飼糧添加高蛋白牧草對黔東南小香雞腸道菌群的影響

摘要：本試驗旨在研究黔東南小香雞在林下養殖過程中飼糧中添加不同牧草對雞腸道微生物菌群的影響。選擇180只60日齡初始體重相近的健康黔東南小香雞，隨機分為3組，每組3個重復，每重復20只雞。對照組（A組）飼喂基礎飼糧，試驗組在基礎飼糧的基礎上分別添加200-/0白三葉草（B組）和20%光葉紫花苕（C組），預飼期5d，正式試驗期56 d。試驗結束后，收集試驗雞盲腸內容物，并通過高通量測序檢測盲腸中微生物組成。結果表明，與A組相比較，B組和C組黔東南小香雞腸道微生物可操作分類單元（OTUs）數量均有所增加，特有OTUs數量分別增加35. 36%、3.31%。各處理間Simpson指數、Shannon指數均無差異顯著性；B組Chaol指數有所增加，但與A組差異不顯著，c組Chaol指數較A組顯著增加（P＜0.05）；c組ACE指數顯著高于A組和B組：B、C組Phocaeicola屬、擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）和吉米菌屬（Gemmiger）相對豐度均有所增加，勞森菌屬（Lawsonibacter）相對豐度降低。線性判別分析（LEfSe）得到的標記性物種A組有10個，B組11個，C組5個。綜上，本試驗條件下，基礎飼糧中分別添加20%白三葉草和20%光葉紫花苕可改變黔東南小香雞腸道微生物區系組成，提高細菌群落豐富度，增加Phocaeicola屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌相對豐度，進而促進雞腸道健康。

關鍵詞：黔東南小香雞；牧草；高通量測序；腸道微生物

中圖分類號：S831.5 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0102-06

貴州屬于典型的山區省份，山地和丘陵面積占總面積的92.5%，特色農業發展具有巨大潛力和廣闊前景。近年來，貴州大力發展特色優勢農業產業，推動現代山地特色高效農業快速發展，林下生態養雞已成為貴州生態家禽產業中的重點發展板塊。為開拓貴州喀斯特地區的可利用資源，林草優化配置已成為林下生態養殖中不可替代的角色。林下雞養殖是一種立體生態養殖模式，該模式充分利用林下資源，實現生態種養循環，其產出的綠色健康的肉蛋產品已形成相對穩定的市場，滿足了人們對高肉蛋品質的追求，兼顧生態效應與生產效益。黔東南小香雞為我國稀有優良小型地方雞種，屬貴州省地方保護品種資源之一，主產于貴州省榕江、從江和黎平縣。黔東南州氣候溫和、雨量充足、植被覆蓋率高，為發展林下養殖提供了良好的生態環境。黔東南小香雞于1985年編入《貴州省畜禽品種志》，具有耐粗飼、覓食力強、適應性強等特點，同時具有較高的營養價值與藥用功效，具有良好的發展前景和巨大的市場潛力。由于飼養管理粗放，林下養雞普遍存在飼養生產周期較長、飼料需求量較大、飼養成本高等問題，將牧草應用于家禽飼糧中部分取代精飼料，是解決這一問題的可行方法。因此，開辟質優價廉的牧草飼料原料，緩解生態家禽養殖中飼料原料緊缺等問題，降低飼養成本，生產安全、綠色、健康禽產品成為生態家禽產業可持續發展的重要課題。

白三葉草具有高蛋白、低纖維、易消化、適口性好等特點，還含有多種活性成分，可調節動物胃腸道功能，增強免疫力，有效預防便秘，因此成為畜禽養殖的優質牧草。光葉紫花苕具有莖汁柔嫩、產量高、營養豐富而全面等特點，是反芻動物、豬、雞等畜禽的理想飼料蛋白原料。目前，對白三葉草和光葉紫花苕的研究多集中在種植模式、飼喂評價方面，對畜禽腸道微生物菌群的影響研究較少。本研究以黔東南小香雞為試驗對象，探究在基礎飼糧中添加高蛋白牧草白三葉草和光葉紫花苕對其盲腸微生物菌群的影響，以期為白三葉草和光葉紫花苕作為黔東南小香雞飼糧添加牧草的科學飼喂提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

