miR-223-3p通過靶向NLRP3恢復高血壓腦出血大鼠的認知功能

【摘要】 目的 探索miR-223-3p對高血壓腦出血大鼠認知功能恢復的影響及其調控機制。方法 構建高血壓腦出血大鼠模型，分析miR-223-3p表達和認知功能改變；過表達/敲降miR-223-3p，探討其對NOD樣受體家族含pyrin結構域3（NLRP3）炎癥小體表達和大鼠認知功能的影響；敲降NLRP3，確認該炎癥小體對腦出血大鼠認知功能的作用；通過熒光素酶實驗鑒定miR-223-3p對NLRP3的直接靶向作用。結果 高血壓腦出血大鼠的腦組織中miR-223-3p表達上調。miR-223-3p抑制NLRP3的表達，并恢復大鼠認知功能。熒光素酶實驗結果表明miR-223-3p可以直接靶向NLRP3的mRNA并下調其表達。結論 miR-223-3p通過與NLRP3的mRNA結合下調NLRP3的表達，從而恢復腦出血大鼠的認知功能。

【關鍵詞】 miR-223-3p；炎癥小體；NLRP3；高血壓；腦出血；大鼠

miR-223-3p recover cognitive function in rats with hypertensive intracerebral hemorrhage by targeting NLRP3

YU Mengqing， WU Jinbo ， LAI Zhiyong， CHEN Zhongqiang

（Emergency Medicine Center， the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China）

Corresponding author： WU Jinbo， E-mail： jinbowu1971@163.com

【Abstract】 Objective To explore the effects of miR-223-3p on cognitive function recovery in rats with hypertensive intracerebral hemorrhage （HICH） and its regulatory mechanisms. Methods The rat model of HICH was constructed to analyze changes in miR-223-3p expression and cognitive function. Subsequently， miR-223-3p was overexpressed or knocked down to investigate its effects on the expression of the inflammasome NLRP3 and cognitive function in rats. NLRP3 was then knocked down to confirm its role in cognitive function in HICH rats. Finally， a luciferase assay was performed to identify the direct targeting effect of miR-223-3p on NLRP3. Results The expression of miR-223-3p was upregulated in the brain tissues of HICH rats. miR-223-3p inhibits NLRP3 expression and recovers cognitive function in rats. The luciferase assay demonstrated that miR-223-3p could directly target the mRNA of NLRP3 and downregulate its expression. Conclusion miR-223-3p downregulates NLRP3 expression by binding to its mRNA， thereby promoting the recovery of cognitive function in rats with intracerebral hemorrhage.

【Key words】 miR-223-3p； Inflammasome； NLRP3； Hypertension； Intracerebral hemorrhage； Rats

腦出血是由腦組織中的血管破裂引起的嚴重神經疾病，其特征是高死亡率和嚴重的神經功能障礙。在美國和歐洲，腦出血約占所有中風病例的10%～15%［1］，而在亞洲，腦出血約占所有中風病例的20%～30%［2］，其中，高血壓和淀粉樣血管病占原發性腦出血的78%～88%［3］。神經炎癥在腦出血后繼發性腦損傷的病理生理機制中起著關鍵作用［4］。當血液成分釋放到實質中時，立即觸發了以炎癥細胞的動員和活化為特征的炎癥反應。神經炎癥的過度觸發可導致持續的腦損傷，如血腦屏障功能的破壞、腦水腫、神經元凋亡以及軸突變性和缺失［5-6］。近年來，NOD樣受體家族含pyrin結構域3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）炎癥小體被認為是神經炎癥的重要參與者，并被證明是促炎細胞因子分泌和后續炎癥反應的關鍵因素［7］。此外，當NLRP3炎癥小體被抑制時，由ICH引起的繼發性腦損傷減輕［8］。有報道指出，轉錄后的NLRP3受到多種微RNA（microRNAs，miRNAs）的調節［9］。miRNAs是約22個核苷酸長度的單鏈非編碼RNA分子，其識別靶信使RNA（mRNA）的3'-UTR，并誘導mRNA降解或抑制其翻譯。已發現miRNAs在多種神經疾病中失調，例如阿爾茨海默病、肌萎縮性脊髓側索硬化癥、帕金森病、亨廷頓舞蹈癥、老年性黃斑變性和多發性硬化癥［10-12］，并與高血壓患者的血管內皮功能障礙相關［13］。一項關于蛛網膜下腔出血中miRNAs表達的研究指出，數量龐大的miRNAs在出血后的表達均發生改變，其中microRNA-223-3p（miR-223-3p）表達上調［14］。然而miR-223-3p對高血壓腦出血（hypertension-induced intracerebral hemorrhage，HICH）大鼠認知功能恢復的影響及其調控機制仍然不是很清楚。

