低溫脅迫下東南景天的生理響應及轉錄組和代謝組分析

摘要：【目的】解析低溫脅迫對東南景天生理機制、轉錄及代謝調控網絡的影響，為后續研究東南景天抗寒機制及其在鎘污染農田修復的工程應用提供科學參考。【方法】以東南景天標準苗為試驗材料，采用盆栽方法將東南景天低溫（10和-2℃）處理6 h，測定對照（22℃）及低溫處理后葉片中丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量、相對電導率、抗氧化酶活性等生理指標，并進行轉錄組和代謝組測序分析。【結果】低溫脅迫導致東南景天丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量及相對電導率極顯著增加（Plt;0.01，下同），抗氧化酶活性顯著（Plt;0.05）或極顯著提高。與對照相比，10℃低溫處理的轉錄組測序獲得7152個差異表達基因（DEGs），-2℃低溫處理獲得12972個DEGs，代謝組測序分別獲得226和228個差異累積代謝物（DAMs）。轉錄組測序分析結果表明，在低溫脅迫下，東南景天中類黃酮生物合成、MAPK信號通路、苯丙素生物合成，以及淀粉和蔗糖代謝均受明顯影響。代謝組學分析結果顯示，在低溫脅迫下，黃酮和黃酮醇生物合成、甘油磷脂代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化，以及單萜生物合成等過程發揮關鍵的調控作用。轉錄組和代謝組富集通路存在重疊，關聯分析表明戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、類黃酮生物合成及單萜合成的代謝得到增強。實時熒光定量PCR結果驗證了轉錄組數據的可靠性，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、類黃酮生物合成及單萜生物合成通路中的大多數DEGs表達極顯著上調?！窘Y論】在低溫脅迫下，東南景天生理指標發生變化，有多個轉錄和代謝通路共同響應低溫脅迫，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、類黃酮生物合成增加、單萜合成代謝增強，均對東南景天抵抗低溫脅迫發揮關鍵的調控作用。

關鍵詞：東南景天；低溫脅迫；轉錄組；代謝組

中圖分類號：S682.19文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0416-15

Physiological responses of Sedum alfredii Hance to low tempera?ture stress and analysis of transcriptome and metabolome

NIE Yang-yang1，MAO Yang2，DAI Yan-jiao3，JIANG Hui-dan3，CUI Kan3，XIE Yun-he3，HE Ai-guo3，CHEN Jin1，3*

（1College of Biology，Hunan University，Changsha，Hunan 410012，China；2Ecological and Environmental Affairs Center of Hunan，Changsha，Hunan 410014，China；3Hunan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Agroenvi- ronment in Midstream of Yangtze Plain，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Changsha，Hunan 410125，China）

Abstract：【Objective】To analyze the impact of low temperature stress on the physiological mechanisms，transcription and metabolic regulatory network of Sedum alfredii Hance，which could provide scientific reference for subsequent re-search on its cold resistance mechanisms and engineering applications in cadmium-contaminated farmland remediation.【Method】Standard seedlings of S.alfredii were used as experimental materials by employing the potted method.These seedlings were then subjected to low temperature treatments（10 and-2℃）for 6 h，control（22℃）was also set，after which physiological indicators，including the contents of malondialdehyde，soluble sugar and soluble protein，the relative electrical conductivity and antioxidant enzyme activity in the leaves，were measured.Then，the transcriptome and metabo‐lome sequencing analysis were performed.【Result】Low temperature stress led to extremely significant increase in the con‐tents of malondialdehyde，soluble sugar and soluble protein，as well as relative conductivity（Plt;0.01，the same below），and significantly（Plt;0.05）or extremely significantly increased antioxidant enzyme activity in S.alfredii.Compared with the control，7152 differentially expressed genes（DEGs）were obtained by transcriptome sequencing under 10℃low tem‐perature treatment，and 12972 DEGs were obtained under-2℃low temperature treatment.Metabolome sequencing ob‐tained 226 and 228 differential accumulated metabolites（DAMs）respectively.Under low temperature stress，transcrip‐tome sequencing analysis results showed that the pathway of flavonoid biosynthesis，MAPK signaling，phenylpropanoid biosynthesis，as well as starch and sucrose metabolism in S.alfredii were obviously impacted.Metabolomics analysis showed that the biosynthesis of flavonoids and flavonols，metabolism of glycerophospholipids，interconversion of pentose and glucuronic acid，and monoterpene biosynthesis played key regulatory roles under low temperature stress.There was overlap between transcriptome and metabolome enrichment pathways.Correlation analysis showed that the interconver‐sion of pentose and glucuronic acid，biosynthesis of flavonoids，and metabolism of monoterpene synthesis were enhanced.The results of real-time fluorescence quantitative PCR validated the reliability of the transcriptome data，and most DEGs in the pathways of pentose and glucuronide interconversion，flavonoid biosynthesis and monoterpenoid biosynthesis were significantly up-regulated.【Conclusion】Under low temperature stress，the physiological indicators of S.alfredii undergo great changes，with multiple transcriptional and metabolic pathways collectively responding to low temperature stress，in‐terconversion of pentose and glucuronic acid，increased biosynthesis of flavonoids，and enhanced monoterpenoid synthesis metabolism.These pathways play crucial regulatory roles in enabling S.alfredii to resist low temperature stress.

