三色堇VwF3H基因啟動(dòng)子克隆及其功能分析

摘要：【目的】探究三色堇黃烷酮-3-羥化酶基因（VwF3H）啟動(dòng)子功能，并驗(yàn)證其與花青素相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子的互作關(guān)系，為揭示F3H基因在植物花青素合成過程中的調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳匀罏檠芯坎牧希ㄟ^FPNI-PCR克隆VwF3H基因啟動(dòng)子序列，分析其功能元件、組織表達(dá)特異性及核心功能片段等，并通過酵母單雜交試驗(yàn)探究VwMYB27和VwMYB29能否與VwF3H基因啟動(dòng)子結(jié)合?！窘Y(jié)果】VwF3H基因啟動(dòng)子序列長2017 bp，含有較多光響應(yīng)元件及激素響應(yīng)元件；根據(jù)MYB等重要轉(zhuǎn)錄因子的位置，將其分為4段：VwF3H1（2017 bp）、VwF3H2（1353 bp）、VwF3H3（745 bp）和VwF3H4（446 bp）。VwF3H基因在三色堇花瓣中的相對表達(dá)量最高，顯著高于根、莖和葉片中的相對表達(dá)量（Plt;0.05，下同）。VwF3H基因啟動(dòng)子全長具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，缺失片段-2017～-1353 bp的VwF3HS2轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，缺失更多堿基的VwF3HS3和VwF3HS4則基本無轉(zhuǎn)錄活性，說明VwF3H基因啟動(dòng)子的高活性序列位于-2017～-1353 bp區(qū)域。VwF3H基因啟動(dòng)子在煙草葉片和花中啟動(dòng)GUS基因的能力不同，以花器官中的轉(zhuǎn)錄活性更強(qiáng)，說明VwF3H基因表達(dá)存在一定組織特異性；此外，VwF3H基因啟動(dòng)子在煙草中的轉(zhuǎn)錄活性明顯低于CaMV35S啟動(dòng)子，但在三色堇中的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于CaMV35S啟動(dòng)子，推測VwF3H基因還存在物種偏好性，且更適合作為三色堇花瓣轉(zhuǎn)化載體的啟動(dòng)子。VwF3H基因啟動(dòng)子的3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）自激活抑制濃度為250 mmol/L；VwMYB27與VwF3H基因啟動(dòng)子存在互作關(guān)系，而VwMYB29與VwF3H基因啟動(dòng)子無直接的互作關(guān)系?！窘Y(jié)論】VwF3H基因啟動(dòng)子在三色堇中具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，其高活性序列位于-2017～-1353 bp區(qū)域；VwF3H基因啟動(dòng)子能與VwMYB27相互作用，而參與三色堇花瓣色斑的形成。

關(guān)鍵詞：三色堇；黃烷酮-3-羥化酶基因（F3H）；啟動(dòng)子；MYB轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)：S681.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：2095-1191（2025）02-0368-10

Cloning and functional analysis of the promoter of VwF3H gene"in pansy（Viola×wittrockiana Gams）

XU Xiao-lan1，LI Jie1，XU Hui-xian1，ZHOU Yang1，ZHAO Ying1，PENG Ting2*，WANG Jian1*

（1College of Tropical Agriculture and Forestry，Hainan University/Key Laboratory of Germplasm Resources Biology of Tropical Special Ornamental Plants of Hainan/Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Forest"Trees and Ornamental Plants，Ministry of Education，Haikou，Hainan 570228，China；2College of Life Sciences， Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070，China）