光葉紫花苕、白三葉草草種分別購于貴州省草業研究所、貴州省草地技術試驗推廣站，由養殖戶種植、采挖、飼喂。

1.2 試驗動物與設計

采用單因子隨機試驗設計，選取體重相近、健康無病的60日齡黔東南小香雞180只，隨機分為3組，每組3個重復，每重復20只。A組飼喂基礎飼糧，B組和C組分別在基礎飼糧干物質基礎上添加20%白三葉草、20%光葉紫花苕。試驗期共6ld（2023年6月10日-8月9日），其中預飼期5d，正式試驗期56 d。

1.3 飼養管理

飼養試驗在從江縣兩料村的養殖場進行，飼料購自臨桂漓源糧油飼料有限責任公司，飼料主要營養水平如表1所示。試驗期間，試驗雞每日上午8：00和下午17：00進食，自由飲水，白天在林間固定區域內自由活動，晚上集中歸巢。

1.4 樣品采集及腸道微生物菌群測定

無菌操作收集各試驗組雞盲腸糞便，置于液氮保存。按照DAN提取試劑盒（OMEGA SoilDNA Kit M5635 - 02）說明書提取所有樣品總DNA，分別使用Nanodrop 2000和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和完整性。以質量合格的DNA為模板，利用細菌16S rRNA V3-V4區特異性引物338F（5＇- ACTCCTACGGGAGGCAG-CA-3＇），806R（5＇- GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3＇）進行PCR擴增。擴增體系（50 μL）：2×Phan-to Max Master Mix 25μL，引物338F和806R各2μL，DNA模板30μL，ddH2O補足至50μL。擴增程序：94℃預變性5 min：94℃變性30 S，55℃退火45 S，72℃延伸45 S，30個循環；72℃延伸10min。使用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫進行質檢，合格的文庫由上海派森諾生物科技股份有限公司采用Illumina NovaSeq高通量測序平臺進行16S rRNA高通量測序。

1.5 數據統計與分析

利用fastp軟件對質控前和質控后的測序數據質量進行統計，采用Kraken2算法與Kaiju軟件對數據庫進行物種注釋分析。基于OTUs聚類結果，利用Qiime軟件進行樣本復雜度分析。

2 結果與分析

2.1 序列拼接質控與OTUs聚類分析

經Illumina NovaSeq測序分析得到A、B、C組雞腸道微生物平均原始序列分別為44 212 875、48 720 347條和44 151 582條，有效序列分別為43 673 620、48 123 073條和43 589 725條，目標序列分別為42 985 091、47 802 538條和43 443 359條。由圖l可見，A、B、C組聚類OTUs數分別為1 868、2 001個和1 905個，特有OTUs的數量表現為B＞C＞A，B、C組較A組分別增加36.36%、3.31%，3個組共有OTUs數為1 495個。說明飼喂白三葉草和光葉紫花苕可調節黔東南小香雞腸道微生物豐度。

2.2 不同牧草對黔東南小香雞腸道菌群Alpha多樣性的影響

隨著測序深度和樣本序列數量不斷增加，OTUs數量逐漸趨于平緩，說明樣本量充足，測序數據合理，能夠較好地反映各試驗組菌群信息（圖2）。Simpson指數和Shannon指數反映樣本中細菌群落物種多樣性，值越大說明群落物種多樣性越豐富：Chaol指數和ACE指數反映樣本中細菌群落物種豐富度，值越大說明群落中物種總數越多。由表2可見，各處理組Simpson指數、Shannon指數均無顯著差異；與A組相比較，B組Chaol指數有所增加，但差異不顯著，C組Chaol指數顯著增加（P＜0.05）；C組ACE指數顯著高于A組和B組。

