侵染洋桔梗的煙草曲莖病毒分子鑒定及遺傳進化分析

摘要：【目的】明確引起廣西南寧市洋桔梗呈現(xiàn)葉脈突起、葉片皺縮的病毒病原，并對病毒分離物的遺傳進化關系進行分析，為花卉作物病毒病的綜合防控提供理論依據(jù)。【方法】以1株具有葉脈突起、葉片皺縮等典型雙生病毒癥狀的洋桔梗為研究對象，采用雙生病毒通用簡并引物（PA/PB）對洋桔梗葉片總DNA進行PCR檢測，通過設計背靠背引物（TbCSV-F/TbCSV-R）、基因克隆獲得相關病毒病原的全基因組序列，使用BLASTn對拼接序列進行比對分析，應用生物學軟件SnapGene、SDT和MEGA 7.0對相關病毒病原的全基因組序列及遺傳進化進行分析。【結果】利用PA/PB引物能從樣品中擴增出1條約500 bp的特異目的條帶，BLASTn分析發(fā)現(xiàn)，所得序列與GenBank上已登錄的煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）各分離物的核苷酸序列相似性均在91%以上，證實所采集的洋桔梗植株受到菜豆金色黃花葉病毒屬病毒侵染。利用β衛(wèi)星通用引物（β01/β02）未能擴增出條帶，證實染病的洋桔梗葉片中不存在β衛(wèi)星分子。利用TbCSV-F/TbCSV-R對感病樣品總DNA進行PCR擴增，所得產物經純化、克隆測序及序列拼接后獲得1條長度為2743 bp的病毒全基因組序列，所得序列經核苷酸序列相似性分析表明病毒分離物為TbCSV的1個分離物，命名為TbCSV-GX-YJG。氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，病毒正鏈編碼的AV1和AV2基因與TbCSV-SHJ01（GenBank登錄號：MW779539.1）的核苷酸序列和氨基酸序列相似性均最高，為100%。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，TbCSV-GX-YJG與來自于廣西（TbCSV-SHJ01）和四川（TbCSV-SC740，GenBank登錄號：MH165181.1）的分離物聚在同一個小分支，說明親緣關系較近；而與來自于云南（TbCSV-CN，GenBank登錄號：KM383752.1）、孟加拉國（TbCSV-YT8，GenBank登錄號：HG003650.1）、印度（TbCSV-WSF1和TbCSV-TC240，GenBank登錄號分別為HQ407395.1和KF551584.1）的分離物處于不同的分支，說明TbCSV分離物具有一定的進化多樣性。【結論】侵染廣西洋桔梗表現(xiàn)葉脈突起、葉片皺縮的病毒病原為菜豆金色黃花葉病毒屬的TbCSV。

關鍵詞：洋桔梗；煙草曲莖病毒；遺傳進化；廣西

中圖分類號：S436.81文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0431-10

Molecular identification and genetic evolutionary analysis of"tobacco curly shoot virus infecting Eustoma"grandiflorum（Raf.）Shinners

WANG Jing-yuan1，2，LIANG Xiao-zai2，3，XIE Hui-ting2，CHEN Jin-qing2，LI You-cong2，3，QIN Bi-xia2，MO Cui-ping2，CAI Jian-he2，ZHUYing-zhi1*，LI Zhan-biao2*