Abstract：【Objective】To explore the function of the promoter of the flavanone-3-hydroxylase gene in pansy（Viola×wittrockiana Gams）（VwF3H）and verify its interaction with anthocyanin-related MYB transcription factors，which could provide reference for revealing the regulatory mechanism of F3H gene in the process of plant anthocyanin synthesis.【Method】Using pansy as the research materials，the VwF3H gene promoter sequence was cloned by FPNI-PCR，and its functional elements，tissue expression specificity and core functional fragments were analyzed.Yeast one-hybrid assay was conducted to investigate whether VwMYB27 and VwMYB29 could bind to the VwF3H gene promoter.【Result】VwF3H gene promoter sequence was 2017 bp long and contained numerous light-responsive and hormone-responsive ele-ments.Based on the positions of important transcription factors such as MYB，it was divided into 4 segments：VwF3H1（2017 bp），VwF3H2（1353 bp），VwF3H3（745 bp）and VwF3H4（446 bp）.The relative expression of VwF3H gene was the highest in pansy petals，significantly higher than in roots，stems and leaves（Plt;0.05，the same below）.The full-length VwF3H gene promoter exhibited strong transcriptional activity.The transcriptional activity of VwF3HS2，with a de-letion from-2017 to-1353 bp，was greatly reduced，while VwF3HS3 and VwF3HS4，with more bases deleted，showed almost no transcriptional activity，indicating that the high-activity sequence of the VwF3H gene promoter was located in the-2017 to-1353 bp region.The ability of the VwF3H gene promoter to drive GUS gene expression differed between to-bacco leaves and flowers，with stronger transcriptional activity in floral organs，suggesting tissue-specific expression of VwF3H gene.Additionally，the transcriptional activity of VwF3H gene promoter in tobacco was significantly lower than that of the CaMV35S promoter，but it was significantly higher than that of the CaMV35S promoter in pansy，suggesting species preference of the VwF3H gene promoter and its suitability as a promoter for petal transformation vectors in pansy.The self-activation inhibition concentration of 3-amino-1，2，4-triazole（3-AT）for VwF3H gene promoter was 250 mmol/L.VwMYB27 interacted with VwF3H gene promoter，whereas VwMYB29 did not directly interact with it.【Conclusion】VwF3H gene promoter exhibits strong transcriptional activity in pansy，with its high-activity sequence located in the-2017 to-1353 bp region.VwF3H gene promoter interacts with VwMYB27 and is involved in the formation of petal color patterns in pansy.

Key words：Viola×wittrockiana Gams；flavanone-3-hydroxylase gene（F3H）；promoter；MYB transcription factor

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32160719，32060365）；Guizhou Natural Science Foundation（ZK〔2022〕095）；Hainan Graduate Student Innovation Research Project（QHYS2022-120）

