納豆激酶生產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

摘要：以實驗室保藏的納豆芽孢桿菌SIPI-W-N5為出發(fā)菌株，通過紫外誘變和DES誘變，獲得了突變株SIPI-W-N5-16，采用響應(yīng)面優(yōu)化試驗對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化。結(jié)果表明，突變株SIPI-W-N5-16較出發(fā)菌株產(chǎn)納豆激酶活力提高了149.24%，并確定了該突變株最佳搖瓶發(fā)酵配方，采用該發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵突變株SIPI-W-N5-16，其產(chǎn)納豆激酶活力較優(yōu)化前提高了104%。

關(guān)鍵詞： 納豆激酶；發(fā)酵；菌株選育；工藝優(yōu)化；響應(yīng)面試驗

中圖分類號：TQ925"文獻標識碼：A"文章編號：0488-5368（2025）02-0009-08

Breeding of Nattokinase-Producing Strains and Optimization of Fermentation Medium

WEN Wen+1， 2， HU Haifeng+3

（1. Yangling Vocational amp; Technical College， Yangling， Shaanxi 712100， China; 2. China Pharmaceutical University， Nanjing， Jiangsu"211100， China; 3. Sinopharm Health Industry Institute Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

Abstract： Using a Bacillus subtilis SIPI-W-N5 strain preserved under laboratory conditions as the starting strain， a mutant strain SIPI-W-N5-16 was obtained through ultraviolet （UV） and diethyl sulfate （DES） mutagenesis. Response surface methodology （RSM） experiments were conducted to optimize the fermentation medium for the mutant strain.The results showed that the nattokinase activity of SIPI-W-N5-16 was 149.24% higher than that of the original strain. The optimal fermentation medium for shake flask cultivation of the mutant strain was determined. Fermentation of SIPI-W-N5-16 with the optimized medium led to a 104% enhancement in nattokinase activity compared to pre-optimization conditions.

Key words：Nattokinase; Fermentation; Strain breeding; Process optimization; Response surface methodology

近年來，我國心血管疾病的發(fā)病率和死亡率均不斷增高，其中，血栓是引起腦卒中和冠心病的重要誘因[1]。目前臨床上使用廣泛的溶栓藥如尿激酶、鏈激酶等價格高昂、不良反應(yīng)嚴重[2]。納豆激酶（Nattokinase，NK）是一種由日本心腦血管專家須見洋行教授從農(nóng)產(chǎn)品納豆的發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一種具有超強溶栓能力的堿性絲氨酸蛋白酶[3～5]。納豆激酶的主要優(yōu)勢體現(xiàn)在安全性高，不易引起出血等不良反應(yīng)，在體內(nèi)作用時間長，既可制成注射劑又可制成口服制劑等[6～10]。納豆激酶主要通過固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方式制備，與固體發(fā)酵相比，液體發(fā)酵可控性更強，產(chǎn)率高，后處理簡單，是目前生產(chǎn)納豆激酶的主要方式[6]，而液體發(fā)酵制備納豆激酶的關(guān)鍵取決于發(fā)酵用菌株和發(fā)酵工藝參數(shù)兩個方面。該研究以實驗室保藏的納豆芽孢桿菌SIPI-W-N5為出發(fā)菌株，通過物理誘變和化學(xué)誘變的方式對出發(fā)菌株進行誘變育種，進一步獲得高產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵菌株，最后通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到該突變株納豆激酶發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成。

1材料與設(shè)備

1.1菌株來源

來自實驗室保藏的納豆芽孢桿菌SIPI-W-N5。

1.2初始發(fā)酵培養(yǎng)基

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉10，大豆蛋白胨5，Na-2HPO-4·12H-2O "4，KH-2PO-4 1.5。

1.3培養(yǎng)條件

接種量1%裝至50/250 mL三角瓶中，30 ℃ 250 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)3 d。

1.4主要試劑與儀器

奶粉（光明乳業(yè)有限公司）；牛血清纖維蛋白原（上海寶曼）；瓊脂糖（西格瑪奧德里奇有限公司）；凝血酶、上海源葉（上海源葉）；玉米漿液化液、鷹嘴豆豆?jié){（自制）；誘變箱（自制）；生化培養(yǎng)箱（LRH-250，上海一恒）；搖床（ZHWY-2102，上海智城）。