（1College of Marine and Biotechnology/Key Laboratory for International Cooperation in the Development and Utilization of Marine Biological Resources，Guangxi Minzu University，Nanning，Guangxi 530007，China；2Plant Protection Re- search Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Green Prevention and Control on Fruits and Vegetables in South China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and Insect Pests，Nanning，Guangxi 530007，China；3College of Agriculture，Guangxi University， Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】To clarify the pathogen causing Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners symptoms of raised leaf veins and crumpled leaves in Nanning，Guangxi，and to analyzed the genetic evolutionary relationship of virus isolates，which could provide theoretical basis for the prevention and control of viral diseases in flower crops.【Method】AEustoma grandiflorum（Raf.）Shinners with typical geminivirus symptoms，such as raised leaf veins and crumpled leaves，was used as the study object.The total DNA of Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners leaves was detected by PCR using geminivirus universal degenerative primers（PA/PB）.The whole genome sequence of related virus pathogens was ob-tained by designing back-to-back primers（TbCSV-F/TbCSV-R）and gene cloning.The spliced sequences were compared and analyzed by BLASTn，and the whole genome sequence and genetic evolution of related virus pathogens were ana-lyzed by biological softwares SnapGene，SDT and MEGA 7.0.【Result】PA/PB primer was used to amplify one 500 bp specific target band from the samples.BLASTn analysis showed that the nucleotide sequence similarity between the ob-tained sequences and the isolates of tobacco curly shoot virus（TbCSV）registered in GenBank was more than 91%.It was confirmed that the collected Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners plants were infected by Begomovirus virus.βsatellite universal primers（β01/β02）could not be used to amplify the bands，confirming thatβ-satellite molecules were not pre-sent in the leaves of infected Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners.Tbcsv-f/TBCSV-R was used to amplify the total DNA of infected samples by PCR.The obtained product was purified，cloned，sequenced and sequentially splicing to obtain a complete viral genome sequence with a length of 2743 bp.The nucleotide similarity analysis on the obtained sequence in-dicated that the viral isolate was a TbCSV isolate，named TbCSV-GX-YJG.Amino acid homology analysis showed that the nucleotide and amino acid sequence similarity of the positive chain encoding AV1 and AV2 genes with TbCSV-SHJ01（GenBank accession number MW779539.1）was the highest，reaching 100%.The results of evolutionary tree analysis showed that TbCSV-GX-YJG and isolates from Guangxi（TbCSV-SHJ01）and Sichuan（TbCSV-SC740，GenBank acces-sion number MH165181.1）clustered in the same small branch，indicating a close genetic relationship；and isolates from Yunnan（TbCSV-CN，GenBank accession number KM383752.1），Bangladesh（TbCSV-YT8，GenBank accession num-ber HG003650.1），India（TbCSV-WSF1 and TbCSV-TC240，Genbank accession numbers were KM383752.1 and KF551584.0）were in different branches，indicating that TbCSV isolates had certain genetic diversity.【Conclusion】TbCSV of Begomovirus is the viral pathogen that infects Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners displaying raised leaf veins and crumpled leaves in Guangxi.

Key words：Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners；tobacco curly shoot virus；genetic and evolutionary；Guangxi

Foundation items：Guangxi Key Research and Development Plan Project（Guike AB23026068）；Youth Project of Guangxi Natural Science Foundation（2024GXNSFBA010326）；Basic Research Project of Guangxi Academy of Agricul-tural Sciences（Guinongke 2021YT071，Guinongke 2024ZX08）