0引言

【研究意義】黃烷酮-3-羥化酶（Flavanone-3-hydroxylase，F(xiàn)3H）屬于2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶（2-ODD）家族，在三羥基黃烷酮轉(zhuǎn)化為二氫黃酮醇的過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用，是花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶（Wang et al.，2021）。啟動(dòng)子是指基因上游RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，具有多種環(huán)境響應(yīng)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元件，探究啟動(dòng)子功能對深入了解其對應(yīng)基因的表達(dá)和互作機(jī)制具有重要意義（王映紅等，2023；王佳音等，2024）。三色堇（Viola×wittrockiana Gams）為堇菜科（Viola-ceae）堇菜屬（Viola）二年生草本花卉，是我國栽培面積最大的冬春季花卉，其花色十分豐富，主要色素成分為花青素（李琴，2013），而F3H基因在花青素的形成過程中發(fā)揮重要作用，因此，研究三色堇F3H基因（VwF3H）啟動(dòng)子功能對解析VwF3H基因表達(dá)規(guī)律和調(diào)控機(jī)制，以及培育三色堇新花色品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】F3H在花青素的合成與積累過程中起關(guān)鍵作用，其活性最先在紫羅蘭（Mat-thiola incana）的酶粗提取物中得到證實(shí)（Forkmann et al.，1980），隨后在歐芹（Petroselinum crispum）（Britsch et al.，1981）和矮牽牛（Petunia hybrida）（Froe-melet al.，1985）的酶制劑或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物中也檢測到F3H，且有研究證實(shí)缺乏F3H會(huì)導(dǎo)致大麗花（Dahlia pinnata）、馬鞭草（Verbena officinalis）、百日草（Zinnia elegans）等花呈白色（Forkmann and Stotz，1984）。Nishihara等（2014）研究表明，過表達(dá)F3H基因可使夏堇（Torenia fournieri）花色發(fā)生改變；蔣寶鑫等（2023）研究證實(shí)，將比利時(shí)杜鵑（Rhododendron hybridum）的F3H基因轉(zhuǎn)入擬南芥中能增加轉(zhuǎn)基因擬南芥花青素的積累；Xu等（2023b）研究發(fā)現(xiàn)，草莓（Fragaria vesca）F3H氨基酸序列中的1個(gè)氨基酸突變會(huì)減弱其催化活性，進(jìn)而減少花青素合成，導(dǎo)致草莓果實(shí)呈粉色。相似研究結(jié)論在水稻（Oryza sativa）（Jan et al.，2021）、李（Prunus salicina）（Li et al.，2021）、毛茛（Ranunculus japonicus）（Xu etal.，2023a）等作物中也得到證實(shí)，進(jìn)一步說明F3H基因?qū)ㄇ嗨氐暮铣善痍P(guān)鍵作用。啟動(dòng)子在植物F3H基因的表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。Charrier等（1998）將苜蓿（Medicago sativa）的F3H基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入擬南芥中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F3H基因啟動(dòng)子能催動(dòng)GUS報(bào)告基因在黃酮類化合物存在的組織表達(dá)；Strygina和Khlest-kina（2022）研究證實(shí)，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)差異是引起小麥（Triticumaestivum）F3H基因組織特異性表達(dá)的主要原因之一；Bai等（2024）研究表明，茶樹（Camellia sinensis）F3Ha基因具有光響應(yīng)及激素響應(yīng)元件，受藍(lán)光或外源植物激素脅迫時(shí)能啟動(dòng)F3H基因表達(dá)，即啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)中的特殊元件對促進(jìn)F3H基因表達(dá)有重要影響。此外，MYB轉(zhuǎn)錄因子在花青素的合成過程中也發(fā)揮重要作用，主要通過與啟動(dòng)子結(jié)合而啟動(dòng)花青素合酶基因的表達(dá)。在燈盞花（Erigeron bre-viscapus）中，MYBP1通過與F3H基因啟動(dòng)子互作而促進(jìn)花青素合成（Zhao et al.，2022）；在茄子（Solanummelongena）中，MYB35能與CHS、F3H、DFR和ANS基因的啟動(dòng)子結(jié)合而調(diào)控花青素合成（Li et al.，2021）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】已有研究證實(shí)，三色堇中的VwMYB27和VwMYB29能促進(jìn)花青素合成（龔勝，2015；曾媛，2016），但具體結(jié)合哪些花青素合成酶基因啟動(dòng)子尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以克隆獲得的VwF3H基因序列為基礎(chǔ)，采用FPNI-PCR克隆其啟動(dòng)子序列，分析其功能元件、組織表達(dá)特性及核心功能片段等基本功能，并與VwMYB27和VwMYB29進(jìn)行互作分析，探究VwMYB27和VwMYB29能否與VwF3H基因啟動(dòng)子結(jié)合，為揭示F3H基因在植物花青素合成過程中的調(diào)控機(jī)制提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試三色堇為黃底紫斑品種，種植于海南大學(xué)儋州校區(qū)農(nóng)科基地。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；pMD19-T載體購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；pCAMBIA1301載體由熱帶特色花木資源生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒（DP360）和RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R333）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；GUS染色試劑盒（SL7161）購自北京酷來搏科技有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1三色堇DNA提取使用多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒抽提三色堇花葉混樣基因組DNA。

1.2.2 VwF3H基因表達(dá)分析使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒抽提三色堇根、莖、葉和花瓣的RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)VwF3H基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，以18S rDNA為內(nèi)參基因，進(jìn)行VwF3H基因組織表達(dá)差異分析，引物序列、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照曾媛（2016）的研究方法。

