空心與實心溧陽白芹OjG8H基因克隆及功能分析

摘要：【目的】克隆獲得溧陽白芹組織中的編碼香葉醇-8羥化酶（Geraniol 8-hydroxylase，G8H）基因OjG8H并對其功能進(jìn)行初步分析，為進(jìn)一步研究OjG8H基因在纖維素、木質(zhì)素和類黃酮生物合成過程中的潛在功能及溧陽白芹品種改良提供參考。【方法】以空心溧陽白芹及其突變體實心溧陽白芹為試驗材料，測定纖維素、木質(zhì)素和類黃酮含量，克隆OjG8H基因并對其序列以及編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，運用實時熒光定量PCR檢測OjG8H基因在空心與實心溧陽白芹莖、葉柄和葉中的相對表達(dá)量，分析其組織中纖維素、木質(zhì)素和類黃酮含量與OjG8H基因相對表達(dá)量的相關(guān)性。【結(jié)果】空心與實心溧陽白芹莖和葉柄剖面存在明顯差異；2種溧陽白芹葉中纖維素和類黃酮含量顯著高于莖和葉柄（Plt;0.05，下同），空心溧陽白芹莖和葉柄中木質(zhì)素含量顯著高于葉，實心溧陽白芹葉柄中木質(zhì)素含量顯著高于莖和葉；2種溧陽白芹OjG8H基因全長均為1494 bp，于75和416號2個位點存在差異：75號位點，空心溧陽白芹的堿基為腺嘌呤（A），實心溧陽白芹為胸腺嘧啶（T）；416號位點，空心溧陽白芹的堿基為T，實心溧陽白芹為A；空心和實心溧陽白芹OjG8H基因CDS序列均編碼497個氨基酸殘基，C端第25位氨基酸在空心溧陽白芹中為谷氨酰胺（Gluta-mine，Q），實心溧陽白芹中為組氨酸（Histidine，H）；第139位氨基酸在空心溧陽白芹中為纈氨酸（Valine，V），實心溧陽白芹中為天冬氨酸（Aspartic acid，D）。OjG8H蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白，亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，存在1個跨膜區(qū)；OjG8H蛋白與同屬傘形科的胡蘿卜的G8H親緣關(guān)系較近；空心溧陽白芹葉柄中OjG8H基因相對表達(dá)量顯著高于莖和葉，實心溧陽白芹莖和葉中OjG8H基因的相對表達(dá)水平顯著高于空心溧陽白芹，在葉柄中相反；溧陽白芹OjG8H基因的相對表達(dá)量與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)。【結(jié)論】OjG8H基因編碼的蛋白屬于CYP超蛋白家族成員，具有組織特異性，該基因可能參與溧陽白芹中木質(zhì)素的合成。

關(guān)鍵詞：溧陽白芹；OjG8H；基因克隆；纖維素；木質(zhì)素

中圖分類號：S645.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0622-11

Cloning and functional analysis of OjG8H gene from hollow and solid Liyang white celery

ZHANG Xin-qi1，2，ZHU Shun-hua2，3，ZHONG Xiu-lai2，3，WANG Kun2，3，LUO Qing2，3，XIONG Ai-sheng4*，TAN Guo-fei2，3*

（1College of Agriculture，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China；2Institute of Horticulture，Guizhou Academy of Agricultural Sciences/Horticultural Engineering Technology Research Center of Guizhou，Guiyang，Guizhou 550006，China；3Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Innovation in Karst Mountain Area of Agricul-ture and Rural Ministry，Guiyang，Guizhou 550006，China；4College of Horticulture，Nanjing Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Geneticsamp;Germplasm Enhancement"and Utilization/Key Laboratory of Biology and Germ-plasm Enhancement of Horticultural Crops in East China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Nanjing，Jiangsu 210095，China）

