椒果實轉色期炭疽病抗性，可結合針刺接種鑒定可提高鑒定的準確率。

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（責任編輯：陳燕）