1.2.3目的基因啟動(dòng)子克隆非特異性擴(kuò)增引物選用FPNI-PCR提供的引物序列（Wang et al.，2011），并根據(jù)克隆獲得的VwF3H基因編碼序列（CDS）設(shè)計(jì)下游特異性引物（表1），以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照FPNI-PCR。第3輪擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，選擇條帶單一的擴(kuò)增產(chǎn)物測序。測序正確的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定陽性克隆，選擇檢測正確的菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4啟動(dòng)子序列順式作用元件分析使用Plant-CARE數(shù)據(jù)庫對三色堇F3H基因上游啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件預(yù)測分析，并通過TBtools進(jìn)行可視化。

1.2.5啟動(dòng)子截?cái)嗉氨磉_(dá)載體構(gòu)建根據(jù)Plant-CARE預(yù)測結(jié)果，將VwF3H基因啟動(dòng)子序列分為4段，采用不同引物對啟動(dòng)子片段進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)雙酶切及連接等步驟，替換pCAMBIA1301載體上的35S啟動(dòng)子，獲得重組質(zhì)粒VwF3HS1：：GUS（-2017～-1 bp）、VwF3HS2：：GUS（-1353～-1 bp）、VwF3HS3：：GUS（-745～-1 bp）和VwF3HS4：：GUS（-446～-1 bp），通過熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布于LB+卡那霉素（Kana）+利福霉素（Rif）培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.6煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒VwF3HS1：：GUS、VwF3HS2：：GUS、VwF3HS3：：GUS和VwF3HS4：：GUS的農(nóng)桿菌陽性克隆菌液接種至LB+Kana+Rif液體培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u床（200 r/min）擴(kuò)大培養(yǎng)12h；然后5000 r/min離心10 min收集菌體，使用浸染液重懸菌體至OD600 nm=0.8，室溫下放置4h。采用打孔器分別將大葉煙草的葉片和花瓣打成大小相同的小圓片，將菌液及煙草葉片和花瓣混合放入注射器中，堵住針管口，抽至最大量程，反復(fù)10次直至出現(xiàn)水漬狀，然后轉(zhuǎn)移至1.5%瓊脂培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3d。

1.2.7三色堇瞬時(shí)轉(zhuǎn)化取三色堇花瓣以打孔器打成小圓片，浸染方法與1.2.6相同。浸染后的花瓣置于1.5%瓊脂培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3d。

1.2.8 GUS染色取瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的葉片及花瓣置于2 mL離心管中，加入GUS染色液，使其全部浸沒，真空泵1 mPa抽吸10min，28℃下放置12h，取出使用75%乙醇脫色。

1.2.9酵母單雜交試驗(yàn)構(gòu)建pGADT7-VwMYB27、pGAD7T-VwMYB29和pHIS2-VwF3Hpro載體，以pHIS2-VwF3Hpro載體和pGADT7空載體共轉(zhuǎn)染酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，取5μL菌液滴于含0、10、20、30、40、50、60、70和80 mmol/L 3-氨基-1，2，4-三唑（3-AT）的SD/-Trp/-His/-Leu固體培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察不同3-AT濃度下pHIS2-VwF3HPro與pGADT7共轉(zhuǎn)染菌株的生長狀態(tài)。未見菌落生長說明自激活活性被抑制，若自激活活性未被抑制則再提高3-AT濃度，篩選出抑制自激活活性的最佳3-AT濃度。然后將pGADT7-VwMYB27和pGAD7T-VwMYB29分別與pHIS2-VwF3Hpro共轉(zhuǎn)染Y187感受態(tài)細(xì)胞，取陽性克隆菌液滴于含基因所對應(yīng)最佳抑制自激活活性3-AT濃度的SD/-THL培養(yǎng)基上進(jìn)行互作關(guān)系驗(yàn)證。

