不同石斛生態位差異和分子特征分析

摘要：【目的】通過分析不同石斛生態位差異和分子特征，揭示不同石斛種間的遺傳和生態關系，為石斛野生資源的保護及利用提供科學依據?！痉椒ā窟x取3種代表性的石斛（霍山石斛、鐵皮石斛和銅皮石斛）為研究對象，結合數據庫和實地調查獲取石斛在我國3個主要分布區的物種出現數據，從WorldClim數據庫獲取19個生態因子的數據，分析生態因子間的相關性，并計算3種石斛的特征生態位。對3種石斛的內部轉錄間隔區（ITS）序列進行PCR擴增和測序，并基于3種石斛的ITS序列相似性采用鄰接法構建系統發育進化樹，分析3種石斛間的系統發育關系?！窘Y果】生態因子間的相關分析結果顯示，7個主要的生態因子為年平均溫度、月平均日溫差、等溫性、年溫差、最旱季降水量和最暖季降水量。霍山石斛與鐵皮石斛和銅皮石斛的生態位重疊度較低，分別為0.95%和1.87%，表明霍山石斛具有特定需求的生態位。鐵皮石斛與銅皮石斛的生態位重疊度較高，達51.40%。對3種石斛進行兩兩比較時，生態位等價性的0假設未被拒絕（Pgt;0.05），說明盡管3種石斛目前的生態位存在差異，但三者占據相似環境生態位的可能性不能被排除，表明田間混合栽培3種石斛存在一定可行性。鐵皮石斛和銅皮石斛的重疊部分最多，說明二者的環境條件或資源共享程度最高，競爭最激烈。3種石斛樣本的ITS序列的長度為690～710 bp。系統發育進化樹分析結果顯示，鐵皮石斛獨自形成1個支持度很高的類群，而銅皮石斛和霍山石斛的個體被歸入到2個支持度較低的其他類群。【結論】相比鐵皮石斛和銅皮石斛，霍山石斛對生態因子的要求更為特定，霍山石斛和銅皮石斛的親緣關系較近。采用ITS序列分析能將鐵皮石斛從銅皮石斛和霍山石斛中區分。

關鍵詞：石斛；生態位差異；ITS序列；分子鑒定

中圖分類號：S682.31文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2025）02-0485-11

Ecological niche differences and molecular characteristics of different Dendrobium

ZHOU Run-yang，LIU Si-an*

（College of Horticulture and Landscape Architecture，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

Abstract：【Objective】By analyzing the ecological niche differences and molecular characteristics of different Dendro-bium species，the genetic and ecological relationships among different Dendrobium species were revealed，which provided scientific basis for the protection and utilization of Dendrobium wild resources.【Method】Three representative Dendro-bium（D.huoshanense，D.officinale and D.moniliforme）were selected as research subjects.Species occurrence data for these Dendrobium species in 3 major distribution areas in China were obtained through a combination of database informa-tion and field surveys.Data on 19 ecological factors were retrieved from the WorldClim database.The correlations among these ecological factors were analyzed，and the characteristic niches of the 3 Dendrobium species were calculated.The internal transcribed spacer（ITS）sequences of the 3 Dendrobium species were amplified and sequenced using PCR.Based on the similarity of the ITS sequences of the 3 Dendrobium species，a phylogenetic tree was constructed using the Neighbor-joining method to analyze their phylogenetic relationships.【Result】The correlation analysis of ecological factors revealed that the 7 major ecological factors were annual mean temperature，monthly mean diurnal temperature range，isothermality，annual temperature range，precipitation of the driest season，and precipitation of the warmest season.The niche overlap between D.huoshanense and the other 2 species，D.officinale and D.moniliforme，was relatively low，at 0.95%and 1.87%respectively，indicating that D.huoshanense had a specific ecological niche requirement.In contrast，the niche overlap between D.officinale and D.moniliforme was high，reaching 51.40%.When the 3 Dendrobium species were compared in pairwise，the 1 hypothesis of niche equivalence was not rejected（Pgt;0.05）.The 3 Dendrobium spe-cies had different ecological niches at present，the possibility that they occupied similar environmental niches could not be ruled out，which indicated that the mixed cultivation of the 3 Dendrobium species in the field was feasible.The overlap of D.officinale and D.moniliforme was the most，which indicated that the environmental conditions or resource sharing de-gree of the two was the highest，and the competition was the most intense.The length of ITS sequence of the 3 Dendro-bium species ranged from 690 to 710 bp.Phylogenetic tree results showed that species alone formed 1 highly supported group，while the individuals of D.moniliforme and D.huoshanense were grouped into 2 other groups with low support.【Conclusion】Compared with D.officinale and D.moniliforme，D.huoshanense"has more specific requirements for eco-logical factors.D.huoshanense and D.moniliforme are more closely related.ITS sequence analysis can distinguish D.offi-cinale from D.moniliforme and D.huoshanense.