Abstract：【Objective】The encoding geraniol 8-hydroxylase（G8H）gene OjG8H in the tissues of Liyang white celery was obtained through cloning，and a preliminary functional analysis of it was carried out.The objective of this study was to provide reference point for further research on the potential function of OjG8H gene in the biosynthesis processes of cel-lulose，lignin and flavonoids，as well as for the variety improvement of Liyang white celery.【Method】Using the hollow Liyang white celery and its mutant solid Liyang white celery as experimental materials，the contents of cellulose，lignin and flavonoids were determined.OjG8H gene was cloned，and bioinformatics analysis was conducted on its sequence and the encoded protein.Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression of the OjG8H gene in the stems，petioles and leaves of the hollow and solid Liyang white celery.The correlation between the contents of cellulose lignin and flavonoids in these tissues and the relative expression level of OjG8H gene was analyzed.【Result】There were obvious differences in the cross-sections of the stems and petioles between hollow and solid Liyang white ce-lery.The contents of cellulose and flavonoids in the leaves of the 2 Liyang white celery were significantly higher than those in the stems and petioles（Plt;0.05，the same below）.The lignin content in the stems and petioles of the hollow Liyang white celery was significantly higher than that in the leaves，while the lignin content in petioles of the solid Liyang white celery was significantly higher than in the stems and leaves.The total length of the 2 Liyang white celery OjG8Hgene was 1494 bp，and there were differences at site 75 and site 416.At site 75，the base of hollow Liyang white celery was ade-nine（A），while that of the solid Liyang white celery was thymine（T）.At site 416，the base of the hollow Liyang white celery was T，and that of the solid Liyang white celery was A.The OjG8H gene CDS sequence of hollow and solid Li-yang white celery both encoded 497 amino acid residues.The 25th amino acid at the C-terminal was glutamine（Q）in the hollow Liyang white celery and histidine（H）in the solid Liyang white celery.The 139th amino acid was valine（V）in the hollow Liyang white celery and aspartic acid（D）in the solid Liyang white celery.The OjG8H protein was a stable hydro-philic protein and its subcellular localization was in the endoplasmic reticulum，with 1 transmembrane region.The OjG8H protein had a relatively close genetic relationship with the G8H of Daucus carota，which also belonged to the Apiaceae family.The relative expression level of OjG8H gene in the petioles of hollow Liyang white celery was significantly higher than that in the stems and leaves.The relative expression levels of OjG8H gene in the stems and leaves of the solid Liyang white celery were significantly higher than those in hollow Liyang white celery，while it was the opposite in the petioles.There was significant positive correlation between the relative expression level of OjG8H gene in Liyang white celery and the lignin content.【Conclusion】The protein encoded by the OjG8H gene belongs to a member of the CYP superprotein family and is tissue specific.This gene may be involved in the synthesis"of lignin in Liyang white celery.

Key words：Liyang white celery；OjG8H；gene cloning；cellulose；lignin

Foundation items：Central Government Guiding Local Science and Technology Development Project of Guizhou Department of Science and Technology（QKHZYD〔2023〕033）；Talent Foundation Project of Guizhou Academy of Agri-cultural Sciences（QNKBSJJ〔2024〕03）；Guizhou Plateau Characteristic Vegetable Industry Technology System Project（GZMARS）；Guidance Fund Project of Sanya Research Institute，Nanjing Agricultural University（NAUSY-MS33）