2.3 不同牧草對黔東南小香雞腸道菌群Beta多樣性的影響

PCoA分析可直觀體現樣本內或樣本間的差異，在坐標軸上的投影距離越近，表明樣本在相應維度中的群落組成越相似。對各組黔東南小香雞腸道內容物菌群多樣性數據進行PCoA分析，結果（圖3）顯示，第1個主坐標軸和第2個主坐標軸分別解釋數據22.7%和15.9%的方差。A組和C組間的投影距離較近，B組與A組節點之間的距離較長，說明這3種飼喂模式下黔東南小香雞腸道細菌菌群結構發生了改變。

2.4 不同牧草對黔東南小香雞腸道菌群相對豐度的影響

由表3可見，在門水平上，各組黔東南小香雞盲腸中優勢菌群均為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota），其中厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度較高，占微生物總量的83 070以上。與A組相比，B組厚壁菌門相對豐度增加2.85%，C組則降低6.79%：B、C組擬桿菌門相對豐度分別增加8.03%和14.35%;B、C組擬桿菌門／厚壁菌門比值分別較較A組增加5.04%、22. 68%。對相對豐度排名前10的屬進行分析可知，屬水平上的優勢物種為Phocaeicola屬和擬桿菌屬（Bacteroides）；與A組相比，B、C組Phocaeicola屬、擬桿菌屬（Bacteroides）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）和吉米菌屬（Gemmiger）相對豐度均有所增加，勞森菌屬（Lawsonibacter）的相對豐度降低。說明飼糧添加不同牧草可調節黔東南小香雞腸道微生物菌群相對豐度。

2.5 不同處理黔東南小香雞腸道菌群LEfSe分析

由LEfSe篩選結果（圖4）可見，在LDA值＞4水平上，共發現26個菌群結構有差異。A組中有10個標記性物種，隸屬于1個綱、2個目、2個科、2個屬和3個種，以密螺旋體目（Treponematales）、密螺旋體科（Treponemataceae）和密螺旋體屬（Treponema_F）為主；B組中有II個標記性物種，隸屬于1個門、1個綱、1個目、2個科、2個屬和4個種，以文肯菌科（Rikenellaceae）、另枝菌屬（Al-istipes）、彎曲菌門（Campylobacterota）為主；C組中有5個標記性物種，隸屬于1個屬和4個種，以Merdivivens sp.、Bacteroides intestinipullorum 和Li-m2soma faecipullorum為主。以上結果說明，飼喂白三葉草和光葉紫花苕可明顯改變黔東南小香雞腸道菌群結構，并改變特征微生物種類。

3 討論與結論

隨著我國家禽業向著產業化、規模化方向快速發展，環境約束、抗生素耐藥性、人畜爭糧等問題日益突出。飼料支出作為畜禽生產過程中最主要成本之一，其價格直接影響養殖戶的經濟效益。隨著節糧型畜牧業發展實施需要和貴州林下經濟高質量發展力度的提高，選擇牧草替代部分精飼料飼喂家禽對實現生態家禽產業可持續發展具有深遠意義。貴州省適宜的氣候條件使得牧草資源豐富。優質的飼料牧草蛋白質含量高、營養豐富。以草養禽實現循環養殖，不僅可提高資源利用率，還可以保護環境。用牧草替代部分精飼料，不僅可以降低養殖成本，提高經濟效益，而且能生產出優質的禽產品。同時，通過篩選綠原酸等生物活性物質含量高的牧草，提高家禽生長性能、免疫力和抗氧化能力，調節腸道微生物多樣性和豐富度，增強胃腸道功能，可有效預防胃腸道疾病。王霞霞在核桃林下種植白三葉草、黑麥草和鴨茅草不同組合養雞可改善雞的生長性能和屠宰性能，增加草地生長能力和恢復能力。