Key words：Sedum alfredii Hance；low temperature stress；transcriptome；metabolome

Foundation items：National Key Research and Development Program of China（2022YFD1700104-2）；Hunan Natu‐ral Science Foundation（2022JJ40212）；Hunan Project of Scientific and Technological Talents Lifting（2023TJ-N19）；Hu‐nan Scientific Research Project of Environmental Protection（HBKT-202222）

0引言

【研究意義】東南景天（Sedum alfredii Hance）是我國本土的景天科鋅/鎘超富集植物（Yang et al.，2004，2006），其芽中鎘濃度高達9000 mg/kg（Yang et al.，2004），具有很強的耐受、易位和積累大量重金屬離子能力（Lu et al.，2008；Tian et al.，2017）?；谄鋵︽k、鋅和鉛的超積累能力，東南景天具有極大的重金屬污染土壤修復應用潛力。目前已在湖南、江西（戴艷嬌等，2022）和江蘇（戴超等，2023）等地區開展了東南景天對鎘污染土壤的工程修復試驗和應用，效果顯著。東南景天最適宜的生長溫度為20～25℃，為了提高農田利用率，東南景天常作為越冬栽培的農田修復植物，但寒冷極端氣候會導致其遭受凍害，影響植株正常生長和修復效率。因此，研究東南景天在低溫脅迫下的生理響應機制，有助于進一步提升其對鎘污染農田的修復潛力。【前人研究進展】溫度制約著物種的地理分布范圍及生產能力，低溫脅迫是植物在生長和發育過程中受到的主要非生物脅迫（成京晉等，2021）。低溫脅迫破壞植物內部環境的穩態和質膜結構，降低光合作用能力，過量累積活性氧（ROS），使植物的生長發育出現遲緩甚至停滯（You and Chan，2015；Agurlaetal.，2018；Songet al.，2021）。在植物長時間的演變進化過程中，逐漸進化出一系列復雜而高效的網絡調控機制，以有效抵御低溫帶來的威脅（Dinget al.，2019）。在生理生化水平上，植物通過生成可溶性糖、脯氨酸、多胺類化合物等多種滲透調節物質來穩定細胞膜結構，并通過提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等活性清除ROS（任延靖等，2020；Hosseinifard etal.，2022）。已有不少研究采用高通量測序和組學分析揭示植物在低溫脅迫響應過程中的基因表達、蛋白質和代謝物變化。Dametto等（2015）研究發現，水稻耐寒型幼苗增強了膜轉運能力、蔗糖合成、激素和Ca2+信號途徑，而低溫敏感型水稻增加了熱休克蛋白（HSPs）和脫水素的合成，以及泛素/蛋白酶體蛋白降解途徑和多胺生物合成；da Maia等（2017）研究發現，冷處理會影響參與信號轉導、植物激素、抗氧化系統和生物脅迫等代謝途徑的基因表達；Cheong等（2019，2020）研究發現，低溫脅迫后，小麥冷敏感品種中滲透調節物質（果糖、葡萄糖和腐胺等）顯著增加以保護細胞免受凍結和水分流失，耐寒品種中不飽和脂質與飽和脂質比例的顯著增加可保護膜流動性，以更好地適應低溫；Pan等（2020）利用轉錄組數據挖掘到LTG5基因在耐寒野生稻對低溫的高耐受性中發揮作用。對24個耐寒系和22個冷敏系玉米的轉錄組分析表明，耐寒系幼苗中G蛋白偶聯受體（GPCR）、Ca2+信號途徑、蛋白激酶、ROS以及激素相關的基因被證明受到冷應激的強烈調節（Waititu et al.，2021）；冷脅迫下玉米自交系（IL85和B73）幼苗的全長轉錄組分析表明，參與ROS清除的酶類和胺代謝的轉錄本在冷馴化中起重要作用（Li et al.，2022）?！颈狙芯壳腥朦c】近年來關于東南景天的研究主要集中于對不同重金屬的富集、解毒及吸收轉運（Liu et al.，2016；Penget al.，2017；Songet al.，2022）。本研究團隊在湖南省瀏陽市某地休耕區進行的前期試驗結果顯示，東南景天移栽生長40 d后，植株干物質量、鎘含量和鎘凈移除量均有所減少。作為越冬栽培的鎘污染修復植物，東南景天在實際應用時常遭受低溫脅迫，導致植物器官受損，春季復壯時間長，影響修復效率，而目前有關東南景天響應低溫脅迫的機制研究鮮有報道?！緮M解決的關鍵問題】通過測定低溫脅迫下東南景天生理指標，采用轉錄組學和代謝組學手段，解析東南景天響應低溫脅迫的相關基因及代謝調控網絡，為東南景天的抗寒機制研究及其在鎘污染農田修復的工程應用提供科學參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