0引言

【研究意義】水芹［Oenanthe javanica（Bl.）DC］為傘形科（Apiaceae）多年生草本植物，是我國特色水生蔬菜之一（金楠等，2022）。水芹富含多種維生素、纖維素、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)（呂艷等，2022），含有香豆素、黃酮類、有機(jī)酸和多酚等化合物，具有消炎、抗病毒、降血糖和保護(hù)心血管等多種功能（Lu and Li，2019）。纖維素和木質(zhì)素是膳食纖維的主要組成成分，適當(dāng)攝入膳食纖維有利于人體健康（苑笑陽等，2016）。纖維素存在于細(xì)胞初生細(xì)胞壁和次生細(xì)胞壁中（卻楓等，2022），水生植物中纖維素的降解對其通氣組織的發(fā)育具有重要作用（Liu et al.，2023）；木質(zhì)素存在于二次增厚的植物細(xì)胞壁中，其積累能使植物組織木質(zhì)化并具有較強(qiáng)的硬度，從而支撐整株植株（Vanholme et al.，2008；苑笑陽等，2016）。水芹中的木質(zhì)素和纖維素含量，不僅影響植株的生長狀況，還影響其食用口感。香葉醇-8羥化酶（Geraniol 8-hydroxylase，G8H）也被稱為香葉醇-10羥化酶（Geraniol 10-hydroxylase，G10H），屬于細(xì)胞色素P450單加氧酶家族中的CYP76家族；可在C-8位置將單萜類香葉醇羥基化，形成8-羥基香葉醇（Sintupacheeet al.，2015）。前人研究發(fā)現(xiàn)，OsG8H基因在中華水芹（Oenanthe sinensis）纖維素和木質(zhì)素的代謝途徑中發(fā)揮潛在作用（Liu et al.，2023）。因此，克隆水芹中G8H基因（OjG8H）并對其進(jìn)行功能分析，對深入研究水芹組織中纖維素和木質(zhì)素的合成機(jī)制及優(yōu)化水芹食用口感具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，水芹分子生物學(xué)方面的研究與模式植物和大田作物相比較滯后，僅有少量研究報道以水芹為試驗材料進(jìn)行基因克隆試驗。熱激蛋白（Heatshock protein，HSP）能對外界環(huán)境的刺激做出應(yīng)答反應(yīng)，能提高植物對惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力，屬于應(yīng)激蛋白（Ohama etal.，2017）。胡艷平等（2016）從水芹中克隆出了全長為2100 bp的OjHSP90基因的cDNA序列。肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl alcohol dehy-drogenase，CAD）是木質(zhì)素合成途徑中一類重要的限速酶，在木質(zhì)素合成最后一步中起作用。仇亮等（2018）從水芹中克隆得到OjCAD基因，其表達(dá)量在水芹葉片中較高，推測該基因參與水芹木質(zhì)素的合成。咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）參與G型木質(zhì)素合成，是該途徑中的關(guān)鍵酶，OjCCoAOMT基因在水芹不同組織中的表達(dá)存在明顯差異，葉片中OjCCoAOMT表達(dá)量相對較高，可能是因為水芹各組織中木質(zhì)素代謝不同（朱勝琪等，2019）。水芹中萜類合酶（Terpene synthase，TPS）參與風(fēng)味物質(zhì)合成的調(diào)控，有學(xué)者克隆出水芹中OjTPS1基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明OjTPS1基因的表達(dá)具有組織特異性，OjTPS1基因能在體外催化β-石竹烯的合成（闞夏月，2023）。關(guān)于G8H基因，已有研究表明，該基因參與生物堿（Wang et al.，2010；Soltani et al.，2020）、類黃酮（Sung et al.，2011）和萜類物質(zhì)（趙爽等，2019）等的生物合成。目前已有學(xué)者從廣藿香（Pogostemon cablin）（歐陽蒲月等，2017）、滇龍膽（Gentiana rigescens）（張曉東等，2017；周偉，2017）和蜘蛛香（Valerianajatamansi）（趙爽等，2019）等植物中克隆得到G8H基因，結(jié)果表明G8H基因的表達(dá)具有組織特異性，不同植物中G8H基因的cDNA序列長度、編碼氨基酸個數(shù)和可能參與生物合成的途徑等均存在差異。【本研究切入點】溧陽白芹是一種江蘇太湖流域具有早熟和耐寒等優(yōu)良性狀的地方品種，是水芹優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，也是水芹遺傳育種和品種改良的重要資源（張德純，2019；王月等，2021）。目前，G8H基因在多種植物中已有公開報道，暫未見有關(guān)溧陽白芹OjG8H基因的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】以空心溧陽白芹及其突變體實心溧陽白芹為試驗材料，測定其植物組織中纖維素、木質(zhì)素和類黃酮含量，通過克隆獲得2種溧陽白芹OjG8H基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實時熒光定量PCR測定組織中OjG8H基因的相對表達(dá)量，對OjG8H基因的相對表達(dá)量與纖維素、木質(zhì)素和類黃酮含量進(jìn)行相關(guān)分析，為進(jìn)一步研究OjG8H基因在溧陽白芹纖維素、木質(zhì)素和類黃酮生物合成過程中的潛在功能及溧陽白芹的品種改良提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為本課題組在江蘇省溧陽市野外采集獲得的葉柄和莖空心及葉柄和莖實心的溧陽白芹。將2種材料分別種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所蔬菜研究室人工氣候室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)參數(shù)：光照16 h、25℃，光強(qiáng)4000 lx；黑暗8 h、20℃。分別取空心、實心溧陽白芹的莖和葉柄，用液氮迅速固定，于-80℃超低溫冰箱保存。每個處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2石蠟切片制作及觀察