2方法

2.1誘變與篩選

2.1.1產(chǎn)蛋白酶活力及產(chǎn)納豆激酶活力篩選模型建立

初篩模型：由于納豆激酶是一種蛋白酶，因而在誘變過程中采用酪蛋白平板法對誘變菌株產(chǎn)蛋白酶活力進行初步篩選[11]。

復(fù)篩模型：采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法[12]，對初篩得到的突變株產(chǎn)納豆激酶活力進行測定，最終篩選出高產(chǎn)誘變菌株。用無菌生理鹽水將尿激酶標準品分別配制成62.5 U/mL、125 U/mL、250 U/mL、400 U/mL、500 U/mL 5個濃度，每個濃度取20 μL采用紙片法在瓊脂糖-纖維蛋白平板上點樣。每個濃度做3個平行，37 ℃ 孵育18 h。孵育結(jié)束后測定溶解圈直徑，并計算直徑平均值和對應(yīng)溶解圈面積。以溶解圈面積（mm+2）為橫坐標，納豆激酶酶活（U/mL）為縱坐標，制作尿激酶標準曲線并擬合標準曲線的回歸方程。根據(jù)實驗結(jié)果得到標準曲線的線性回歸方程為y = 2.591x – 1176，R+2值為0.978，說明納豆激酶酶活與溶解圈面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.2菌株誘變

采用物理誘變（UV）和化學(xué)誘變（DES）對出發(fā)菌株納豆芽孢桿菌SIPI-W-N5進行菌種選育，通過如下計算公式計算正突變率和致死率，進而確定誘變條件。

UV誘變：吸取9 mL培養(yǎng)20 h的菌液在15 W紫外燈下進行誘變處理后，稀釋涂布于酪蛋白平板上，待菌落37 ℃下培養(yǎng)成熟后，計算正突變率（%）和致死率（%）。

DES誘變：2%硫酸二乙酯溶液誘變處理，稀釋涂布于酪蛋白平板，待菌落37 ℃下培養(yǎng)成熟后，計算正突變率（%）和致死率（%）。

聯(lián)合誘變：同時采用UV誘變和DES誘變。

2.2納豆激酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1單因素優(yōu)化

發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物受不同營養(yǎng)成分的影響是顯著的[13，14]。該研究對發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源、氮源、微量元素等營養(yǎng)成分進行考察，并對各營養(yǎng)成分的含量進行優(yōu)化。

2.2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗

（1）Plackeet-Burman試驗設(shè)計

根據(jù)2.3實驗結(jié)果，選取對納豆激酶發(fā)酵產(chǎn)量有較大影響的8個因素，每個因素選取2個水平，試驗選用N=12的PB設(shè)計，預(yù)留3個虛變量用以估計誤差，響應(yīng)值為納豆激酶水解圈直徑（cm），平行對照三組。

（2）最陡爬坡試驗

通過Plackeet-Burman試驗結(jié)果篩選出最主要影響納豆激酶產(chǎn)量的因素，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)擬合的一次多項式能有效確定最陡爬坡方向，由此逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

（3）Box-Behnken試驗

根據(jù)PB試驗和最陡爬坡試驗確定的試驗因素和水平，進行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，通過Design Expert 8.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

3結(jié)果與分析

3.1菌種選育

3.1.1UV和DES誘變條件篩選以SIPI-W-N5菌株作為出發(fā)菌株，分別對比不同處理時間的UV、DES以及兩者聯(lián)合的誘變方式所得致死率與正突變率，結(jié)果如表1所示。

由此可見，UV處理360 s或DES處理40 min，亦或是聯(lián)合誘變處理25 min，致死率都較高且正突變率相對最高，該誘變條件下具備較好的篩選效率。

3.1.2誘變選育改造根據(jù)3.1.1中得到的最佳誘變條件，對出發(fā)菌株SIPI-W-N5進行育種，經(jīng)過多輪誘變篩選，挑選不同單菌落通過酪蛋白平板進行產(chǎn)蛋白酶能力篩選，最終得到產(chǎn)蛋白酶活力最佳的SIPI-W-ZW16，對其進行自然分離得到SIPI-W-N5-16，其誘變譜系如圖1所示。

通過搖瓶發(fā)酵檢測其產(chǎn)納豆激酶活力，結(jié)果如表2所示，可以看出突變株SIPI-W-N5-16產(chǎn)納豆激酶酶活為251.31±2.47 U/mL，較出發(fā)菌株SIPI-W-N5提高了149.24%