東南景天種苗來源于農業農村部長江中游平原農業環境重點實驗室環境修復植物種苗繁育基地（長沙市），為扦插繁殖30d的東南景天帶根Ⅰ和Ⅱ級種苗（戴艷嬌等，2022）。

1.2試驗設計

前期室內盆栽預試驗表明，東南景天標準苗在-2℃下處理6h后，其葉片和莖局部出現明顯凍害，因此選擇該溫度作為凍害處理條件。將東南景天標準苗轉移到裝有試驗田土壤、直徑為15 cm的盆中，每盆移栽3株，在22℃下進行16h/8 h的光/暗循環緩苗生長10 d后，分別在10和-2℃下處理6h，每處理9盆苗。分別剪取22℃（對照，CK）及在10和-2℃下處理6h的東南景天嫩葉組織，每處理取3 g，3次重復，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱，用于后續生理指標測定、轉錄組測序和代謝組檢測。

1.3生理指標測定

1.3.1相對電導率用6 mm打孔器打取10個葉片樣品放入10 mL蒸餾水中，于室溫下搖動12 h。使用DDBJ-350F數字電導率儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）測量初始電導率（E1），然后將樣品煮沸30 min并冷卻至室溫，測量最終電解質電導率（E2）。

相對電導率（%）=E1/E2×100

1.3.2抗氧化酶活性、丙二醛含量等指標將0.5 g新鮮葉片在液氮中研磨成細粉，使用磷酸緩沖液（pH 7.0）提取酶；然后將提取物在4℃下8000×g離心10 min，取上清液用于生理指標檢測?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍法測定（焦潔，2016）。根據南京建成生物工程研究所的試劑盒操作說明，分別測定SOD活性（EC 1.15.1.1；貨號A001-3-2）、POD活性（EC 1.11.1.7；貨號A084-3-1）、丙二醛含量（貨號A003-1-2）和可溶性糖含量（貨號A145-1-1）。