取空心和實心溧陽白芹莖和葉柄浸泡于甲醛—乙醇—冰醋酸（FAA）固定液（5%福爾馬林、5%冰醋酸、90%濃度為70%的乙醇）中，24 h后用70%乙醇洗滌，依次用30%、50%、70%、80%、100%乙醇浸泡45 min進(jìn)行脫水，再用100%乙醇二甲苯混合液、純二甲苯依次浸泡30min脫去乙醇后使用石蠟浸透與包埋。將樣品切成厚度4μm的切片，番紅—固綠染色液進(jìn)行染色后依次用30%、50%、70%、80%、100%乙醇進(jìn)行脫水，用二甲苯透明，最后用樹膠封片。

制作好的切片置于尼康Eclipse E100光學(xué)顯微鏡下觀察莖和葉柄組織結(jié)構(gòu)并拍照記錄。

1.3纖維素、木質(zhì)素和類黃酮含量測定

纖維素含量測定：分別稱取空心和實心溧陽白芹莖、葉柄和葉各0.1 g，按纖維素含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明提取纖維素并計算纖維素含量。

木質(zhì)素含量測定：分別取空心和實心溧陽白芹莖、葉柄和葉于80℃烘干至恒重，將干樣磨成粉末狀后過50目篩，稱取5 mg樣品，按木質(zhì)素含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說明提取木質(zhì)素并計算木質(zhì)素含量。

類黃酮含量測定：分別取空心和實心溧陽白芹莖、葉柄和葉于80℃烘干至恒重，將干樣磨成粉末狀后過50目篩，稱取0.1 g樣品，按類黃酮含量檢測試劑盒（北京盒子生工科技有限公司）說明提取類黃酮并計算類黃酮含量。

1.4總RNA提取和cDNA合成

分別取實心和空心溧陽白芹材料置于滅菌研缽中，加入液氮進(jìn)行研磨，取約0.1 g于1.5 mL離心管中，用TRIzol法提取2種溧陽白芹莖和葉柄的總RNA。使用1.5%瓊脂糖凝膠檢測總RNA的完整性，并使用NanoDrop ND-1000分光光度計檢測其總RNA濃度。利用HiScriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper，去除基因組DNA成分）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將cDNA用ddH2O稀釋15倍后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 OjG8H基因的克隆

根據(jù)課題組已有的中華水芹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（Liu et al.，2023），獲得溧陽白芹G8H基因參考序列。采用Primer Premier 5.0設(shè)計OjG8H的克隆引物（Li and Brownley，2010）。上游引物OjG8H-F：5'-ATGGAG TTTTATCTAAGCTATCTT-3'，下游引物OjG8H-R：5'-TTATTCATTCAAGGTGATGGGCACA-3'。以cDNA為模板，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系30.0μL：2×Taq Master Mix 15.0μL，上、下游引物各1.5μL，稀釋的cDNA模板2.0μL，滅菌ddH2O 10.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，進(jìn)行34個循環(huán)；72℃延伸10 min；12℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后回收目的片段，按克隆載體說明書，將目的基因連接到pMD20-T克隆載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對單菌落進(jìn)行PCR鑒定后送到南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.6 OjG8H基因的序列生物信息學(xué)分析

利用TBtools v2.096對測序結(jié)果進(jìn)行序列對比分析（Chen et al.，2023）。使用ExPASy-Translate在線軟件獲取實心與空心溧陽白芹基因編碼蛋白的序列，并進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析。利用SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測OjG8H1和OjG8H2蛋白的二級結(jié)構(gòu)并建立三級結(jié)構(gòu)模型。通過TMHMM-2.0和InterPro對蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取其他物種中G8H的同源蛋白序列，以MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）對各物種中G8H蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建（Kumar et al.，2018）。