本研究構建大鼠的HICH模型，通過過表達/

敲降miR-223-3p，探討其對炎癥小體NLRP3表達和大鼠認知功能的影響；通過敲降NLRP3，確認該炎癥小體對腦出血大鼠認知功能的作用；通過熒光素酶實驗等最終確定miR-223-3p是否通過與NLRP3的mRNA結合下調NLRP3的表達，從而恢復腦出血大鼠的認知功能；旨在進一步探索miR-223-3p在HICH認知功能恢復過程中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

0.4% NaCl的大鼠飼料購自Purina（美國），大鼠膠質瘤細胞C6購自美國細胞培養收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC，美國）。過表達/敲降相關的病毒濃縮液購自擎科生物（北京）。miRNA抽提試劑盒購自SanPrep（上海），反轉錄試劑盒購自Invitrogen （美國），熒光定量PCR試劑盒購自Takara（日本）。蛋白免疫印跡相關試劑及抗體購自碧云天生物科技有限公司（北京）。Lipofectamine 2000購自Invitrogen（美國）。

1.2 研究方法

1.2.1 高血壓腦出血大鼠模型的建立

Dahl鹽敏感大鼠品系SD大鼠購于南方醫科大學實驗動物中心，隨機分為正常組和HICH組，每組5只。HICH組給予喂養Purina公司含0.4% NaCl的大鼠飼料，對照組則喂養維持正常飲食的0.23% NaCl大鼠飼料。本動物實驗經廣東醫科大學附屬醫院倫理委員會批準（批件號：2024-LL-11）。

1.2.2 細胞培養和轉染

大鼠膠質瘤細胞C6在補充有2.5%胎牛血清和15%馬血清的F-12K培養基中于37 ℃、5% CO2培養，使用0.25%的胰酶進行傳代。傳代比例為1∶2或1∶3，每周傳代2～3次。將細胞均勻鋪在24孔細胞培養板中，培養24 h后生長至孔面積的90%，使用Lipofectamine 2000進行熒光素酶報告基因相關質粒的轉染。

1.2.3 敲降與過表達實驗

敲降實驗采用10只HICH大鼠模型，隨機分為2組：sh-NC組（亂序靶位點敲降的大鼠）、sh-miR-223-3p組（敲降miR-223-3p的大鼠）。對于過表達實驗，同樣采用10只HICH大鼠模型，隨機分為2組：Control組（轉染空病毒載體的大鼠）、miR-223-3p組（轉染過表達miR-223-3p病毒載體的大鼠）。通過腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）

對大鼠進行麻醉，將稀釋到合適滴度的慢病毒溶液注射于大鼠的大腦雙側。將完成病毒侵染后的大鼠深度麻醉，取腦組織進行熒光定量PCR和蛋白免疫印跡分析。

1.2.4 熒光定量PCR

將大鼠深度麻醉并用10 mL冰冷的磷酸鹽緩沖液（phosphatic buffer solution，PBS）灌注，從顱骨中取出大腦組織，并研磨成勻漿。利用SanPrep柱式miRNA抽提試劑盒抽提大鼠腦組織的miRNA和總RNA，使用英濰捷基（Invitrogen）的SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒進行反轉錄，并用TaKaRa的Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green和TB Green Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）試劑盒進行定量分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡分析