白三葉草為豆科多年生草本植物，具有易種植、利用年限長、營養豐富、適口性好等特點，其主要營養物質為維生素和植物蛋白。研究表明，白三葉草初花期和開花期粗蛋白含量較高，可達24%以上，是各種畜禽的優質青綠飼料。鄒建華研究發現，在育肥豬基礎飼料中添加20%的白三葉草粉可增加豬肉中的粗蛋白含量，改善豬肉品質：譚劍蓉等通過添加40%的白三葉草粉可顯著提高肉兔血液IgM、IgA及IgG水平，料重比較對照組降低5.15%。林下放養模式下在飼料中添加白三葉草對興義矮腳雞生長性能有顯著性影響，其中80%白三葉草+20%黑麥草效果最好。光葉紫花苕為一年生或越年生草本植物，產量高、品質好、適應性強，含有豐富的氨基酸、胡蘿卜素、礦物質及多種黃酮類成分，營養價值高并具有一定的藥理活性，是牛、羊、豬、兔、禽等動物的優質飼料。育肥豬日糧中添加20%的光葉紫花苕草粉代替精料，可使料肉比降低13. 16%，瘦肉率提高3.21%。在肉雞飼料中添加10%～15%的光葉紫花苕草粉，飼料利用率提高14.3%，肉雞每千克增重飼料成本降低18.46%。

本研究表明，添加20%的白三葉草和20%的光葉紫花苕后黔東南小香雞腸道微生物OTUs數量均有所增加，特有OTUs數量分別增加35.36%、3.31%：添加200-/0的白三葉草Chaol指數有所增加，但與對照組差異不顯著，添加20%的光葉紫花苕Chaol指數顯著增加（P＜0.05）。說明添加20%的白三葉草和20%的光葉紫花苕后黔東南小香雞腸道中細菌物種數增加。厚壁菌門和擬桿菌門廣泛存在于動物的腸道中，厚壁菌門在腸道中能夠幫助多糖發酵，是主要的纖維素分解菌，而擬桿菌門是主要的多糖降解利用菌，兩者共同促進宿主消化一些自身無法消化的食物，提高宿主對碳水化合物、蛋白質和其他物質的利用率，二者的平衡對維持宿主腸道微生態的穩定及宿主的健康有重要的作用。本研究中，黔東南小香雞腸道中厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度最高，占微生物總量的83%以上，添加20%的白三葉草和20%的光葉紫花苕后擬桿菌門相對豐度分別增加8.03%、和14. 35%，白三葉草組厚壁菌門相對豐度增加2.85%，兩個試驗組擬桿菌門／厚壁菌門比值分別增加5.04%和22.68%，促進小香雞對飼料的消化與吸收，進而提高其生產性能。在屬水平上，與對照組相比，試驗組Phocaeicola屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬等相對豐度有所增加。Phocaeicola屬是人與動物腸道中的一類共生菌，參與腸道免疫調節、維持屏障功能等，是維持動物機體健康的益生菌；擬桿菌屬在腸道中為有益菌，在含氮物質利用、膽汁酸及其他類固醇等生物轉化中發揮重要作用，在維持宿主腸道健康及提高宿主對營養物質的消化吸收方面有重要作用：普雷沃氏菌屬是具有降解蛋白質功能數量最多的微生物，可分泌多種酶，以提高肉、蛋等的蛋白質含量。說明添加牧草可通過提高腸道Phocaeico-la屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌相對豐度促進黔東南小香雞腸道健康。LEfSe分析結果得到A組有標記性物種10個，B組11個，C組5個，表明飼喂不同牧草可明顯改變黔東南小香雞腸道菌群結構，并改變特征微生物屬。

綜上所述，飼糧中分別添加20%的白三葉草和20%的光葉紫花苕均可調節黔東南小香雞腸道微生物豐度，提高物種多樣性，增加腸道Pho-caeicola屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌相對豐度，促進雞腸道健康。

基金項目：貴州省科技計劃項目“從江小香雞林下生態標準化養殖技術集成及示范”（黔科合支撐[2021]001）、“生態家禽養 殖全程質量安全追溯監測研究”（黔科合支撐[2023]一般039）；貴州省生態家禽產業技術體系項目“飼料與營養功能實驗室”（黔禽科發[2017]01號）