3.2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

3.2.1單因素優(yōu)化試驗，各因素影響水平如下。

（1）碳源對發(fā)酵水平的影響碳源是培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分之一，由于不同微生物所含的碳源分解酶并不完全一樣，因此它們對各種碳源的利用能力也不完全相同。選取1%不同碳源，以1%可溶性淀粉為對照，其他發(fā)酵成分保持不變，由圖2可知最優(yōu)碳源為可溶性淀粉與麥芽糊精組成的復(fù)合碳源，通過進一步的含量優(yōu)化可知1.5%可溶性淀粉+1%麥芽糊精為最佳配比。

（2）氮源對發(fā)酵水平的影響選取0.5%的不同氮源，以0.5%的大豆蛋白胨作為對照，其他發(fā)酵成分保持不變，由圖3可知最優(yōu)氮源為大豆蛋白胨與酪蛋白組成的復(fù)合氮源，通過進一步的含量優(yōu)化可知1.5%的大豆蛋白胨+1%的酪蛋白為最佳配比。

（3）微量元素對發(fā)酵水平的影響微量元素在菌體生長繁殖和代謝活動中的生理功能是多方面的，可作為酶的組成部分，也是代謝途徑中許多重要酶的激活劑，還參與細胞膜通透性的調(diào)節(jié)等。本實驗考察了含量為0.05%的不同金屬離子對發(fā)酵的影響，以不加任何微量元素為對照組，由圖4可知，當向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Ca+2+、Mg+2+時能夠明顯促進納豆激酶的生成。通過進一步含量優(yōu)化可知當向培養(yǎng)基中加入0.1%的Ca+2+和0.3%的Mg+2+時，發(fā)酵效果最佳。

3.2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗

（1）Plackeet-Burman試驗

根據(jù)單因素試驗優(yōu)化結(jié)果并結(jié)合相關(guān)文獻調(diào)研，Plackeet-Burman試驗選取大豆蛋白胨、酪蛋白、可溶性淀粉、麥芽糊精、MgSO-4·7H-2O、CaCl-2、Na-2HPO-4·12H-2O 、KH-2PO-4共8種培養(yǎng)基成分，進行12次試驗，平行對照3組，其中3個虛變量用以估計誤差，響應(yīng)值為納豆激酶水解圈直徑（cm），編號X-1-X-11，分別用“-1，1”表示，“1”代表高水平，“-1”代表低水平。試驗過程及結(jié)果見表3～5。

由表5可以看出，%P%=0.000 2lt;0.05，說明該模型在整個被研究的整個回歸區(qū)域擬合度很好。6個考察因素中排在前3位的依次是CaCl-2、可溶性淀粉、MgSO-4·7H-2O。這三個因素對納豆激酶產(chǎn)量影響較大，其中無水氯化鈣和七水硫酸鎂對產(chǎn)量的影響是正效應(yīng)，可溶性淀粉對產(chǎn)量的影響是負效應(yīng)。

（2）最陡爬坡試驗

通過Plackeet-Burman試驗結(jié)果篩選出最主要影響納豆激酶產(chǎn)量的3個因素是CaCl-2、可溶性淀粉、MgSO-4·7H-2O。各個因素變化的步長根據(jù)因素效應(yīng)值大小和正負來確定。每組做三個平行。試驗設(shè)計及結(jié)果見表6。

由上述結(jié)果可知，從第二組開始，酶活力明顯增加，第四組達到峰值，第五組開始下降，這表明第二組和第五組是發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組合，故選擇響應(yīng)面優(yōu)化試驗中心點是0+4。

（3）Box-Behnken試驗

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，選0+4作為響應(yīng)面試驗設(shè)計為零水平，以CaCl-2、可溶性淀粉、MgSO-4·7H-2O 3個重要因素為自變量，每組做三個平行，各因素編碼水平及試驗結(jié)果如表7～9所示。

由表9可知，Prob＞F = 0.008 4，小于0.05，顯著；Lackof Fit = 0.768 1，大于0.05，不顯著；R+2=0.901 8，這表明90.18%的試驗結(jié)果可以用該模型解釋，模型具有顯著性，在考察濃度范圍內(nèi)能較好的表征納豆激酶產(chǎn)量的變化。各因子對納豆激酶酶活的影響程度依次為：無水氯化鈣＞可溶性淀粉＞七水硫酸鎂。根據(jù)Design-expert 7.1.3分析軟件得到以下回歸方程。