從麻醉后的大鼠顱骨中獲取大腦并研磨成勻漿，在RIPA緩沖液中4 ℃旋轉裂解90 min。將樣品離心，收集上清液，并通過Bradford試驗對蛋白質進行定量，然后將樣品冷凍在-80 ℃或立即使用。通過4%～15% tris-甘氨酸凝膠在100 V下電泳70 min分離總蛋白，并在100 V穩壓60 min下將蛋白轉移到PVDF膜上。在TBST中用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用特定的一抗在4 ℃孵育過夜，TBST洗滌膜3次，然后與辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下溫育1 h，TBST洗滌膜3次，使用碧云天的BeyoECL Moon（極超敏ECL化學發光試劑盒）孵育30 s后顯影。使用ImageJ軟件對條帶進行灰度分析。

1.2.6 認知功能評估

使用由Sugawara等［15］開發的復合分級系統，對大鼠進行認知功能評分，取各項得分的總分，實驗組通過對比對照組進行歸一化處理。表1列出了相關項目的描述和具體得分。

1.2.7 熒光素酶活性檢測

采用TargetScan與Diana-Microt兩個軟件預測miR-223-3p潛在的靶點，綜合TargetScan與Diana-Microt兩個軟件的預測結果，初步得出miR-223-3p其中的一個假定靶點為NLRP3。從大鼠腦組織中克隆出NLRP3的野生型3'-UTR序列，插入pMIR熒光素酶報告基因載體中，同時構建miR-223-3p靶位點突變的載體，使用Lipofectamine 2000進行轉染，48 h后使用Promega的雙熒光素酶報告基因系統測定熒光素酶的活性。

1.3 統計學方法

使用 SPSS 19.0 和GraphPad Prism 10.0進行統計分析。計量資料用表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。以雙側P lt; 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 高血壓大腦出血大鼠的miR-223-3p表達情況

在成功構建HICH大鼠模型后，檢測大鼠腦組織中miR-223-3p的表達變化。通過定量PCR發現，在HICH大鼠中miR-223-3p的表達上調（1.06±0.21 vs. 1.71±0.25），見圖1。

2.2 miR-223-3p抑制NLRP3表達并恢復認知功能

敲降HICH大鼠中miR-223-3p后發現，NLRP3的表達上調（mRNA：1.02±0.18 vs. 2.63±0.33；蛋白：1.12±0.15 vs. 3.44±0.36，圖2A～C），大鼠認識能力下降（1.03±0.25 vs. 0.35±0.06，圖2G）。然而，在過表達miR-223-3p的HICH大鼠中，隨著炎癥小體NLRP3的表達下調（mRNA：1.11±0.18 vs. 0.43±0.13；蛋白：1.06±0.22 vs. 0.45±0.16，圖2D～F），認知功能恢復（1.02±0.18 vs. 1.96±0.15，圖2H）。結果表明，HICH大鼠中表達上調的miR-223-3p可以下調炎癥小體NLRP3的表達，可能對大鼠認知功能的恢復發揮積極作用。

2.3 NLRP3的敲降恢復了腦出血大鼠的部分認知功能

上述結果表明HICH大鼠中miR-223-3p對炎癥小體的表達抑制和大鼠認知功能恢復發揮了積極作用。然而，miR-223-3p是否通過抑制NLRP3表達并恢復部分認知功能進而發揮調控作用，其中受到表達抑制的NLRP3對HICH大鼠的影響還需要進一步驗證。對HICH大鼠中的NLRP3進行了敲降，同樣發現大鼠的認知功能得到了一定恢復（0.96±0.17 vs. 1.46±0.11），見圖3。該結果與過表達miR-223-3p后相類似，表明miR-223-3p可以通過抑制NLRP3的表達提高HICH大鼠的認知功能。

2.4 熒光素酶實驗驗證miR-223-3p直接靶向NLRP3

通過生物信息學方法分析miR-223-3p的作用靶點，結果表明，miR-223-3p在NLRP3 mRNA的3'-UTR 區域存在結合位點（圖4A），NLRP3極有可能是miR-223-3p的一個作用靶點。雙熒光素酶報告實驗結果發現，共轉染miR-223-3p后，含有miR-223-3p結合靶位點的熒光素酶載體活性降低（1.09±0.12 vs. 0.28±0.05），當把該位點進行突變之后，熒光素酶活性得到一定的恢復（1.11±0.08 vs. 0.97±0.08），見圖4B。該結果表明，miR-223-3p可以直接靶向NLRP3的mRNA，下調NLRP3的表達。