1.7實時熒光定量PCR檢測

根據(jù)測序結(jié)果，采用Primer Premier 5.0設(shè)計熒光定量引物（Li and Brownley，2010），上游引物序列：5'-GAAGAAGAACAAGGCGTGGAAA-3'，下游引物序列：5'-TAGTCCCTCCAGGCAACCGTAT-3'。按ChamQ SYBR Color Master Mix試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）說明進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系20.0μL：2×SYBR qPCR Master Mix 10.0μL，稀釋的cDNA模板2.0μL，10μmol/μL上、下游引物各0.5μL，滅菌ddH2O 7.0μL。以水芹TPI41基因作為內(nèi)參基因，與目的基因一同擴(kuò)增，上游引物序列：5'-GGCTTAGAGTTGATGGCGTGCTTA-3'，下游引物序列：5'-GTGGCTTCTCTCCAGCAACATTC T-3'（Liu et al.，2023）。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 min；95℃5 s，55℃10 s，進(jìn)行40個循環(huán)；72℃延伸2min；8℃保存。每個樣品設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。利用2?ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計分析

用SPSS 25.0和Excel 2007進(jìn)行定量數(shù)據(jù)和物質(zhì)含量的差異顯著性分析及相關(guān)分析。

2結(jié)果與分析

2.1空心和實心溧陽白芹莖和葉柄剖面比較

觀察空心、實心溧陽白芹植株莖和葉柄的橫切面結(jié)構(gòu)切片，發(fā)現(xiàn)空心溧陽白芹莖（圖1-A和圖1-B）和葉柄（圖1-C和圖1-D）中央髓部有部分缺失，出現(xiàn)中空現(xiàn)象，而實心溧陽白芹莖（圖1-E和圖1-F）和葉柄（圖1-G和圖1-H）中部的髓部未出現(xiàn)中空。表明實心與空心溧陽白芹莖和葉柄存在明顯差異。

2.2溧陽白芹纖維素、木質(zhì)素和類黃酮含量比較

比較2種溧陽白芹各組織中纖維素含量，結(jié)果（圖2-A）顯示，葉中纖維素含量顯著高于莖和葉柄（Plt;0.05，下同），空心溧陽白芹葉柄中纖維素含量顯著高于莖，而實心溧陽白芹莖和葉柄中纖維素含量無顯著差異（Pgt;0.05，下同）。

比較2種溧陽白芹各組織中木質(zhì)素含量，結(jié)果（圖2-B）顯示，木質(zhì)素含量均為葉柄最高，莖次之，葉最少。空心溧陽白芹葉中木質(zhì)素含量為7.58 mg/g，顯著低于莖和葉柄。實心溧陽白芹葉柄中木質(zhì)素含量顯著高于莖和葉。

比較2種溧陽白芹各組織中類黃酮含量，結(jié)果（圖2-C）顯示，實心溧陽白芹葉中類黃酮含量最高，為3.59 mg/g，其次是空心溧陽白芹葉中類黃酮含量，為2.33 mg/g，空心和實心溧陽白芹葉中類黃酮含量均顯著高于莖和葉柄。

2.3 OjG8H基因克隆與序列分析結(jié)果

分別以供試溧陽白芹植株的cDNA為模板進(jìn)行目的基因OjG8H克隆，經(jīng)過凝膠電泳檢測獲得1條單一清晰條帶，且片段大小與目的條帶大小相符（圖3）。測序結(jié)果表明空心和實心溧陽白芹中的OjG8H基因序列長度均為1494bp（圖4）。

對完成測序的CDS序列進(jìn)行多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，空心溧陽白芹和中華水芹G8H序列不存在差異。空心和實心溧陽白芹OjG8H間相似度高達(dá)99.87%，僅存在2個位點差異，分別位于75和416號位點。空心溧陽白芹的75號位點上的堿基為腺嘌呤（Adenine，A），而實心溧陽白芹為胸腺嘧啶（Thy-min，T）；在416號位點上空心溧陽白芹為T，而實心溧陽白芹為A（圖5）。

比較空心、實心溧陽白芹和中華水芹的G8H基因CDS序列編碼的氨基酸序列，G8H的CDS序列均編碼497個氨基酸殘基，空心溧陽白芹OjG8H蛋白序列C端第25位氨基酸為谷氨酰胺（Glutamine，Q），第139號氨基酸為纈氨酸（Valine，V）；而實心溧陽白芹OjG8H蛋白序列C端第25位氨基酸為組氨酸（Histidine，H），第139位氨基酸為天冬氨酸（Asp-articacid，D）（圖5）。