Key words：Dendrobium；ecological niche differences；ITS sequences；molecular identification

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32001341）

0引言

【研究意義】石斛是蘭科第二大屬石斛屬的統稱，包含大約1500種多年生草本植物，主要分布在熱帶和亞熱帶地區（da Silva et al.，2016）。石斛屬名來源于希臘語dendron（樹）和bios（生命），指在石墻或樹上附生生長的植物（Cheng et al.，2019）。截至目前，在我國秦嶺山脈以南地區共發現80余種石斛，其中約40種為藥用石斛（Feng et al.，2014；Zheng et al.，2018）。鐵皮石斛（Dendrobium offici-nale）、銅皮石斛（D.moniliforme）和金釵石斛（D.nobile）已被證實對治療如陰傷和目不清等疾病具有療效（Mou et al.，2021），這3種石斛已被列為我國國家一級保護植物（da Silva and Ng，2017）。通過對石斛的化學成分、藥理作用和臨床應用的持續研究，發現其含有倍半萜、生物堿、多糖、黃酮等化合物（李燕等，2010；Chen et al.，2016；Wang et al.，2019b）。此外，不同石斛在化學成分和臨床應用上有很大差異（Hu etal.，2012；Meng et al.，2013）。由于石斛獨特的藥用價值，近年來市場需求穩步增長，野生石斛資源日益枯竭，刺激了石斛溫室栽培技術的快速發展（Ding et al.，2018）。然而，研究表明野生石斛中含有的目標化合物濃度遠高于溫室種植的石斛，因此在野外條件下栽培石斛尤為重要（Yuan et al.，2020）。不同野生石斛在我國分布的區域不同，因此推測不同石斛對氣候的要求存在差異（Lokho，2013）。如霍山石斛主要分布于安徽霍山（易善勇等，2021），鐵皮石斛在貴州有較大面積種植，尤其是黔西南、黔東南、黔南、銅仁和遵義等地區（文大成等，2022），目前針對鐵皮石斛的研究較多（劉惠芳等；2023；楊秋悅等）?；羯绞―.huoshanense）被譽為“九大仙草”之首，具有極高的藥用價值和保健功效，被視為珍貴中藥材（蔡明等，2024）。由于霍山石斛對生態環境要求嚴格，加之長期采集，導致野生植株瀕臨滅絕（劉石泉等，2006）。同時，市場供需不平衡導致劣質石斛與優質石斛混雜（包雪聲等，2001）。因此研究不同石斛間的生態位差異并開發快速準確的物種鑒定技術，對石斛野生資源的保護，石斛產業的質量控制及可持續發展具有重要意義。【前人研究進展】物種賴以生存的環境決定了該物種的生態位（R?dder and L?tters，2009）。更廣泛地說，生態位包括物種種群在空間和時間上所占據的位置和與相關種群的功能關系及在生態系統中發揮的作用。具有相似功能生態位但分布在不同地理區域的2個生物體，可被稱為生態等價物。氣候作為環境因素對植物的生長及分布影響極大，不同的氣候常導致資源可用性差異，反過來又會導致物種生態位分化和特定植被空間分布模式的形成。近年來，基于生態原理和地理信息系統（GIS）技術的生態位分析已被廣泛用于研究動物和植物生態位占有程度以及物種分布預測等方面。例如，Villaverde等（2017）通過使用生態位重疊分析和物種分布建模等技術，證實北半球的雙極莎草在南美洲的定植涉及氣候生態位的頻繁轉變，并且未來氣候變化可能會減少適宜棲息地的可用性。