0引言

【研究意義】雙生病毒是一類世界范圍內廣泛流行的植物單鏈DNA病毒，可侵染多種農作物并導致嚴重減產，其危害在熱帶和亞熱帶地區(qū)尤為突出。近年來，我國南方多省份雙生病毒發(fā)生逐年加重，特別是伴隨著衛(wèi)星DNA-α和DNA-β的復合侵染會進一步加重植物的感病癥狀，預示著這類病毒可能會引起病害大暴發(fā)（張婧，2012）。由于突變、重組、假重組、捕獲外源基因等因素，雙生病毒具有變異快、寄主范圍廣等特點。廣西地處典型的亞熱帶季風氣候區(qū)，氣溫高，非常有利于雙生病毒病害的發(fā)生，目前已發(fā)現(xiàn)煙草（蒙姣榮等，2012）、辣椒（龔明霞等，2020）、番茄（蘇琴等，2021）、西番蓮（李戰(zhàn)彪等，2022）、黃瓜（高樂等，2024）等多種經濟作物以及田麻（黃家風，2005）、賽葵（黃家風，2005）、勝紅薊（王向陽，2007）等雜草受到雙生病毒的侵染，并且番茄、番木瓜等主要經濟作物受到雙生病毒侵染時部分田塊的病株率達30%～50%，嚴重時可達100%，造成嚴重的經濟損失（Yin et al.，2001；Wang et al.，2004）。2024年4月，本課題組進行植物病害調查時發(fā)現(xiàn)，作為花卉種植的洋桔梗［Eustoma grandiflorum（Raf.）Shinners］表現(xiàn)葉脈突起、葉片皺縮等疑似病毒侵染造成的典型癥狀，嚴重影響其觀感和商業(yè)價值。因此，明確侵染洋桔梗的病毒病原種類可為洋桔梗病害防控提供指導，對洋桔梗產業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】在自然界中，雙生病毒的種類繁多，共含有672個分離物、200多個獨立種，主要由昆蟲進行傳播，如葉蟬、煙粉虱、蚜蟲等；雙生病毒能侵染多種植物，包括單子葉植物和雙子葉植物（Fauquet and Stanley，2005）。雙生病毒科的病毒根據(jù)其寄主范圍、傳播媒介和基因結構等特征可分為13個屬（Nawaz-Ul-Rehman and Fauquet，2009），其中，菜豆金色黃花葉病毒屬（Begomovirus）是危害最大的一個屬，據(jù)不完全統(tǒng)計，該屬病毒至少有445種（湯亞飛等，2024）。在我國，自20世紀70年代發(fā)現(xiàn)煙粉虱傳播雙生病毒后，新病毒和新寄主陸續(xù)報道。目前，雙生病毒已成為嚴重危害我國番茄、番木瓜、辣椒、煙草、觀賞花卉等作物的主要病毒病害，且呈蔓延態(tài)勢。Li等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，造成廣東賽葵產生曲葉、卷曲等癥狀的病原為廣東賽葵曲葉病毒（Malvastrum leaf curl guangdong virus，MLCuGdV）；班菲雪（2020）揭示了雙生病毒復合侵染在田間會造成更嚴重的經濟損失；王國芬等（2021）首次報道國內多地木薯（Manihot esculenta）同時攜帶2種病毒；鐘靜等（2021）發(fā)現(xiàn)煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus，TbCSV）侵染云南的青蒿；李戰(zhàn)彪等（2022）發(fā)現(xiàn)侵染廣西西番蓮的病毒分別是廣東番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl Guangdong virus，PaL-CuGdv）和一品紅曲葉病毒（Euphorbia leaf curl virus，EuLCV）；羅婉笛等（2022）發(fā)現(xiàn)甘薯曲葉病毒（Sweet potato leaf curl virus，SPLCV）侵染湖北圓葉牽牛；古勤生等（2023）在河南省發(fā)現(xiàn)新德里番茄曲葉病毒（Tomato leaf curl New Delhi virus，ToLCNDV），該病毒被稱為瓜類作物的“超級病毒”，會造成毀滅性危害；喬蕊等（2024）證實勝紅薊黃脈病毒（Ageratum yellow vein virus，AYVV）侵染廣東勝紅薊，造成勝紅薊出現(xiàn)黃脈等癥狀。以上研究說明雙生病毒在我國流行面積大、寄主范圍廣，造成嚴重的經濟損失。此前，報道侵染洋桔梗的病毒至少有10種，其中雙生病毒有番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）（Yoon etal.，2017）和洋桔梗耳突曲葉病毒（Lisianthus enation leaf curl virus，LELCV）（王愿等，2023），其余病毒為菜豆黃化嵌紋病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV）（Gera and Cohen，1990）、洋桔梗條紋病毒（Lisianthus line pattern virus，LLPV）（Lisa et al.，1990）、黃瓜花葉嵌紋病毒（Cucum-ber mosaic virus，CMV）（陳慶忠等，1998）、蠶豆萎凋病毒（Broad bean wilt virus，BBWV）（沈炳男，2009）、蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）（趙佳鴻等，2009）、番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）（鄭櫻慧等，2009）、洋桔梗壞疽病毒（Lisian-thus necrosis virus，LNV）（Chen et al.，2000）等，這些病毒中以LNV造成的危害最具威脅性。【本研究切入點】近年來，廣西積極培育發(fā)展花卉產業(yè)，洋桔梗作為優(yōu)異的切花品種受到廣泛關注，多地積極種植，但對其病害的發(fā)生和危害關注較少。2024年4月，本課題組進行調查時發(fā)現(xiàn)南寧市廣西農科院院內種植的洋桔梗表現(xiàn)葉脈突起、葉片皺縮等疑似病毒侵染的典型癥狀，但引發(fā)該癥狀的病原尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】通過分子生物學手段，對疑似病毒侵染的洋桔梗總DNA進行PCR檢測和鑒定，明確引發(fā)該類癥狀的病毒病原，并利用基因克隆、序列比對和遺傳進化分析等方法獲得相關病毒病原的全基因組序列和遺傳進化關系，為花卉作物病毒病的綜合防控提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品采集2024年4月在廣西農業(yè)科學院院內發(fā)現(xiàn)1株頂部皺縮、葉片上卷、葉脈突起、葉片皺縮的洋桔梗（圖1）疑似受到雙生病毒侵染，采集具有典型癥狀的病株葉片經液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.1.2主要試劑及儀器主要試劑：DNA Ladder Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit購自北京全式金生物技術有限公司；DNA凝膠試劑盒購自蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司。主要儀器：5425R型高速臺式離心機（德國Eppendorf公司）；JXFSTPRP-24L型全自動樣品快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；HWS-24型恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；DNP-9162型恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏有限公司）；T100型PCR儀（美國Bio-Rad公司）；NanoDrop超微量分光光度計（美國ThermoFisher Scientific公司）。