2結(jié)果與分析

2.1 VwF3H基因上游序列克隆及其啟動(dòng)子序列分析結(jié)果

從三色堇中擴(kuò)增獲得2308bp的VwF3H基因上游片段序列，測序比對分析發(fā)現(xiàn)，有291bp的序列與VwF3H基因5'端序列重合，去除重疊序列后，從基因起始密碼子起的上游序列長度為2017 bp。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，2017 bp的VwF3H基因上游序列含有89個(gè)順式作用元件（表2），包括啟動(dòng)子的必需元件TATA-box和CAAT-box等，符合一般高等植物啟動(dòng)子的特征，因此可確定為VwF3H基因啟動(dòng)子序列。所有順式作用元件可分為三大類：第一類與植物生長發(fā)育相關(guān)，占57.3%；第二類與植物激素調(diào)節(jié)相關(guān)，如脫落酸和茉莉酸等，占11.2%；第三類與非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)，如光響應(yīng)性和耐鹽性等，占31.5%。三色堇VwF3H基因啟動(dòng)子序列中包含較多光響應(yīng)元件及激素響應(yīng)元件，故推測三色堇VwF3H基因受光、外源激素及非生物脅迫等誘導(dǎo)表達(dá)。

2.2 VwF3H基因組織表達(dá)分析結(jié)果

由圖1可看出，VwF3H基因在三色堇根、莖和葉片3個(gè)部位的相對表達(dá)量較低，在花瓣的相對表達(dá)量最高，顯著高于根、莖和葉片中的相對表達(dá)量（Plt;0.05，下同）?？梢?，VwF3H基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，主要在花瓣中表達(dá)，且在花瓣中的表達(dá)效率顯著高于其他組織部位，因此后續(xù)研究主要在花瓣中進(jìn)行。

2.3 VwF3H基因啟動(dòng)子核心片段確定

根據(jù)MYB等重要轉(zhuǎn)錄因子的位置，將VwF3H基因啟動(dòng)子分為4段：VwF3H1、VwF3H2、VwF3H3和VwF3H4（圖2）。使用特異性引物擴(kuò)增獲取不同長度的VwF3H基因啟動(dòng)子核心片段，經(jīng)雙酶切及連接等操作后替換pCAMBIA1301載體上的35S啟動(dòng)子，構(gòu)建VwF3H基因啟動(dòng)子5'端缺失重組質(zhì)粒VwF3HS1：：GUS、VwF3HS2：：GUS、VwF3HS3：：GUS和VwF3HS4：：GUS，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，單菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，VwF3H基因啟動(dòng)子核心片段VwF3H1、VwF3H2、VwF3H3、VwF3H4大小分別為2017、1353、745和446 bp（圖3）。

2.4煙草和三色堇的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化結(jié)果

以重組質(zhì)粒VwF3HS1：：GUS、VwF3HS2：：GUS、VwF3HS3：：GUS和VwF3HS4：：GUS分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片和花瓣，以CaMV35S啟動(dòng)子為對照。GUS染色結(jié)果顯示：CaMV35S啟動(dòng)子在煙草葉片中具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，VwF3HS1全長啟動(dòng)子在煙草葉片的葉脈中有微弱活性，而其他5'端缺失的短截序列在煙草葉片中均不具備轉(zhuǎn)錄活性（圖4-A）；同樣，CaMV35S啟動(dòng)子在煙草花瓣中具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，VwF3HS1全長啟動(dòng)子也具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，VwF3HS2和VwF3HS3的轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，而VwF3HS4幾乎沒有轉(zhuǎn)錄活性（圖4-B）。以相同方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化三色堇花瓣，GUS染色結(jié)果表明，CaMV35S啟動(dòng)子具有一定的轉(zhuǎn)錄活性，但明顯低于在煙草葉片和花瓣中的轉(zhuǎn)錄活性；VwF3HS1全長啟動(dòng)子在三色堇花瓣中的轉(zhuǎn)錄活性很強(qiáng)，明顯高于CaMV35S啟動(dòng)子。此外，GUS活性隨缺失片段長度的增加而逐漸降低，VwF3HS2的轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，而VwF3HS3和VwF3HS4基本無轉(zhuǎn)錄活性（圖4-C），說明VwF3H基因啟動(dòng)子的高活性序列位于-2017～-1353 bp區(qū)域。