1.4轉錄組分析

將3個溫度處理的嫩葉組織樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行轉錄組測序。通過TRIzol法從組織樣品中提取總RNA，利用NanoDrop 2000對所提RNA的濃度和純度進行檢測，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，利用Agilent 5300片段分析儀測定RNA完整值；并利用帶有Oligo（dT）的磁珠與ployA進行A-T堿基配對，可從總RNA中分離出mRNA，用于分析轉錄組信息；最后使用Illumina NovaSeq 6000平臺進行RNA測序。原始配對末端讀數由Fastp使用默認參數進行修剪和質量控制，然后使用HISAT2軟件以定向模式將干凈的讀數分別與參考基因組進行比對。每個樣本的映射讀數由StringTie以基于參考的方法組裝。根據每百萬讀數的轉錄本（TPM）方法計算每個轉錄本的表達水平，識別不同樣本之間的差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs），用RSEM量化基因豐度。使用DEGseq進行差異表達分析。|log2 Fold Change|≥1且錯誤發現率（FDR）≤0.05（DESeq2）的DEGs被認為是差異表達顯著的基因。分別利用Goatools和KOBAS進行KEGG信號通路富集分析。

1.5代謝組分析

將3個溫度處理的嫩葉組織樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司，按照標準程序進行提取物分析、代謝物鑒定和定量。使用Agilent DB-5MS毛細管柱（30 m×250μm×0.25μm）進行代謝物分離；使用ChromaTOF V4.3x分析質譜數據，包括峰提取、基線校正、反卷積、峰積分和峰對齊。通過與內標值比較量化代謝物，并根據LECO-Fiehn Rtx5數據庫進行鑒定。將樣品中鑒定的代謝物數據矩陣上傳至Metaboanalyst（http：//www.metaboanalyst.ca/）進行統計和途徑分析。差異代謝特征根據偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）的Fold Changegt;1.5、預測變量投影重要性（VIP）gt;1而定義（Ren etal.，2022），以及基于Student T的統計顯著性。

1.6轉錄組和代謝組聯合分析

轉錄組學和代謝組學數據通過log2變換統一標準化?；赗語言與歸一化數據的相關函數評估DEGs和差異累積代謝物（Differentially accumulatedmetabolites，DAMs）之間的Pearson相關分析。使用|皮爾遜相關系數（PCC）|≥0.8的DEGs和DAMs進行KEGG信號通路富集分析。然后將分為同一組的DEGs和DAMs映射到KEGG通路圖上。

1.7實時熒光定量PCR分析

使用相同的RNA樣本在ABI 7500實時熒光定量PCR儀上對轉錄組分析樣品進行實時熒光定量PCR驗證試驗。SaACTIN1基因用作內部對照（Sang et al.，2013）。采用Primer 5.0設計所選基因的特異性引物對，引物序列見表1。使用TB Green?Premix Ex TaqTM II［寶生物工程（大連）有限公司］在20μL混合物中進行反應驗證。使用ABI 7500軟件V2.3分析基因的相對表達水平，并使用2?ΔΔCt方法進行定量，計算目標基因相對于參考基因SaACTIN1的循環閾值（CT）。使用3個獨立的生物學重復進行實時熒光定量PCR分析。

1.8統計分析

采用Excel 2007對數據進行處理和制圖，采用最小顯著差數法（LSD）對數據進行顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1低溫脅迫下東南景天的生理變化

為了深入研究東南景天在低溫脅迫下的響應機制，采用盆栽試驗對其進行10和-2℃的低溫處理，與對照（22℃）相比，10℃條件下的東南景天幼苗無明顯異常，而在-2℃條件下，植株出現明顯萎蔫（圖1）。

對幼苗進行生理指標檢測發現，隨著處理溫度的降低，東南景天抗氧化酶（SOD和POD）活性、脂質過氧化的最終產物（丙二醛）含量、滲透保護劑（可溶性糖和可溶性蛋白質）含量及相對電導率均顯著（Plt;0.05）或極顯著（Plt;0.01，下同）增加（圖2-A～圖2-F）。表明東南景天可能通過提高抗氧化防御酶活性、增加滲透保護劑含量及減輕氧化應激來實現對于低溫脅迫的響應。因此，選擇在10和-2℃條件下處理6 h的東南景天葉片作為樣本，以22℃條件下生長的東南景天作為對照，研究東南景天在低溫脅迫下轉錄組和代謝產物的響應變化。