此外，R?dder和L?tters（2009）通過對歐洲和北美生態位進行分析，結果發現地中海壁虎（Hemidac-tylus turcicus）生態位保守程度在不同預測因子和變量之間存在顯著差異。研究表明，氣候變化會對動植物的生態位產生不利影響，從而改變物種間的生態位差異或物種生態位分化的方向。山葛（Puera-ria montana）入侵美國西部時，暴露于新氣候導致其生態位發生了復雜、動態的變化，生態位模型預測美國西部存在葛藤尚未占據的適宜氣候棲息地（Cal-lenetal.，2015）。由于氣候變化，喜馬拉雅山地區樺樹的分布范圍和生態位受到顯著影響，預計糙皮樺（Betula utilis）的高度適宜區域將向喜馬拉雅山東部地區轉移，而適宜性向西部地區下降（Hamid et al.，2019）。由于在干燥等加工過程中會明顯改變中藥材的形狀、顏色、氣味和其他形態特征，導致消費者難以準確識別中藥材并評估其質量（Chen et al.，2017）。此外，在非繁殖階段，基于形態特征區分石斛十分困難（Wang et al.，2018）。近年來，分子標記技術和DNA序列分析在植物產地識別和中藥材鑒定中發揮了重要作用。內部轉錄間隔區（ITS）是位于18S rRNA與26S rRNA基因之間的間隔DNA，包含5.8S rRNA編碼區（Yipetal.，2007），具有快速進化、片段長度短（大多數被子植物lt;700 bp）以及由于協同進化而在不同重復單元之間保持一致性的優點（Li etal.，2011）。ITS已被廣泛用于研究較低分類水平的植物系統發育，包括相關屬和從屬物種之間的關系（R?nsted et al.，2005）。Yang等（1999）通過對18S～25S rDNA的ITS進行測序，探討了十字花科4個族9個屬的系統發育關系，發現蘿卜屬與黑芥的親緣關系比與甘藍、白菜更近。此外，ITS測序也可用于識別中藥及其假冒產品。根據當歸、玄參根等藥材及其作為摻假材料的相似物種在ITS序列上的差異可以區分合法中藥材和假冒材料，克服了依賴顏色和形狀等不可靠指標識別藥材的缺點（Feng et al.，2010；Lee et al.，2010）。【本研究切入點】目前，有關石斛的研究主要集中在其化學成分和藥理活性等方面，而針對不同石斛鑒定的研究鮮見報道，且尚未見有關不同石斛生態位差異的比較研究報道?！緮M解決的關鍵問題】選取3種代表性的石斛（霍山石斛、鐵皮石斛和銅皮石斛），通過生態位模型分析3種石斛在自然環境中的生態位差異。對不同石斛樣本的ITS序列進行擴增和測序，探索其在分子水平上的遺傳差異，為鑒定石斛不同物種，揭示石斛間的遺傳和生態關系及其野生資源保護和利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

選取生長于安徽同濟生生物科技有限公司溫室（31°51′26″N，116°33′20″E；海拔36.0 m）的3種代表性石斛（霍山石斛、鐵皮石斛和銅皮石斛）為試驗材料。石斛的種子在含有5%馬鈴薯和1%添加物［1.0 mg/L萘乙酸（NAA），1.0 mg/L活性炭，20 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂］的1/2 MS培養基上發芽后，將石斛幼苗移栽到盆中并放置于溫室中培養，培養條件為溫度25～27℃，光照/黑暗12 h/12 h，相對濕度60%～70%。

