鳶尾素調控EBF3/ALOX15通路影響肺腺癌細胞增殖和遷移

摘要：目的 探討鳶尾素對早期B細胞因子3（EBF3）/花生四烯酸-15-脂加氧酶（ALOX15）通路的調控作用及肺腺癌細胞增殖和遷移的影響。方法 將A549細胞分為鳶尾素溶劑組、鳶尾素組、sh-NC組、EBF3抑制劑（sh-EBF3）組、鳶尾素+sh-NC組、鳶尾素+sh-EBF3組。5-溴-2-脫氧尿嘧啶（EdU）染色、CCK-8法檢測細胞增殖；劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率；2′，7′-二氯熒光二乙酸酯（DCFH-DA）染色檢測細胞中活性氧（ROS）水平；比色法檢測細胞中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、細胞亞鐵（Fe2+）水平；透射電鏡觀察A549細胞中線粒體形態；qRT-PCR檢測A549細胞中增殖性細胞核抗原（PCNA）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）mRNA水平；Western blot檢測細胞中EBF3、ALOX15蛋白。結果 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細胞線粒體呈現出鐵死亡特征，EdU陽性率、OD450值、劃痕愈合率、GSH水平、PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA水平降低，ROS相對熒光強度、MDA、Fe2+水平及EBF3、ALOX15蛋白升高（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細胞線粒體呈現出鐵死亡現象有所減弱，EdU陽性率、OD450值、劃痕愈合率、GSH水平、PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA水平升高，ROS相對熒光強度、MDA、Fe2+水平及EBF3、ALOX15蛋白降低（P＜0.05）；sh-EBF3逆轉了鳶尾素對A549細胞鐵死亡、增殖與遷移的影響。結論 鳶尾素可能通過激活EBF3/ALOX15通路誘導A549細胞鐵死亡，抑制細胞增殖與遷移。

關鍵詞：肺腺癌；細胞增殖；細胞運動；鐵死亡；鳶尾素；早期B細胞因子3/花生四烯酸-15-脂加氧酶通路

中圖分類號：R734.2 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20242182

肺腺癌約占所有肺癌的50%，晚期肺腺癌患者預后較差，平均5年生存率僅為15%［1-2］。目前肺腺癌的標準治療方式包括手術切除、放療、化療、靶向治療和免疫治療［3］。雖然這些治療方式能夠在一定程度上緩解肺腺癌的進展，但復發、化療耐藥性以及不良反應的發生影響了肺腺癌的療效［4-6］。因此，尋找有效的肺腺癌治療策略勢在必行。鳶尾素是運動過程中骨骼肌分泌的一種激素，具有降低快速分裂細胞的活力和抑制遷移的作用［7-8］。但具體機制尚不完全明確。激活早期B細胞因子3（EBF3）/花生四烯酸-15-脂加氧酶（ALOX15）通路介導的鐵死亡可抑制急性髓系白血病細胞生長［9］；ALOX15過表達可誘導鐵死亡，進而降低非小細胞肺癌的順鉑耐藥性［10］。但鳶尾素能否通過調控EBF3/ALOX15通路影響肺腺癌細胞增殖、遷移和鐵死亡尚不清楚。基于此，本實驗主要探究鳶尾素對肺腺癌細胞增殖、遷移和鐵死亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌細胞系A549細胞購自通派生物公司。鳶尾素（溶于PBS中，上海源葉生物公司）；EBF3抑制劑EBF3小干擾RNA（sh-EBF3，序列5′-GGUUGACAAGGUCUA GCUA-3′ ） 及其陰性對照sh-NC（ 序列5′-UGGAGAUUGAAAGGACCGCU-3′）、Lipofectamine? 3000 轉染試劑、TRIzol試劑（賽默飛世爾科技公司）；5-溴-2-脫氧尿嘧啶（EdU）染色試劑盒（上海東寰生物科技有限公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）；2′，7′-二氯熒光二乙酸酯（DCFH-DA，美國MCE 公司）；谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、細胞亞鐵（Fe2+）檢測試劑盒（南京建成生物有限公司）；TOYOBO逆轉錄試劑盒（上海松雷生物科技有限公司）；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊生物科技股份有限公司）；RIPA裂解緩沖液（北京百奧萊博科技有限公司）；BCA 試劑盒、ECL 試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司）；兔源一抗EBF3、GAPDH、ALOX15及羊抗兔二抗（英國Abcam公司）。BX41-32P02熒光顯微鏡、CX53光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；ST-360酶標儀（上海科華儀器廠）；TalosF200S透射電子顯微鏡（上海瓦克儀器有限公司）；Q5熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；DYCZ-24B蛋白電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及處理 A549細胞分為鳶尾素溶劑組、鳶尾素組、sh-NC 組、sh-EBF3 組、鳶尾素+sh-NC 組、鳶尾素+sh-EBF3組。鳶尾素溶劑組A549細胞用PBS溶液處理24 h；鳶尾素組［8］A549細胞用20 nmol/L鳶尾素處理24 h；sh-NC組、sh-EBF3組A549細胞分別利用Lipofectamine? 3000轉染試劑轉染sh-NC、sh-EBF3 24 h；鳶尾素+sh-NC組A549細胞用20 nmol/L鳶尾素處理24 h的同時轉染sh-NC 24 h；鳶尾素+ sh-EBF3組A549細胞用20 nmol/L鳶尾素處理24 h的同時轉染sh-EBF3 24 h。處理結束后用于各項指標檢測。