2.2轉錄組數據整體評估及基因功能注釋結果

通過對22、10和-2°C處理的9個東南景天葉片樣品進行轉錄組測序，共獲得55.5 Gb的Clean data；GC含量為45.26%～45.63%，Q30為94.19%～95.30%（表2）。每個文庫中超81%的序列均被定位，表明獲得了高質量的RNA-Seq數據集。

通過組裝和分析數據，共獲得96353個Unige-nes，平均長度為764.95 bp，N50長度為1377 bp?；駽lean reads的位置覆蓋了基因全長的所有位置，且大部分序列可映射到獨特基因的外顯子區域，說明轉錄組測序和組裝的高質量，可用于后續差異表達分析。SA_CK、SA_10和SA_-2分別表達39829、37939和39632個基因（圖3-A）。采用主成分分析法（PCA）評估SA_CK、SA_10和SA_-2之間所有檢測基因的總體差異，3個處理可基于第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）清楚地劃分為不同區域，凸顯了低溫脅迫對東南景天中檢測基因變化的巨大影響，PC1和PC2可解釋低溫處理下55.86%的變異；此外，來自同一處理的生物學重復明顯聚集在一起，表明每個處理具有良好的重復性（圖3-B）。根據基因表達情況進行聚類分析，不同重復樣本中均包含相同或相似表達模式的基因簇，進一步說明樣本具有良好的重復性（圖3-C）。

2.3低溫脅迫下東南景天的DEGs分析結果

低溫脅迫下，植物體內各種生理生化過程被激活。為了研究基因表達與低溫脅迫之間的關系，以|log2 Fold Change|≥1且FDR≤0.05為標準，對東南景天在低溫處理后與對照的DEGs進行鑒定，結果發現，在10℃處理6 h后，分別檢測到7152個DEGs（3753個上調、3399個下調）（圖4-A）；在-2℃處理6 h后，檢測到12972個DEGs（7283個上調、5689個下調）（圖4-B）。對DEGs進行KEGG信號通路富集分析，并鑒定前20個富集通路。在10℃處理6 h后，主要富集的通路包括類黃酮生物合成（Flavo-noid biosynthesis）、內質網中的蛋白質加工（Proteinprocessing in endoplasmic reticulum）、苯丙素生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、玉米素生物合成（Zeatin biosynthesis）、脂肪酸延伸（Fatty acidelonga-tion）以及淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabo-lism）（圖5-A）；在-2℃處理6 h后，主要富集的通路包括類黃酮生物合成、MAPK信號通路（MAPK sig-naling pathway）、苯丙素生物合成、植物激素信號轉導（Plant hormone signal transduction）、淀粉和蔗糖代謝、玉米素生物合成等（圖5-B）。總之，眾多信號通路參與了東南景天低溫脅迫反應，但苯丙素生物合成和類黃酮生物合成可能是參與東南景天低溫響應的重要信號通路。

2.4低溫脅迫下東南景天代謝組數據的質量控制

通過超高效液相色譜—電噴霧電離串聯質譜聯用技術（UPLC-ESI-MS/MS）對低溫脅迫下各代謝組進行鑒定，與對照相比，以10和-2℃作為低溫處理提取的葉片樣品中，共檢測到1011種代謝物進行非靶向代謝組學分析。首先對各組間樣品進行PCA分析，結果表明，在10和-2℃處理之間存在明顯的分離現象（圖6-A）。PC1和PC2累計解釋超過70.00%的變異性，表明代謝物表達與樣本類別之間存在穩定可靠的關系。對質控（QC）樣品進行相關分析，結果顯示相關系數（R2）均接近1.00（圖6-B），表明整個分析過程具有良好的穩定性和重現性。通過構建層次聚類熱圖，并利用人類代謝組數據庫（HMDB）進行分類注釋，結果表明，在低溫脅迫條件下，脂質、類脂分子、有機氧化合物和有機酸及其衍生物相關的代謝物數量最為豐富（圖6-C）。