1.2植物總DNA提取

采用CTAB法提取植物總DNA。操作步驟：使用組織研磨儀研磨植物葉片至粉末狀，加入經預熱的CTAB緩沖液，使用氯仿∶異戊醇（24∶1）進行抽提，然后使用75%酒精洗滌沉淀，沉淀經室溫晾干后加入40μL滅菌水，用NanoDrop超微量分光光度計對DNA溶液進行質量檢測，檢測合格的樣品進行PCR檢測或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3洋桔梗樣品病毒檢測

利用雙生病毒通用簡并引物PA/PB PA：5'-TAA TATTACCKGWKGVCCSV-3'/PB：5'-TGGACYTTRC AWGGBCCGCACA-3'（Khan，2000）和β衛(wèi)星分子通用引物β01：5'-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGC C-3'/β02：5'-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACA-3'（Briddon etal.，2002），以洋桔梗樣品總DNA為模板進行PCR檢測。分別以實驗室保存確定感染菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的番茄DNA、確定含有β衛(wèi)星分子的苦荬菜DNA為陽性對照，健康洋桔梗為陰性對照。PCR反應體系10.0μL：2×Phanta Max Mas‐ter Mix聚合酶5.0μL，DNA模板1.0μL，上、下游引物各0.5μL，ddH2O補足至10.0μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃30 s，52℃3 min，72℃90 s，進行32個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.4洋桔梗樣品病毒的全基因組序列克隆及分析