1.2數據來源

從GBIF（http：//www.gbif.org/）、CVH（http：//www.cvh.org.cn/）和中國知網數據庫（http：//www.cnki.net/），并結合實地調查獲取石斛在我國3個主要分布區的物種出現數據。對數據點進行修剪，以移除具有未知地理坐標點和具有相同緯度和經度的重復點。獲得霍山石斛（56個點）、鐵皮石斛（40個點）和銅皮石斛（82個點）的出現數據點，并將其保存為.csv文件以供后續使用。

1.3生態位的生態因子變量

為分析3種石斛間的生態位差異，從WorldClim數據庫（http：//www.worldclim.org/）下載生物氣候變量。數據庫中包含1950—2000年間記錄的19個生態因子的數據，詳見表1。采用30rad/s（赤道約1公里）的空間分辨率記錄這些變量。為評估不同物種之間的生態位差異，選擇氣候作為預測因子。為避免因高共線性導致的模型性能不佳和誤導性解釋，通過分析所有變量間的相關性識別影響石斛生長和分布的環境（Dormann et al.，2013）。通過計算Spearman系數對19個生態因子間的相關性進行分析。如果相關系數≥0.8，說明在生態分析方面，該因子保留后能為生態研究提供更具實質意義的信息（Zhang et al.，2016），則保留該因子。

1.4特征生態位計算方法

使用DIVA-GIS v7.5.0從3種石斛的分布范圍中提取10000個背景點，并確定其相關的生態因子變量。參照Hamid等（2019）的方法，使用主成分分析（PCA）對3種石斛的生態位進行兩兩比較分析。將生態因子變量轉換為由第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）定義的二維空間，并使用背景數據中的最小和最大PCA作為邊界，將二維空間投影到100×100的PCA網格上。通過上述方法，能有效校正采樣偏差?；诃h境空間中出現的密度，使用生態位重疊（Schoener’s D）衡量生態位重疊程度，并進行生態位等價性和相似性的統計測試（Hamid et al.，2019）。通過1000次迭代計算生態位等效性和生態位相似性。根據兩兩比較2個石斛間生態位重疊度，采用生態位等價性測試確定二者之間的生態位差異。通過比較觀察到的Schoener’s D與0分布的重疊，對每個物種進行生態位等價性測試。如果觀察到的生態位重疊度顯著高于0分布，則拒絕生態位等價性的0假設（Hamid et al.，2019）。生態位等價性的概念因未考慮周圍環境的條件，為確定2種石斛的生態位是否相似，因此對2種石斛進行生態位相似性測試。

1.5樣本采集及DNA提取

采集新鮮的石斛葉片為樣本，每種石斛采集10份樣本共30份，樣本編號見表2。樣本儲存在4℃冰箱用于DNA提取，參照Liu等（2018）的改良十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）進行葉片總DNA提取。

1.6 PCR擴增及DNA測序

使用ITS通用引物F（5'-TTATTGATATGCTTAA ACTCAGCGGG-3'）和R（5'-CGTAACAAGGTTTCC GTAGGTGAAC-3'）對30個樣本的ITS序列進行PCR擴增。反應體系50.0μL：2×Taq PCR Mix 25.0μL，10μmol/L上、下游引物各2.0μL，500 ng/μL DNA模板1.0μL，ddH2O補足至50.0μL。擴增程序：94℃預變性4 min；94℃30 s，54℃30 s，72℃1 min，進行35個循環；72℃延伸10min。選擇部分PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。所有產物的純化和測序均委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將30個樣本的ITS序列上傳至NCBI數據庫，登錄號詳見表2。

1.7統計分析

使用R中的ecospat包進行生態位分析（Di Colaet al.，2017），使用Clustal X2.1對3種石斛的30個樣本的ITS序列進行多重比對。使用MEGA 7.0計算序列的Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離及保守位點、可變位點和簡約信息位點的數量（羅穎等，2016）。基于K2P模型采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹，Bootstrap設為1000次。