2.5低溫脅迫下東南景天的DAMs和KEGG代謝通路富集分析結果

基于VIPgt;1、Fold Changegt;1.5，將代謝產物篩選為DAMs。與對照相比，在10℃處理后獲得226個DAMs（圖7-A）；其中，103個DAMs上調，123個DAMs下調（圖7-B）。-2℃處理后獲得228個DAMs（圖7-A）；其中，92個DAMs上調，136個DAMs下調（圖7-C）。對DAMs進行KEGG代謝通路富集分析，并確定前20個富集通路。10℃處理后富集的前5條代謝通路為黃酮和黃酮醇生物合成（Flavone and fla-vonol biosynthesis）、甘油磷脂代謝（Glycerophospho-lipid metabolism）、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化（Pen-tose and glucuronate interconversions）、甜菜堿生物合成（Betaine biosynthesis）和單萜生物合成（Monoterpe-noid biosynthesis）（圖7-D）；-2℃處理后富集的前5條代謝通路為甘油磷脂代謝、黃酮和黃酮醇生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、單萜生物合成和鞘脂代謝（Sphingolipid metabolism）（圖7-E）。其中，黃酮和黃酮醇生物合成、甘油磷脂代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、單萜生物合成在10和-2℃處理下同時富集，表明這幾類代謝物對東南景天的低溫脅迫響應起到重要的調控作用。

2.6轉錄組和代謝組聯合分析確定東南景天在低溫脅迫下的重要途徑

基于R語言的歸一化數據和相關分析函數，對DEGs和DAMs進行Pearson相關分析。篩選|PCC|≥0.8的DEGs和DAMs，并進行KEGG信號通路富集分析，構建可能與冷應激相關的DEGs-DAMs關聯網絡。結果表明，在低溫脅迫下，轉錄組和代謝組中存在重疊的KEGG富集途徑，如戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、類黃酮生物合成和單萜生物合成通路。

在map00040網絡中，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化通路有31個DEGs和3個DAMs相連，表現出顯著的表達差異（圖8-A）。低溫脅迫后，UTP-1-磷酸葡萄糖尿苷酰轉移酶基因（TRINITY_DN16165_c0_g1）、多聚半乳糖醛酸酶基因（TRINITY_DN21989_c0_g2）和果膠酸裂解酶基因（TRINITY_DN12860_c0_g1）表達上調，而果膠酯酶基因（TRINITY_DN33290_c0_g1）、果膠酯酶抑制劑基因（TRINITY_DN12308_c0_g1）、木糖異構酶基因（TRINITY_DN4487_c0_g1）和葡萄糖醛酸激酶基因（TRINITY_DN4499_c0_g1）表達下調（圖8-B）。相應地，冷應激后相關代謝物葡糖醛酸（D-glucuronic acid）含量下降，但孕二醇3-O-葡萄糖醛酸酯（Pregnanediol 3-O-glucuronide）和乳糖醛酸（4-O-alpha-D-galactopyranuronosyl-D-galacturonic acid）含量上升（圖8-C）。

在map00941網絡中，類黃酮生物合成通路有26個DEGs和3個DAMs因低溫誘導而發生變化（圖9-A）。其中，長春堿合酶基因（TRINITY_DN14934_c0_g1）和咖啡酰輔酶A 3-O-甲基轉移酶基因（TRINITY_DN 52114_c0_g2）表達下調，而查耳酮—黃酮酮異構酶3基因（TRINITY_DN13790_c0_g1）、黃酮醇合酶/黃烷酮3-羥化酶基因（TRINITY_DN189_c0_g1）、黃酮合酶II基因（TRINITY_DN31571_c0_g1）、黃酮醇合酶基因（TRINITY_DN8214_c0_g1）、2-氧化戊二酸3-雙加氧酶基因（柚皮素）（TRINITY_DN21816_c0_g3、TRINITY_DN1321_c0_g1）表達上調（圖9-B）。代謝物中，木犀草素（Luteolin）含量下降，山柰酚（Kaemp-ferol）和柚皮苷（Naringin）含量上升（圖9-C）。