參考已登錄GenBank的TbCSV-SC740（GenBank登錄號：MH165181.1）的序列設計1對背靠背引物TbCSV-F：5'-GGATGTGAAGGCCCATGTAA-3'/TbCSV-R：5'-TCTAGGGACATCTGGACT-3'，以洋桔梗樣品總DNA為模板進行PCR擴增。所得PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的片段的膠塊經紫外照射快速切割，利用DNA凝膠試劑盒進行回收，將回收純化后的PCR產物連接到pEASY-Bluntzero克隆載體上，連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，均勻涂板至含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑選陽性克隆子委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定。所得序列經SeqMan拼接獲得有效序列，使用NCBI網站上Open Reading Frame Finder（ORF）工具預測病毒基因組序列的開放閱讀框（ORF），使用SnapGene對序列的基因結構進行分析，使用SDT對序列的核苷酸相似性進行分析，使用MEGA 7.0中的MegAlign對序列的氨基酸相似性進行分析，鄰接法（Neighbor-joining，NJ）進行系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建，Bootstrap設為1000次。

2結果與分析

2.1洋桔梗DNA樣品的PCR檢測結果

利用雙生病毒通用簡并引物（PA/PB）對疑似病毒感染的洋桔梗葉片總DNA進行擴增。PCR檢測結果（圖2）顯示，疑似被雙生病毒侵染的洋桔梗樣品中可擴增出1條與陽性對照相當約500bp的特異目的條帶，健康洋桔梗樣品未見特異擴增。將目的片段進行回收純化、克隆及測序。所得序列在NCBI上使用BLASTn工具進行比對分析，結果發(fā)現(xiàn)所得序列與GenBank上已登錄的TbCSV各分離物的相似性均在91%以上，其中與TbCSV-SHJ01（GenBank登錄號：MW779539.1）和TbCSV-SC740的核苷酸序列相似性較高，分別達99.87%和99.82%。結果表明所采集的洋桔梗樣品受到菜豆金色黃花葉病毒屬病毒侵染。

為明確樣品中是否含有β衛(wèi)星分子，利用β衛(wèi)星通用引物β01/β02對表現(xiàn)黃脈的洋桔梗葉片總DNA進行擴增。PCR檢測結果（圖3）顯示，除陽性對照樣品可擴增出約1.3 kb的特異目的條帶外，其余樣品中均未擴增出特異性條帶，證實疑似感病的洋桔梗葉片中不存在β衛(wèi)星分子。

2.2菜豆金色黃花葉病毒屬全序列克隆及結構分析

為獲得洋桔梗中菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的全長序列，以洋桔梗DNA為模板，利用背靠背引物TbCSV-F/TbCSV-R進行PCR擴增，對PCR產物進行電泳檢測。結果從感病樣品中獲得1條約2700 bp的條帶，PCR產物經回收純化后連接到pEASY-BluntZero克隆載體上，挑選陽性克隆測序，所得序列經拼接后共獲得2743bp的有效序列，序列經NCBI在線工具ORFfinder和SnapGene分析發(fā)現(xiàn)（圖4），所得序列具有與典型菜豆金色黃花葉病毒屬相同的基因結構：含有AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4等6個ORFs。其中在病毒鏈上含有AV1基因（位于2171～198 nt，編碼外殼蛋白，參與病毒的組裝和保護病毒顆粒）和AV2基因（位于2～358 nt，編碼病毒移動相關蛋白，具有RNA沉默抑制子的功能），在互補鏈上含有AC1基因（位于637～1722 nt，編碼復制相關蛋白，負責病毒的復制過程）、AC2基因（位于1625～2029 nt，編碼轉錄激活蛋白，參與病毒的轉錄調控）、AC3基因（位于1770～2174 nt，編碼復制增強子蛋白，增強病毒復制的能力）及AC4基因（位于788～1087 nt，編碼癥狀決定因子，影響病毒引起的癥狀類型和嚴重程度）。