2.4 OjG8H蛋白理化性質(zhì)預(yù)測分析結(jié)果

OjG8H蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果（表1）顯示：空心溧陽白芹OjG8H蛋白分子量為56.36 kD，理論等電點為8.32，顯堿性；不穩(wěn)定系數(shù)為32.63，屬于穩(wěn)定蛋白；平均親/疏水性指數(shù)為-0.101，屬于親水蛋白質(zhì)。實心溧陽白芹OjG8H蛋白分子量為56.39 kD，理論等電點為8.07，呈堿性；不穩(wěn)定系數(shù)為33.02，屬于穩(wěn)定蛋白；平均親/疏水性指數(shù)為-0.115，為親水蛋白質(zhì)。預(yù)測2種溧陽白芹OjG8H蛋白均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。

2.5 OjG8H蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)分析

OjG8H蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，2種溧陽白芹OjG8H蛋白的二級結(jié)構(gòu)中包含“-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，其中“-螺旋結(jié)構(gòu)占比最高，空心溧陽白芹和實心溧陽白芹中占比分別為51.11%和49.90%；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占比最低，分別為6.44%和4.63%（表2，圖6-A和圖6-C）。為進(jìn)一步了解OjG8H蛋白的三級結(jié)構(gòu)，對OjG8H蛋白進(jìn)行模型構(gòu)建（圖6-B和圖6-D），預(yù)測結(jié)果表明2種溧陽白芹的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)的組成相符。

2.6 OjG8H蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

OjG8H蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖7）表明，OjG8H蛋白第3～25位氨基酸之間有1個跨膜區(qū)，跨膜結(jié)構(gòu)域長度為22個氨基酸，屬于跨膜蛋白；蛋白的第22～491位氨基酸序列為細(xì)胞色素P450 76C4識別位點。

2.7系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

使用NCBI-BLAST功能對OjG8H基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)OjG8H氨基酸序列與大麻（Cannabis sativa）等多種物種的氨基酸序列具有較高相似性。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖8）顯示，OjG8H與赤豆（Vigna angularis）、藍(lán)星睡蓮（Nymphaea colo-rata）、胡蘿卜（Daucus carota）的G8H蛋白聚在同一支，親緣關(guān)系較近，而與日本柳杉（Cryptomeria japonica）、葡萄（Vitis vinifera）、萵苣（Lactuca sativa）等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。OjG8H與同屬傘形科的胡蘿卜（Daucus carota）的G8H親緣關(guān)系最近。

2.8 OjG8H基因相對表達(dá)量及其與纖維素、木質(zhì)素及類黃酮含量的相關(guān)性

通過實時熒光定量PCR檢測OjG8H基因在2種溧陽白芹莖、葉柄和葉中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖9）表明，OjG8H基因在2種溧陽白芹莖、葉柄和葉中均能表達(dá)，但相對表達(dá)量存在差異。2種溧陽白芹葉柄中OjG8H基因的相對表達(dá)量均高于莖和葉；實心溧陽白芹莖和葉中OjG8H基因的相對表達(dá)量顯著高于空心溧陽白芹莖和葉，而空心溧陽白芹葉柄中OjG8H基因的相對表達(dá)量顯著高于實心溧陽白芹葉柄；空心溧陽白芹葉柄中OjG8H基因的相對表達(dá)量顯著高于莖和葉，而實心溧陽白芹莖、葉柄和葉中OjG8H基因的相對表達(dá)量均無顯著差異。

對溧陽白芹莖、葉柄和葉中OjG8H基因相對表達(dá)量與纖維素、木質(zhì)素及類黃酮含量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果（表3）表明，OjG8H基因在2種溧陽白芹中的相對表達(dá)量與纖維素和木質(zhì)素含量均呈正相關(guān)關(guān)系，與類黃酮含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中與木質(zhì)素含量的相關(guān)性達(dá)顯著水平。

3討論

G8H基因已在多種植物中相繼被克隆，但還未見溧陽白芹中G8H基因克隆的報道。本研究以空心和實心溧陽白芹為材料，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)分別從空心和實心材料中克隆獲得OjG8H基因，并對產(chǎn)物進(jìn)行測序及生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明2種溧陽白芹的OjG8H基因均為1494 bp，CDS序列可編碼氨基酸數(shù)量均為497個，與前人關(guān)于川西獐芽菜（Wang et al.，2010）、滇龍膽（張曉東等，2017）和假馬齒莧（Jeena et al.，2021）等的研究結(jié)果存在差異，推測在結(jié)構(gòu)或功能上這幾種G8H蛋白存在差異。