3 討 論

本研究以建立的HICH大鼠模型為對象，探究了炎癥小體NLRP3在腦出血大鼠認知功能恢復中的作用，結果表明，在HICH大鼠的腦組織中，炎癥反應相關的負調控因子miR-223-3p表達上調，miR-223-3p通過靶向腦組織中的炎癥小體NLRP3的mRNA 3'-UTR，降低了出血腦組織中NLRP3的表達水平，最終使HICH大鼠的認知功能得到一定恢復。

腦出血的原發性腦損傷通常發生在發病的最初幾個小時內，由血腫的形成引起，導致鄰近腦組織因壓迫而受到機械損傷［16］。盡管對腦出血患者進行手術清除血腫可以降低顱內壓，但是在以往的臨床試驗中并未顯示出很好的治療效果［17］。原因可能是手術血腫清除不能解決腦出血后的繼發性腦損傷。腦出血后繼發性腦損傷的病理生理學較復雜，涉及多種致病機制，如炎癥、氧化應激和凋亡［18-20］。其中，神經炎癥是繼發性腦損傷的重要源頭之一。除了促進神經元凋亡和破壞血腦屏障，神經炎癥還可以通過增加血腫周圍血腦屏障的通透性來加劇占位效應，腦組織的壓迫導致繼發性缺血，從而加速細胞死亡［21］。并且，這些細胞死亡后釋放的炎癥介質會進一步加劇神經炎癥。因此，控制腦出血后神經炎癥的發生對HICH患者的治療尤為重要。目前有多項證據表明，在腦出血模型中，選擇性NLRP3炎癥小體抑制劑可有效降低促炎細胞因子（如IL-β和IL-6）的表達，增加抗炎細胞因子（如IL-10和TGF-β）的表達［22-24］。當NLRP3炎癥小體被抑制時，腦組織中小膠質細胞表型轉變為抗炎狀態。在本研究中，NLRP3在腦出血大鼠的敲降使得大鼠認知功能恢復。這可能是由于NLRP3的減少促進了促炎因子的降低和抗炎因子的增加，導致腦組織細胞表型改變和炎癥反應下降。這一結果也提示了NLRP3作為阻斷腦出血后神經炎癥加重的潛在靶點。

miRNAs是一組高度保守的非蛋白編碼小核糖核酸，是基因表達的轉錄后調節物。它參與許多生物過程的調節，包括代謝、炎癥和癌癥。miRNAs的調控一般通過與靶基因的完全或不完全互補結合，阻止其翻譯或者進行mRNA鏈的切割，從而達到調控基因表達的目的［25］。有報道表明，miR-223-3p在NLRP3應答細胞中的表達一直很高，在預防炎癥小體的過度激活中發揮重要作用。比如，miR-223-3p在結核病患者的血液和肺組織中表達上調［26］，miR-223-3p缺失與結核分枝桿菌感染易感性增加之間存在聯系，miR-223-3p在金黃色葡萄球菌感染中起保護作用［27］。此外，miR-146a可直接抑制脂多糖的受體Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表達，從而下調炎癥小體活性［28-29］。在本研究中，miR-223-3p在HICH大鼠中的表達也上調，這種上調的miRNA可能通過抑制腦組織中炎癥小體NLRP3的表達，保護了HICH大鼠的腦組織免受出血的繼發性炎癥損傷。

本研究存在一定的局限性：對大鼠HICH后的繼發性腦損傷只以認知功能評分進行判斷，并未進行更直觀的實驗驗證，比如CT或者病理切片的實驗；此外，單憑熒光素酶的實驗可能無法證明miR-223-3p與NLRP3 mRNA 的直接結合，加上RNA免疫共沉淀或許更有說服力。后續我們將在本研究的基礎上，繼續深入發掘HICH中miRNAs與炎癥相關的調控機制，明確miRNAs在其中發揮的作用以及調控方式，為臨床上尋找HICH的治療靶點提供一定理論依據。

利益沖突聲明：本研究未受到企業、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。

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（責任編輯：鄭巧蘭）