2.3菜豆金色黃花葉病毒屬病毒全長基因組序列相似性分析結果

采用MegAlign的Clustal W方法進行核苷酸序列和氨基酸序列相似性比對分析，結果（表1）顯示，本研究獲得的基因組全序列與TbCSV的其他分離物具有較高的相似性，與已登錄GenBank的20個TbCSV分離物全基因組核苷酸序列相似性為91.15%～99.87%。根據(jù)國際病毒分類委員會對菜豆金色黃花葉病毒的分類標準（Zerbini et al.，2017），病毒DNA-A的核苷酸序列相似性大于91%表示是同種病毒，同種病毒成員間的核苷酸序列相似性小于94%表示為該種病毒的不同株系分離物，大于94%則屬于同一株系分離物。因此，侵染洋桔梗的雙生病毒為TbCSV的一個分離物，命名為TbCSV-GX-YJG。進一步分析發(fā)現(xiàn)，TbCSV-GX-YJG與TbCSV-SHJ01（寄主為勝紅薊）的核苷酸序列相似性最高，為99.87%；并且在病毒正鏈上編碼的AV1和AV2基因與TbCSV-SHJ01的核苷酸序列和氨基酸序列相似性均最高，為100%。TbCSV-GX-YJG與TbCSV-TCb1、TbCSV-TC240、TbCSV-WSF1（GenBank登錄號分別為JX 457342.1、KF551584.1、HQ407395.1）的核苷酸序列相似性較低，分別為92.34%、91.21%和91.15%，其中互補鏈上AC4基因與上述3個分離物的核苷酸序列和氨基酸序列相似性均較低（表1）。

利用SDT對TbCSV各分離物進一步進行核苷酸序列相似性比對分析，結果（圖5）發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的TbCSV-GX-YJG與大部分用于分析的TbCSV的分離物的核苷酸序列相似性在94.00%～99.00%，但與TbCSV-TC240、TbCSV-WSF分離物的核苷酸序列相似性最低，分別為91.21%和91.15%。

2.4菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的遺傳進化分析

為明確TbCSV-GX-YJG與已登錄GenBank的其他TbCSV各分離物的親緣關系，利用MEGA 7.0將本研究獲得的TbCSV-GX-YJG序列與GenBank上已報道的其他20個TbCSV分離物序列進行進化樹構建。結果（圖6）顯示，用于分析的各分離物分為2個大的分支，其中，分離自我國云南的TbCSV-CN（GenBank登錄號：KM383752.1）、孟加拉國的TbCSV-YT8（GenBank登錄號：HG003650.1）、分離自印度的TbCSV-WSF1（GenBank登錄號：HQ407395.1）和TbCSV-TC240（GenBank登錄號：KF551584.1）分離物單獨處于一個分支；本研究獲得的TbCSV-GX-YJG與來自于云南、廣西、四川的分離物聚在同一大支，進一步分析發(fā)現(xiàn)，TbCSV-GX-YJG與來自廣西的TbCSV-SHJ01（寄主為勝紅薊）和四川的TbCSV-SC740（寄主為菜豆）又處于同一小分支，暗示3個分離物具有較近的親緣關系。以上結果說明TbCSV各分離物具有一定的進化多樣性。

3討論

菜豆金色黃花葉病毒屬病毒是一類由煙粉虱傳播的植物病毒，在我國廣泛分布，危害經濟作物、雜草和花卉。近年來，雙生病毒已在我國26個省（市）的番茄、煙草、辣椒及花卉等作物上造成嚴重危害，而隨著煙粉虱的入侵和擴張，雙生病毒的新病毒、新寄主仍不斷被發(fā)現(xiàn)和報道。國內的研究者從多種經濟作物、雜草、花卉等植物上分離到菜豆金色黃花葉病毒屬病毒，本研究則通過分子鑒定、基因克隆和進化樹分析等方法從呈現(xiàn)葉脈突起、葉片皺縮的洋桔梗樣品中分離得到1條雙生病毒基因組序列，該序列與TbCSV各分離物的核苷酸序列相似性均大于91%，因此，認定本研究獲得的是TbCSV的一個分離物，本研究是TbCSV侵染洋桔梗的首次報道，洋桔梗是TbCSV侵染的新寄主。