2.5 VwF3H基因啟動(dòng)子與VwMYB27和VwMYB29互作關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果

在VwF3H基因啟動(dòng)子中預(yù)測到多個(gè)與MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的順式作用元件，故推測其與三色堇中促進(jìn)花青素形成的MYB轉(zhuǎn)錄因子存在互作關(guān)系。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，VwMYB27和VwMYB29具有促進(jìn)花青素合成的作用（龔勝，2015；曾媛，2016），因此擬通過酵母單雜交試驗(yàn)驗(yàn)證其是否能與VwF3H基因啟動(dòng)子互作，結(jié)果（圖5）顯示，3-AT濃度提高至250 mmol/L時(shí)才能有效抑制pHIS2-VwF3HPro與pGADT7共轉(zhuǎn)染菌株在SD/-Trp/-His/-Leu固體培養(yǎng)基上的生長，故確定VwF3H基因啟動(dòng)子的3-AT自激活抑制濃度為250 mmol/L。

以VwF3H為靶基因，進(jìn)一步驗(yàn)證VwMYB27和VwMYB29是否與VwF3H基因啟動(dòng)子存在互作關(guān)系，酵母單雜交試驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，陽性對照pGADT7-Rec53+pHIS2與pGADT7-VwMYB27+pHIS2-VwF3Hpro共轉(zhuǎn)染菌株均能在含250 mmol/L 3-AT的SD/-Trp/-His/-Leu固體培養(yǎng)基上生長良好，而陰性對照pGADT7+pHIS2與pGADT7-VwMYB29+pHIS2-VwF3Hpro的共轉(zhuǎn)染菌株無法在含250 mmol/L 3-AT的SD/-Trp/-His/-Leu固體培養(yǎng)基上正常生長?？梢姡琕wMYB27與VwF3H基因啟動(dòng)子存在互作關(guān)系，而VwMYB29與VwF3H基因啟動(dòng)子無直接的互作關(guān)系。

3討論

啟動(dòng)子對基因表達(dá)具有重要作用（陳榮珠，2020；唐維等，2024），因此，通過啟動(dòng)子序列分析可預(yù)測基因表達(dá)受哪些生長環(huán)境、激素及轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)控。鐘小菊等（2021）通過克隆分析斑地錦（Euphorbia maculata）F3H基因（EmF3H）啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)在EmF3H基因啟動(dòng)子序列內(nèi)含有光反應(yīng)元件、應(yīng)激反應(yīng)元件及激素反應(yīng)元件等；曹鑫嫻等（2023）通過克隆分析苦蕎（Fagopyrum tataricum）F3H基因啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)其含有大量與脫落酸、茉莉酸甲酯等激素響應(yīng)及光調(diào)控相關(guān)的順式作用元件，說明多數(shù)F3H基因均參與光照及激素等非生物脅迫應(yīng)答。本研究也發(fā)現(xiàn)，VwF3H基因啟動(dòng)子中含有較多光響應(yīng)及激素響應(yīng)元件，故推測VwF3H基因與其他植物的F3H基因一樣，響應(yīng)植物體的非生物脅迫，通過促進(jìn)花青素的積累而提高植物的抗逆能力。

啟動(dòng)子長度通常對其活性影響較大，每個(gè)啟動(dòng)子均有1個(gè)活性較強(qiáng)的核心區(qū)域，可通過啟動(dòng)子缺失片段加以研究。在沙冬青（Ammopiptanthus mon-golicus）中，通過對CIP基因啟動(dòng)子進(jìn)行缺失分析，推測MYCATERD1元件是響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵元件（Ge et al.，2024）；在木薯（Manihot esculenta）中，通過缺失分析確定MeSSIII-1基因啟動(dòng)子的-264～-1 bp區(qū)域?yàn)楹诵膮^(qū)域，而-987～-1228 bp和-488～-264 bp區(qū)域能顯著提高啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，-987～-747 bp和-747～-488 bp區(qū)域?yàn)橐种平Y(jié)構(gòu)域（Lu et al.，2024）。在本研究中，VwF3H基因啟動(dòng)子全長具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，缺失片段-2017～-1353 bp的VwF3HS2轉(zhuǎn)錄活性明顯降低，缺失更多堿基的VwF3HS3和VwF3HS4則基本無轉(zhuǎn)錄活性，說明VwF3H基因啟動(dòng)子的高活性序列位于-2017～-1353 bp區(qū)域，且該區(qū)域主要存在MYB、MRE等與MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的元件，故推測VwF3H基因表達(dá)與MYB轉(zhuǎn)錄因子密切相關(guān)，或與TATA-box核心啟動(dòng)子元件數(shù)量有關(guān)。因此，今后可通過更短的片段短截進(jìn)一步縮小高活性序列的位置。