1.2.2 EdU染色檢測A549細胞增殖 將各組A549細胞以相同的密度接種于12孔板，次日向各孔加EdU工作液并孵育2 h。細胞經固定和DAPI染色后觀察并統計EdU陽性率。

1.2.3 CCK-8檢測A549細胞增殖 將A549細胞接種在96孔板中，每孔3 000個細胞，按照1.2.1 所述進行對應處理后，向各孔加入10 μL CCK-8 試劑并培養4 h。用酶標儀檢測450 nm處的光密度（OD）值。

1.2.4 劃痕實驗檢測A549細胞遷移 將各組A549細胞（1×105個細胞）接種在12孔板中，并在含有10%FBS的DMEM培養基中培養，直至達到95%融合度。再將細胞在無血清培養基中饑餓6 h。使用無菌的200 μL移液器吸頭在細胞層上劃痕，在0、24 h拍攝細胞劃痕愈合的照片，并計算劃痕愈合率［（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%］。

1.2.5 A549細胞中活性氧（ROS）水平檢測 將各組A549細胞在PBS中勻漿，然后與10 μmol/L DCFH-DA在37 ℃下孵育30 min。使用激發/發射波長為488/525 nm的熒光光譜儀檢測熒光強度。

1.2.6 比色法檢測A549細胞中MDA、GSH、Fe2+水平 根據試劑盒說明檢測各組A549細胞中MDA、GSH、Fe2+水平。

1.2.7 透射電鏡觀察A549細胞中線粒體形態 將各組A549細胞用含有2.5%戊二醛的PBS溶液固定在6 cm培養皿中24 h。PBS洗滌后，用含有1%鋨酸的PBS固定細胞，PBS洗滌后，細胞脫水包埋，60 ℃烤箱孵育48 h。制備超薄切片，用檸檬酸鉛和醋酸鈾酰染色。干燥過夜后，用透射電鏡獲取切片圖像。

1.2.8 A549細胞中增殖性細胞核抗原（PCNA）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）mRNA表達水平的檢測 使用TRIzol試劑提取A549細胞的總RNA，并通過逆轉錄合成cDNA。使用ChamQ Universal SYBR qPCR預混液在Q5熒光定量PCR儀上進行定量檢測，反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火/延伸40 s，共42個循環。通過將PCNA、MMP-2、GPX4的表達歸一化為GAPDH來確定基因相對表達水平。引物序列： PCNA 正向5′-TTACCATAGAGATGAATGAACCA-3′， 反向5′-AGTGTCACCGTTGAAGAG-3′；MMP-2正向5′?CTAATCAGCATTCTCACT-3′，反向5′－AGTCAGC ATCTATTCTTG－3′；GPX4正向5′-TTCAGCATAAGACAAAGCTCCA-3′， 反向5′-GAGGCAAGACCGAAGTAAACTAC-3′； GAPDH 正向5′?ATGGGTGTGAACCACGAGA-3′，反向：5′?CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3′。

1.2.9 A549細胞中EBF3、ALOX15蛋白的檢測 RIPA裂解緩沖液用于從各組A549細胞中提取總蛋白。BCA法用于定量樣品中的蛋白質濃度。通過10% SDS-PAGE分離40 μg蛋白質樣品，并轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉膜1 h后，將膜與一抗EBF3（1∶3 000）、GAPDH（1∶6 000）、ALOX15（1∶5 000）在4 ℃下孵育過夜。次日，再與二抗（1∶4 000）在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑對蛋白信號進行可視化。Image J軟件用于蛋白質的定量。

1.3 統計學方法 使用GraphPad prism 9進行數據分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鳶尾素對A549 細胞增殖的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549 細胞EdU 陽性率、OD450值降低（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細胞EdU陽性率、OD450 值升高（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC 組比較，鳶尾素+sh-EBF3 組A549 細胞EdU 陽性率、OD450 值升高（P＜0.05），見圖1、表1。

2.2 鳶尾素對A549細胞遷移的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細胞劃痕愈合率升高（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3 組A549 細胞劃痕愈合率升高（P＜0.05），見表1、圖2。

2.3 鳶尾素對A549細胞氧化應激及Fe2+水平的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細胞中ROS相對熒光強度、MDA、Fe2+水平升高，GSH水平降低（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細胞中ROS 相對熒光強度、MDA、Fe2+水平降低，GSH水平升高（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3 組A549 細胞中ROS 相對熒光強度、MDA、Fe2+水平降低，GSH水平升高（P＜0.05），見圖3、表2。