在map00902網絡中，單萜生物合成通路有9個DEGs和3個DAMs相連（圖10-A），大多數與單萜生物合成相關的DEGs在低溫脅迫后表達上調（圖10-B），而代謝物中龍膽苦苷（Gentiopicroside）含量下降，裂環馬錢子苷（Secologanin）和去氧馬錢子甙（Deoxy-loganin）含量上升（圖10-C）。

2.7 DEGs的實時熒光定量PCR驗證結果

本研究重點關注與響應低溫脅迫的代謝物呈正相關的基因，在長度超過750bp的上調基因中選擇12個DEGs進行實時熒光定量PCR分析。經10和-2℃低溫處理后，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化通路中，果膠酸裂解酶8基因（TRINITY_DN34126_c0_g1）、果膠酸裂解酶13基因（TRINITY_DN215_c0_g1）和木糖異構酶基因（TRINITY_DN4487_c0_g1）表達極顯著下調，UDP-葡萄糖6-脫氫酶3基因（TRINITY_DN9987_c0_g1）表達極顯著上調（圖11-A）；類黃酮生物合成通路中，2-氧化戊二酸3-雙加氧酶基因（柚皮素）（TRINITY_DN1321_c0_g1）、查耳酮-黃酮酮異構酶3基因（TRINITY_DN13790_c0_g1）、二氫黃酮醇-4-還原酶基因（TRINITY_DN1512_c0_g1）和推定的查耳酮-黃酮酮異構酶家族基因（TRINITY_DN296 4_c0_g1）均表達極顯著上調（圖11-B）；在單萜生物合成通路中，（+）-新薄荷醇脫氫酶樣異構體X1基因（TRINITY_DN1974_c1_g1）、（+）-新薄荷醇脫氫酶樣基因（TRINITY_DN60469_c0_g1）和短鏈脫氫酶/還原酶基因（TRINITY_DN470_c0_g1）表達極顯著上調，α-松油醇合酶基因（TRINITY_DN11296_c0_g1）表達極顯著下調（圖11-C）。實時熒光定量PCR結果與轉錄組中上述基因的表達變化基本一致，驗證了轉錄組測序結果可信，同時表明戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、類黃酮生物合成及單萜生物合成在東南景天對低溫脅迫的響應中起到重要作用。

3討論

限制東南景天鎘富集效率的因素有很多，如土壤鎘生物有效性低、生長環境不適宜、生物量小、修復效率低等。有研究表明，東南景天在冬季生長緩慢，植株中鎘含量相對較低（戴超等，2023）。前期大田移栽試驗研究結果也表明，低溫顯著降低了東南景天的生物量和植株中鎘含量，且隨溫度的降低植株生物量和鎘含量極顯著降低。這與水稻在鎘處理條件下，水稻中鎘含量與溫度變化呈正相關一致（張上都等，2021）。

低溫脅迫是植物在生長和發育過程中受到的主要非生物脅迫，植物葉片受低溫脅迫后還會發生一系列的表型和生理生化變化，如失水、萎蔫、變紫等表型變化和電解質滲漏、酶活性變化、滲透代謝物質變化等（Zhou et al.，2022；吳宇欣等，2023）。本研究中，東南景天經低溫處理后，其丙二醛和可溶性蛋白含量極顯著增加、相對電導率提高、抗氧化酶活性增加，這些指標隨處理溫度的降低而增加，并在-2℃處理條件下莖和葉片出現明顯水漬狀損傷，說明低溫脅迫對東南景天葉片細胞膜結構的完整性造成破壞，膜脂過氧化程度加重，胞內物質外流，嚴重影響植株正常生長。