F3H基因啟動(dòng)子序列通常具有一定的組織表達(dá)特異性，在特定器官組織中高表達(dá)。Charrier等（1998）研究發(fā)現(xiàn)F3H基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性與類黃酮積累的部位有關(guān)；趙霞（2010）研究發(fā)現(xiàn)，津田蕪菁（Brassica rape subsp.rapa）F3H基因啟動(dòng)子序列主要在轉(zhuǎn)基因煙草幼苗的葉片和葉柄部位表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，VwF3H基因啟動(dòng)子在煙草葉片和花中啟動(dòng)GUS基因的能力不同，以花器官中的轉(zhuǎn)錄活性更強(qiáng)，說明VwF3H基因表達(dá)存在一定組織特異性。此外，VwF3H基因啟動(dòng)子在煙草中的轉(zhuǎn)錄活性明顯低于CaMV35S啟動(dòng)子，但在三色堇中的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于CaMV35S啟動(dòng)子，推測VwF3H基因還存在物種偏好性。CaMV35S是目前使用較廣泛的組成型啟動(dòng)子，但也有研究報(bào)道顯示其在不同植物種類、不同器官組織、不同環(huán)境條件下的表達(dá)模式存在明顯差異（Schnurr and Guerra，2000），在煙草（Pret'Ova et al.，2001）和棉花（Sunilkumar etal.，2002）中已得到驗(yàn)證。本研究中，CaMV35S啟動(dòng)子在三色堇中的轉(zhuǎn)錄活性較低，說明其可能不適宜作為三色堇轉(zhuǎn)化載體的啟動(dòng)子，而VwF3H基因啟動(dòng)子擁有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，因此更適合作為三色堇花瓣轉(zhuǎn)化載體的啟動(dòng)子。

MYB轉(zhuǎn)錄因子能與F3H基因啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控花青素合成。在桃（Prunus persica）中，MYB10.1和MYB10.3能調(diào)控F3H基因表達(dá)，促進(jìn)花青素積累（Rahim et al.，2014）；在黃連木（Pistacia chinensis）中，MYB113能與F3H基因啟動(dòng)子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控花青素合成（Song et al.，2021）。本研究中，VwF3H基因啟動(dòng)子能與VwMYB27相互作用，VwMYB27屬于MYB家族的S4亞組，而桃的MYB10.1和MYB10.3（Rahim etal.，2014）及黃連木的PcMYB113（Song et al.，2021）屬于MYB家族的S6亞組。可見，F(xiàn)3H基因啟動(dòng)子能結(jié)合不同類型的MYB轉(zhuǎn)錄因子，與VwMYB27相近的MYB轉(zhuǎn)錄因子可能也存在類似的結(jié)合作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，VwF3H基因啟動(dòng)子與

VwMYB29無直接互作關(guān)系，說明VwMYB29并非通過VwF3H基因發(fā)揮調(diào)控花青素合成的作用，具體作用于哪些基因還需進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)說明在三色堇中MYB轉(zhuǎn)錄因子間調(diào)控較復(fù)雜，且不同亞組間的功能差異明顯。

4結(jié)論

VwF3H基因啟動(dòng)子在三色堇中具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，其高活性序列位于-2017～-1353 bp；VwF3H基因啟動(dòng)子能與VwMYB27相互作用，而參與三色堇花瓣色斑的形成。

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（責(zé)任編輯：蘭宗寶）