2.4 鳶尾素對A549細胞中線粒體形態的影響 鳶尾素溶劑組A549細胞線粒體形態無明顯變化；與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細胞線粒體呈現出鐵死亡特征，表現為線粒體體積變小，膜密度升高，嵴減少以及外膜破裂；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細胞線粒體呈現出鐵死亡現象有所減弱；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3組A549細胞線粒體呈現出鐵死亡程度有所減輕，見圖4。

2.5 鳶尾素對A549細胞增殖、遷移、鐵死亡相關基因表達水平的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細胞中PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA水平降低（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細胞中PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA 水平升高（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3組A549細胞中PCNA、MMP-2、GPX4 mRNA水平升高（P＜0.05），見表3。

2.6 鳶尾素對A549細胞中EBF3/ALOX15通路蛋白表達的影響 與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549細胞中EBF3、ALOX15 蛋白升高（P＜0.05）；與sh-NC組比較，sh-EBF3組A549細胞中EBF3、ALOX15蛋白降低（P＜0.05）；與鳶尾素+sh-NC組比較，鳶尾素+sh-EBF3組A549細胞中EBF3、ALOX15蛋白降低（P＜0.05），見圖5、表4。

3 討論

肺腺癌在所有肺癌中死亡率最高［11］。肺腺癌細胞的增殖和轉移仍然是有效治療肺腺癌的障礙［12］。鳶尾素是一種新型肌因子，在包括腫瘤等多種疾病的治療中發揮著重要的作用［13］。據報道，結直腸癌患者的血清鳶尾素平均水平顯著低于健康志愿者［14］；高水平的鳶尾素有助于抑制胃癌細胞的遷移［15］；鳶尾素可抑制非小細胞肺癌細胞生長［16］。本研究顯示，與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組EdU陽性率、OD450 值、劃痕愈合率降低，表明鳶尾素可抑制A549細胞增殖與遷移。PCNA是人體DNA代謝的關鍵調節因子，可有效促進細胞增殖［17］；MMP-2可引起細胞外基質的降解，增強腫瘤細胞的遷移能力［18］。本研究鳶尾素組A549細胞中PCNA、MMP-2mRNA水平低于鳶尾素溶劑組，再次從分子水平上證明了鳶尾素對A549細胞增殖與遷移的抑制作用。研究表明，誘導鐵死亡是一種新的抗肺腺癌策略，而鐵死亡的抑制可以驅動肺腺癌發生并促進肺腺癌進展［19］。細胞內ROS和鐵積累、脂質過氧化以及GSH消耗是鐵死亡的關鍵過程［20］。MDA是ROS誘導的脂質過氧化損傷的間接指標。GPX4是一種谷胱甘肽過氧化物酶，在調控鐵死亡中起著重要作用，其以谷胱甘肽依賴方式特異性催化脂質過氧化物的氧化活性，從而保護細胞免受鐵死亡的威脅［21］。本研究中，與鳶尾素溶劑組比較，鳶尾素組A549 細胞中ROS相對熒光強度、MDA、Fe2+水平升高，GSH水平及GPX4 mRNA水平降低，且透射電鏡觀察發現粒體呈現出典型的鐵死亡特征，表現為線粒體體積變小，膜密度升高，嵴減少以及外膜破裂，表明鳶尾素可誘導A549細胞鐵死亡。以上研究表明鳶尾素可抑制細胞增殖與遷移，誘導A549細胞鐵死亡，提示鳶尾素可能成為治療肺腺癌的有效藥物之一，但具體機制尚不完全清楚。

EBF3是一種控制靶基因表達的轉錄因子，其可通過靶向下游因子ALOX15增加脂質過氧化和細胞ROS來促進鐵死亡，進而抑制腫瘤進展［9］。而抑制EBF3表達可促進食管癌細胞的增殖與遷移行為［22］；過表達ALOX15 促進了肺癌小鼠模型的癌細胞凋亡，并抑制了腫瘤轉移［23］。本研究中，與sh-NC組比較，sh-EBF3組EBF3、ALOX15蛋白水平降低，增殖、遷移能力增強，鐵死亡被抑制，提示抑制EBF3/ALOX15通路可促進肺腺癌進展，并抑制了鐵死亡的發生。此外，鳶尾素可上調A549 細胞中EBF3、ALOX15 蛋白，推測鳶尾素可能通過激活EBF3/ALOX15通路誘導A549細胞鐵死亡，并抑制細胞增殖與遷移。本實驗用sh-EBF3聯合鳶尾素同時干預A549細胞，結果顯示鳶尾素誘導A549細胞鐵死亡、抑制細胞增殖與遷移的生物學效應在sh-NC中明顯，但在sh-EBF3中減弱，進一步驗證了上述推測。

綜上所述，鳶尾素誘導A549細胞鐵死亡、抑制細胞增殖與遷移的機制可能與激活EBF3/ALOX15通路有關。但本研究未設計動物實驗來進一步驗證上述結論，后期有待深入探究。

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（2024-12-10收稿 2025-01-15修回）

（本文編輯 李國琪）