通過序列對比發(fā)現(xiàn)，空心和實心溧陽白芹中OjG8H的CDS序列在75和416號2個位點處存在差異，2個位點的堿基差異影響了氨基酸的組成，進(jìn)而影響相關(guān)蛋白的功能。空心和實心溧陽白芹OjG8H蛋白序列C端的第25位和第139位氨基酸種類不同，推測空心和實心溧陽白芹中OjG8H蛋白結(jié)構(gòu)和功能可能存在差異，但具體差異有待進(jìn)一步試驗驗證。

對空心和實心溧陽白芹OjG8H蛋白序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其分子量、理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)、平均親/疏水性指數(shù)、二級結(jié)構(gòu)中的元件占比等均存在差異。OjG8H蛋白有跨膜結(jié)構(gòu)，屬于穩(wěn)定蛋白，與前人對滇龍膽（張曉東等，2017）和蜘蛛香（趙爽等，2019）的研究結(jié)果一致，但與廣藿香（歐陽蒲月等，2017）和滇龍膽（周偉等，2017）的研究結(jié)果存在差異；OjG8H蛋白具有親水性，與廣藿香（歐陽蒲月等，2017）和滇龍膽（周偉等，2017）相關(guān)結(jié)果一致。通過SOPMA、SWISS-MODEL在線網(wǎng)站對空心和實心溧陽白芹OjG8H蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測并構(gòu)建預(yù)測結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果顯示2個OjG8H蛋白的高級結(jié)構(gòu)存在差異。綜合上述結(jié)果，推測造成OjG8H蛋白高級結(jié)構(gòu)存在差異的關(guān)鍵可能在于蛋白序列中的2個差異堿基。

經(jīng)Plant-mPLoc在線軟件對溧陽白芹OjG8H蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示其可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，推測G8H蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮作用。已有研究顯示，長春花（Catharanthus roseus）（Guirimand et al..2009）和滇龍膽（張曉東等，2017）G10H蛋白同樣定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，本研究結(jié)果與上述結(jié)果相似，而與秦艽（Gentiana macrophylla）GmG10H亞細(xì)胞可能定位于細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)果存在差異（化文平和王喆之，2013）。可能是因為在不同植物中G8H基因有不同的功能，在物質(zhì)合成途徑中發(fā)揮不同作用，因此其亞細(xì)胞定位存在差異，但OjG8H蛋白亞細(xì)胞定位是否真正位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還有待進(jìn)一步試驗驗證。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，與OjG8H蛋白親緣關(guān)系最近的是同樣隸屬于傘形科的胡蘿卜。

本研究測定了空心和實心溧陽白芹莖和葉柄中纖維素、木質(zhì)素含量及OjG8H基因的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，相較于空心溧陽白芹，實心溧陽白芹葉柄中纖維素和木質(zhì)素含量均較低，推測實心溧陽白芹葉柄的食用口感更佳。通過比較2種溧陽白芹組織中OjG8H基因的相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，葉柄中OjG8H基因的相對表達(dá)量最高。相關(guān)分析結(jié)果表明，OjG8H基因在溧陽白芹中的表達(dá)與木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)。Liu等（2023）的研究表明，OsG8H基因在中華水芹葉片、葉柄、莖和根中均有表達(dá)，基因相對表達(dá)量在根和葉柄中最高，莖和葉片中次之，且OsG8H基因的表達(dá)與纖維素和木質(zhì)素含量呈正相關(guān)關(guān)系。由此推測在溧陽白芹的組織中，OjG8H基因參與了木質(zhì)素的合成，但其在木質(zhì)素合成途徑中是否發(fā)揮作用以及具體的作用機(jī)制還需深入研究。

4結(jié)論

本研究分別從空心和實心溧陽白芹中克隆獲得OjG8H基因，OjG8H蛋白屬于CYP超蛋白家族成員，可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，具有組織特異性；溧陽白芹中OjG8H基因可能參與木質(zhì)素的合成。

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（責(zé)任編輯：王暉）