2結果與分析

2.1 3種石斛生長環境下生態因子間的相關分析結果

通過計算Spearman系數分析19個生態因子間的相關關系，由圖1可知，對3種石斛生長環境下各生態因子進行相關分析，保留7個主要的生態因子，包括年平均溫度（Bio 1）、月平均日溫差（Bio 2）、等溫性（Bio 3）、年溫差（Bio 7）、最旱季降水量（Bio 17）和最暖季降水量（Bio 18）。

2.2兩兩比較3種石斛間氣候生態位重疊度、等價性和相似性分析結果

霍山石斛和銅皮石斛之間的Schoener’s D=0.0187，說明生態位重疊度為1.87%（圖2），霍山石斛和鐵皮石斛之間的Schoener’s D=0.0095，說明二者的生態位重疊度為0.95%（圖3）。表明霍山石斛與其他2種石斛的生態位重疊較小。然而，鐵皮石斛和銅皮石斛之間的Schoener’s D=0.5140，說明二者的生態位重疊度為51.40%（圖4），表明霍山石斛對氣候的要求與鐵皮石斛和銅皮石斛明顯不同。

對3種石斛進行兩兩比較時，生態位等價性的0假設未被拒絕（Pgt;0.05）。生態位等價性和相似性測試的結果表明，盡管3種石斛目前的生態位存在差異，但三者占據相似環境生態位的可能性不能被排除，表明田間混合栽培3種石斛存在一定的可行性。此外，研究還表明，3種石斛兩兩之間均存在生態位部分重疊，鐵皮石斛和銅皮石斛的重疊部分最多，說明二者的環境條件或資源共享程度最高，競爭最激烈。

2.3 3種石斛的ITS測序分析結果

由圖5可知，利用ITS通用引物對從總DNA中提取的ITS片段進行擴增，擴增產物在約750 bp處呈現出單一亮帶，條帶清晰，表明擴增效率高，擴增效果良好，擴增子可以直接回收、純化和測序。30個ITS序列的長度為690～710 bp。在去除低質量區域和引物區域后，保留了650bp的DNA序列用于后續分析。該序列包含175個保守位點（占比26.9%）、475個可變位點（占比73.1%）和422個簡約信息位點（占比64.9%）。可變位點和保守位點的數量表明該序列具有高度變異性，同時具有一定保守性。

2.4系統發育進化樹分析結果

基于3種石斛ITS序列相似性構建系統發育進化樹，由圖6可知，鐵皮石斛獨自形成1個支持度很高的類群，而銅皮石斛和霍山石斛的樣本個體被歸入2個支持度較低的其他類群，說明采用ITS序列分析能清晰地從銅皮石斛和霍山石斛中區分鐵皮石斛樣本。

3討論

環境條件在很大程度上決定了中藥材的質量和藥用價值（Kunleet al.，2012）。石斛作為傳統中醫藥中的重要植物，棲息地的破壞導致野生石斛資源枯竭，其生長范圍在不斷縮小，因此如何實現石斛產業化生產并發揮其藥用價值，是保障石斛產業高質量發展的基礎，而研究不同石斛的生態位特征，是石斛野外或溫室栽培獲得成功的關鍵。自然生長環境與栽培環境間的相似度是決定物種能否引種成功的首要決定因素（Wang et al.，2019a），且外界環境還決定包括石斛在內中藥材質量的優劣。與其他石斛相比，霍山石斛具有更高的藥用價值，其生長環境相對較為特殊（Xu etal.，2011；Deng et al.，2016），霍山石斛主要分布在大別山腹地的霍山縣。因此，對霍山石斛開展生態位特征與環境適應性研究，對科學規劃霍山石斛的野外回歸種植區域、優化溫室栽培條件以實現其產業化生產，同時最大程度維持和提升其藥用價值，保障霍山石斛產業的高質量可持續發展具有重要參考價值。