TbCSV是Xie等（2002）在云南省保山市的煙草上首次發(fā)現(xiàn)。目前，該病毒在中國、緬甸、印度、孟加拉國等均有報道。TbCSV已報道可侵染多種植物，包括茄科的煙草（Xie et al.，2002）、番茄（Li et al.，2004）和辣椒（Qing et al.，2010），葫蘆科的西瓜（Zhao et al.，2017），豆科的菜豆（Li etal.，2019），菊科的青蒿（鐘靜等，2021）和勝紅薊（王向陽，2007），錦葵科的賽葵（Li etal.，2018）、黃花棯（李靜，2010）和黃蜀葵（唐美瓊和覃柳燕，2011），紫茉莉科的紫茉莉（Xiong et al.，2010）等，加上本研究的洋桔梗，諸多研究結果也證實TbCSV的寄主較廣泛，可能會給農業(yè)生產造成嚴重危害，應引起重視。

本研究擴增獲得了TbCSV-GX-YJG的全基因組序列，該分離物具有菜豆金色黃花葉病毒屬病毒典型特征的單組分病毒，不存在β衛(wèi)星分子。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，該分離物與中國廣西、四川和云南的分離物聚在同一個大支，并且具有較高的核苷酸序列相似性，說明親緣關系也較近；而與來自印度的分離物TbCSV-WSF1、TbCSV-TC240未聚在同一個大支，且核苷酸序列相似性較低；另外，全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，TbCSV-GX-YJG與來源于廣西勝紅薊的TbCSV-SHJ01分離物的核苷酸序列相似性最高，達99.87%。田間雜草通常是雙生病毒病害發(fā)生流行過程中的重要中間寄主，在菜豆金色黃花葉病毒屬病毒重組進化中起著重要作用（鐘靜等，2021）。基因重組現(xiàn)象在病毒的進化過程中普遍發(fā)生，但本研究中未發(fā)現(xiàn)重組現(xiàn)象，分析原因可能是寄主不同所致。目前已從勝紅薊、賽葵和洋桔梗上檢測出TbCSV，本研究獲得的TbCSV分離物與勝紅薊分離物親緣關系最近，有可能來源于同一祖先；且在染病樣品種植環(huán)境中發(fā)現(xiàn)有染病的勝紅薊，因此推測TbCSV可能是通過勝紅薊傳播至洋桔梗。

此前有研究報道侵染洋桔梗的雙生病毒在我國和韓國流行，韓國報道在番茄農場TYLCV大面積暴發(fā)后，隨即在洋桔梗溫室中發(fā)現(xiàn)約有5%的洋桔梗表現(xiàn)出被病毒侵染的癥狀（Yoon etal.，2017），造成一定的經濟損失；我國多個地區(qū)也報道洋桔梗因遭受病毒侵染而造成經濟損失事件，而本研究明確廣西洋桔梗受到雙生病毒科菜豆金色黃花葉病毒屬TbCSV侵染。研究證實TbCSV能侵染賽葵、黃蜀葵和黃花棯等錦葵科植物，同為錦葵科的南寧市市花朱瑾花是否也會受到TbCSV侵染值得進一步關注。且廣西地處溫潤多雨的亞熱帶季風氣候，適宜植物病毒和傳播媒介的生長繁衍，應加強監(jiān)測TbCSV等雙生病毒在作物、雜草和花卉上的發(fā)生情況，及時發(fā)現(xiàn)，做好病害預警工作，謹防因該類病毒侵染引起的病害在廣西暴發(fā)成災。

4結論

表現(xiàn)為葉脈突起、葉片皺縮的洋桔梗植株受到雙生病毒科菜豆金色黃花葉病毒屬病毒的侵染，病毒病原為TbCSV。遺傳分析發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的分離物TbCSV-GX-YJG與GenBank上已報道的TbCSV分離物均具有較高的核苷酸序列相似性。本研究是TbCSV侵染洋桔梗的首次報道，今后應加強對該類病毒的監(jiān)測及防控。

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（責任編輯：麻小燕）