Y=2.613 75+0.097 5X-1+1.162 5X-2-2X-3+0.05X-1X-2+1.6X-1X-3+4X-2X-3-0.075X-12-1.875X-22-10X-32

利用Design Expert 8.0分析軟件做出各因素交互作用對納豆激酶酶活影響的響應(yīng)曲面和等高線分析圖，見圖5，可知模型存在極大值，其中無水氯化鈣與其他因素交互作用較為顯著。

對上述模型求導(dǎo)，得出該模型的最大值。結(jié)果顯示，當大豆蛋白胨1%、酪蛋白0.5%、可溶性淀粉1.86%、麥芽糊精1%、MgSO-4·7H-2O 0.44%、CaCl-2 0.1%、KH-2PO-4 0.1%、Na-2HPO-4·12H-2O "0.6%時，對應(yīng)的納豆激酶水解圈直徑（Y值）為2.90 cm，約納豆激酶535.40 U/mL。

（4）驗證試驗

通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定了納豆激酶最佳搖瓶發(fā)酵條件，為了檢驗?zāi)Ｐ偷臏蚀_性，對最佳發(fā)酵條件進行驗證。

由圖6可知，在最佳發(fā)酵條件下納豆激酶的活性達到549.72 U/mL，與理論預(yù)測值535.40 U/mL相對誤差小于5%，說明模型預(yù)測與實際試驗較符合。相較于初始工藝納豆激酶活性提高了104%。

4討論與結(jié)論

納豆激酶作為有望被開發(fā)的新一代使用方便、安全的溶栓藥物其工業(yè)化量產(chǎn)是亟需解決的痛點，因此培育出能夠高產(chǎn)納豆激酶的生產(chǎn)菌株至關(guān)重要。該研究通過對出發(fā)菌株SIPI-W-N5進行不斷地紫外誘變和化學(xué)誘變，在大規(guī)模菌種選育后獲得一株具有正突變效應(yīng)的發(fā)酵菌株SIPI-W-N5-16，相較于出發(fā)菌株其產(chǎn)納豆激酶活力提高了149.24%。由此可見，實驗室在前期自然選育的SIPI-W-N5菌株基礎(chǔ)上，采用物理誘變、化學(xué)誘變以及兩者聯(lián)用的方式借助射線、化學(xué)物質(zhì)等不斷刺激野生型菌株，采用蛋白酶初篩方法大量篩選，最終是可以明顯提高菌株突變幾率，但是要控制好射線或者化學(xué)物質(zhì)的誘變劑量，劑量過低易導(dǎo)致正突變率低下，劑量過高易導(dǎo)致死亡率過高。同時，在紫外誘變時注意光修復(fù)對誘變的影響，因此每輪紫外誘變結(jié)束以后需進行暗培養(yǎng)操作。

納豆激酶是納豆芽孢桿菌的初級代謝產(chǎn)物，主要是在納豆芽孢桿菌前中期生長繁殖過程中大量產(chǎn)生，因此對發(fā)酵培養(yǎng)基成分具有一定要求。該研究以突變菌SIPI-W-N5-16作為發(fā)酵納豆激酶的目標菌，對其發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到最佳搖瓶發(fā)酵條件，在此條件下納豆激酶的活力相較于初始工藝納豆激酶活性提高了104%。由此可見，復(fù)合碳、氮源以及鈣、鎂離子對發(fā)酵菌株SIPI-W-N5-16產(chǎn)納豆激酶影響較大。在發(fā)酵過程一方面需避免使用具有阻遏作用的碳、氮源從而克服初級代謝產(chǎn)物分解代謝阻遏，另一方面使用復(fù)合碳、氮源相互協(xié)同可為發(fā)酵菌株提供更加豐富的碳、氮源種類并降低底物抑制作用，調(diào)節(jié)菌株代謝途徑。與此同時，微量元素鈣、鎂離子作為產(chǎn)物的組成部分或者調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)，能夠顯著提高納豆激酶酶活。本文在納豆激酶生產(chǎn)菌株選育和發(fā)酵培養(yǎng)基成分方面的研究為納豆激酶進一步量產(chǎn)奠定了菌種和發(fā)酵培養(yǎng)基的研究基礎(chǔ)。

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收稿日期：2024-07-19修回日期：2024-08-20

基金項目： 陜西省重點研發(fā)計劃項目（ 2023-YBNY-249）；陜西省教育廳青年創(chuàng)新團隊建設(shè)項目（ 21JP143）；楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院2023年校內(nèi)科研基金項目（DT2023-001）。第一作者簡介：文雯（1991-），女，講師，碩士研究生，主要從事微生物藥物研究與開發(fā)。通信作者：胡海峰。