可溶性糖作為植物體內的滲透保護物質，可提高細胞水勢，增加細胞持水能力，降低細胞質冰點（Brizzolara et al.，2018；Lianget al.，2022），低溫脅迫下可溶性糖含量的變化與植物的耐寒能力直接相關（Nagaoetal.，2005）。有研究報道，低溫脅迫導致野草莓中葡萄糖和果糖濃度顯著增加（Shen et al.，2022）。在水稻中的研究表明，低溫誘導半乳糖醇和棉子糖合酶基因的過度表達，可提高水稻中半乳糖醇和棉子糖的水平，賦予其更高的低溫脅迫耐受性（Shimosaka and Ozawa，2015）。外源補充棉子糖可通過調節棉子糖合成來恢復三葉橙的耐寒性（Khan et al.，2021）。此外，植物也可通過轉錄重編程和代謝物水平變化來介導低溫脅迫響應，如糖代謝信號通路、轉錄因子信號調控網絡、黃酮類信號通路等（Liu et al.，2022；Gusain et al.，2023）。本研究中，東南景天在低溫脅迫下可溶性糖含量極顯著增加。由此推測，東南景天在低溫下較高的可溶性糖積累可能有助于維持植株細胞內原生質與環境的滲透平衡，從而使其具有較強的耐冷能力。轉錄組和代謝組富集分析證實了低溫促進東南景天的糖代謝（戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化通路），大量糖代謝基因在低溫脅迫后高度表達。表明糖代謝相關基因和代謝產物可能在東南景天的耐寒性中發揮關鍵作用。

黃酮類化合物是重要的次生代謝產物，含有多種重要的生物活性物質。黃酮類化合物的幾個子類，包括黃酮醇和花青素，被認為是重要的抗氧化劑，并與各種生物效應相關。類黃酮生物合成是在多種非生物脅迫下誘導的，可保護植物免受營養缺乏（Tao et al.，2017）、重金屬脅迫（Xu etal.，2019）和其他環境脅迫。在紅砂中，紫外線-B和鹽脅迫誘導與黃酮醇生物合成相關基因的表達（Zhang et al.，2017）；此外，不少研究表明黃酮醇合成可保護植物免受高溫損害（Muhlemann et al.，2018；李川等，2020；羅素雅等，2022）。本研究鑒定了大量與類黃酮生物合成和積累相關的基因。轉錄組數據集共有26個DEGs被分配到類黃酮生物合成通路，這26個DEGs被注釋為類黃酮生物合成途徑相關基因。轉錄組分析結果也顯示，類黃酮合成相關基因在低溫處理下高表達，表明東南景天在低溫處理下，這些基因更積極地參與類黃酮生物合成以響應低溫脅迫。

環境壓力會導致植物激活防御策略并產生特化代謝物（Wen et al.，2005），而多種萜類化合物在植物防御生物和非生物脅迫中發揮作用。當受脅迫植物的光合作用速率降低導致質體底物供應有限時，可提高細胞質中形成單萜的能力；冷處理可能通過將光合固定碳從合成初級代謝物（如纖維素、木質素、脂質和蛋白質）轉移到合成特殊代謝物（如單萜和倍半萜）而起作用。Nagegowda（2010）研究證實，響應各種非生物脅迫而增強的萜類化合物通常是通過增加特定萜類化合物生物合成基因的轉錄活性來介導。Morshedloo等（2017）研究發現，羅勒經寒冷脅迫處理可提高多種單萜代謝物的積累。在本研究中，大多數與單萜生物合成相關的DEGs在低溫脅迫后表達上調。因此，推測東南景天在低溫脅迫下也通過調整單萜化合物合成相關基因表達進行響應。

4結論

低溫脅迫下，東南景天可通過調節類黃酮生物合成、MAPK信號通路、苯丙素生物合成及淀粉和蔗糖代謝，增加可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量，提高抗氧化酶活性，以提高其對低溫脅迫的耐受性。同時，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉化、類黃酮生物合成增加、單萜合成代謝增強，均對東南景天抵抗低溫脅迫發揮關鍵的調控作用。

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（責任編輯：王暉，羅麗）