霍山石斛和鐵皮石斛間的生態位重疊度較低，僅為0.95%，表明霍山石斛具有相對特殊的棲息地。野生霍山石斛生長在霍山縣周圍的山區，該地區季節溫差大，生長季節短，生態環境要求霍山石斛進入休眠狀態的時間較長。休眠期間，霍山石斛可以積累營養，使得其營養價值高于鐵皮石斛和銅皮石斛（Cai et al.，2003）。鐵皮石斛和銅皮石斛的生態位重疊度較高，為51.40%，表明2種石斛的生活環境相似。鐵皮石斛和銅皮石斛主要分布在我國的南部，包括安徽省、浙江省和福建省，二者的藥用價值和遺傳距離相似（Wang et al.，2018）。氣候變化和地理遷移是植物生態位差異的重要成因。在物種入侵過程中，由于地理位置的變化，生態位也可能發生改變（Guisan et al.，2014；Tingley et al.，2014），例如山葛（Pueraria montana），當其從東亞的原生棲息地入侵美國時，其生態位已發生變化（Callen et al.，2015）。但有研究表明，陸地植物入侵者中氣候生態位的變化較少發生（Petitpierre et al.，2012）。在全球不斷變化的背景下，評估1個物種的氣候生態位是否會在不同地理區域或時間段發生變化愈加重要（Guisan et al.，2014）。本研究對3種石斛進行兩兩比較，結果表明生態位等價性的0假設未被拒絕，說明盡管3種石斛目前的生態位存在差異，但三者占據相似環境生態位的可能性不能被排除。因此，在未來的氣候條件下，3種石斛的生態位重疊度可能會增加。Hamid等（2019）研究發現糙皮樺（Betula utilis）的氣候生態位預計將在未來情景中適度移動，PCA分析顯示當前和未來情景之間的氣候條件存在顯著差異，本研究結果與之相似。

石斛中富含多糖、多酚和其他代謝物（Yuan et al.，2020），需要采用不同的DNA提取方法，這些方法的提取效率差異較大（Li et al.，2006）。與傳統CTAB法相比，改良CTAB法已被證明DNA提取率更高，去除多糖雜質效果更好（Liu et al.，2018）。本研究采用改良CTAB法從3種石斛樣本中提取了總基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示提取效果較好。DNA條形碼是公認標準且相對較短的基因組DNA片段，可用于分子水平上鑒定不同物種（Bucklin etal.，2007），ITS序列是藥用植物鑒定的通用DNA條形碼序列（Panget al.，2011）。

目前，DNA條形碼雖然已被用作補充分子標記成功地識別出多個石斛，且可結合系統發育進化樹分析，驗證傳統形態學方法和分子數據的可信度。盡管如此，ITS測序也有其應用局限性，目前ITS測序尚不能完全區分所有石斛（Wang et al.，2018）。本研究對3種石斛共30個樣本進行系統發育進化樹分析，結果顯示銅皮石斛和霍山石斛的個體被歸入2個支持度較低的其他類群，與Tsai等（2004）、Wang等（2018）對多個石斛的研究結果類似。推測原因是銅皮石斛和霍山石斛在自然環境中存在生態位重疊，從而導致2種石斛的某些基因序列相似，從而在系統發育樹上表現為交叉，而朱濤等（2023）通過利用最大似然法和貝葉斯法構建43種石斛的系統發育樹，結果也發現霍山石斛和銅皮石斛的親緣關系較近。下一步研究工作將盡可能多地增加石斛種類，為驗證ITS序列是否適合作為識別石斛的DNA條形碼提供更多支持。

4結論

相比鐵皮石斛和銅皮石斛，霍山石斛對生態因子的要求更為特定。霍山石斛和銅皮石斛的親緣關系較近。采用ITS序列分析能將鐵皮石斛從銅皮石斛和霍山石斛中區分。

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（責任編輯：陳燕，李洪艷）