TRIM3通過調(diào)控PIAS1-STAT1軸抑制膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展

【中圖分類號】 R739.41 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1672-7770（2025）02-0149-10

Abstract： Objective To explore the role and molecular mechanisms TRIM3 in the occurrence and development human glioblastoma through PIAS1-STAT1. Methods Lentiviral overexpression TRIM3 and shRNA-transfected GBM cell lines U251 and U87 were constructed， with corresponding control groups CON335 and CON313. The FLAG-TRIM3 plasmid was used to transfect GBM cells and 293T cells， to construct overexpression cell lines. Living cell counting （CCK-8）， plate cloning experiments， Transwell chambers， and flow cytometry were used to analyze the proliferative activity， clumping， migration ability， and apoptosis glioma cells. Western blot and co-immunoprecipitation（Co-IP） experiments were conducted to detect the interaction between TRIM3 and PIAS1 proteins， as well as the specific molecular mechanisms. Real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction（ PCR） was used to detect the mRNA expression TRIM3 and PIASI. Dual-luciferase reporter gene assays were employed to test the impact TRIM3 on STAT1 activity. Nude mouse intracranial tumor models were used to demonstrate the impact TRIM3 on glioma formation in vivo. Results Compared to normal brain tissue cells， the expression TRIM3 was significantly reduced in GBM tissues. The expression level TRIM3 decreased with the WHO grades. Overexpression TRIM3 in glioma cells resulted in a significant attenuation their proliferative， clumping，and migratory capacities， and induced apoptosis in GBM cells. Western blot analysis revealed that overexpression TRIM3 in GBM cells was associated with a concentrationdependent reduction in PIASl protein levels. Real-time quantitative PCR data indicated that TRIM3 overexpression had no influence on the mRNA levels PIASl and STATl. Dual-luciferase reporter assays confirmed that TRIM3 enhances the transcriptional activity STATl. Moreover， TRIM3 mediated the degradation PIAS1 by promoting its poly-ubiquitination at the K48 residue， thus alleviating the suppressive effect PIAS1 on STATl transcription. In vivo studies using a nude mouse model demonstrated that， relative to the control group， the rate and size intracranial tumor formation were significantly reduced in mice with overexpressed TRIM3. ConclusionsTRIM3 disrupts the PIAS1-TRIM3 axis， suppressing glioma progression， and fers a novel therapeutic target.

Key words： gliobastoma； TRIM3 ； PIAS1 ； STAT1 ； ubiquitination

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）作為成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，惡性程度極高。到目前為止，膠質(zhì)瘤最常用的治療手段包括手術(shù)切除與放化療[2]；盡管有新的治療手段加入，例如腫瘤電場治療與貝伐珠單抗聯(lián)合再放療[3-4]，患者的5年總相對生存率仍然僅為 。同時需要注意的是，該病的復(fù)發(fā)率幾乎高達(dá) 100% ，預(yù)后極差[。因此，進(jìn)一步探索膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)可能的治療靶點(diǎn)對于改善其療效與預(yù)后具有重要的臨床意義。三結(jié)構(gòu)域蛋白3（tripartitemotifcontaining3，TRIM3）是一種E3泛素連接酶，隸屬于TRIM家族，是一個含有環(huán)指結(jié)構(gòu)域、一個或兩個鋅結(jié)合B-box結(jié)構(gòu)域和卷曲-線圈結(jié)構(gòu)域的三方基元[7]。近年來，TRIM3被證明在多種腫瘤中表現(xiàn)出抑癌作用，如肺癌、乳腺癌、胃癌等，可以通過鐵死亡、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法發(fā)揮作用[8-9]。但是，TRIM3在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不明確，亟待進(jìn)一步研究。PIAS1蛋白是PIAS蛋白家族的一員，PIAS蛋白家族主要通過與多種轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄輔因子相互作用，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄活性[，該家族其他成員還包括PIAS2（PIASx）、PIAS3和PIAS4（PIASy）[\"]。PIAS1最初被發(fā)現(xiàn)是作為 STAT1 的抑制劑，能夠通過SUMO化修飾調(diào)控 STAT1的活性，從而影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[12]。有研究表明，STAT1在膠質(zhì)瘤中能夠發(fā)揮抑癌作用[13]。在此之前，有相關(guān)報道稱TRIM59可以促進(jìn)PIAS1和STAT1的結(jié)合，證明TRIM家族可能與PIAS1和STAT1存在互作關(guān)系[14]。同時，近年來PIAS1作為促癌因子在各類癌癥中發(fā)揮的作用也被越發(fā)重視，如肺癌、肝癌和黑色素瘤等[15-16]。然而，PIAS1 在GBM當(dāng)中是否同樣發(fā)揮促癌作用，以及具體的作用機(jī)制仍不清楚。本研究觀察到TRIM3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中含量降低，這一現(xiàn)象是與患者生存預(yù)后有關(guān)的。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，TRIM3可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，TRIM3與PIAS1存在直接的物理結(jié)合，通過促進(jìn)PIAS1在K48位點(diǎn)的多聚泛素化和降解來解除PIAS1對STAT1的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而發(fā)揮抑癌作用。

1資料與方法

1.1在線腫瘤數(shù)據(jù)庫分析通過GEPIA數(shù)據(jù)庫（ Gene Expression Priling Interactive Analysis，GEPIA）（http：//gepia.cancer-pku. cn ），TCGA數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas， TCGA）（https：//www.cancer.gov/tcga）以及倫勃朗數(shù)據(jù)庫（TheRepositoryMolecularBrainNeoplasiaData ）（https：//rembrandtdatabase.org/）訪問獲取重點(diǎn)為TRIM3表達(dá)情況的隊(duì)列分析，包括基因表達(dá)和生存分析。1.2臨床樣本和免疫組化染色研究所用的組織陣列芯片（HBraG079PG01）購自上海芯超生物科技有限公司，包含76例人膠質(zhì)瘤樣本與3例人正常腦組織樣本，記錄詳細(xì)病理信息與IRS評分。1.3細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、U251以及人胚胎腎細(xì)胞系HEK293T從中國科學(xué)院（中國上海）細(xì)胞庫培養(yǎng)，在DMEM培養(yǎng)基中加入 10% 胎牛血清（FBS；ExCellbio，中國上海）。Genewiz，Inc.（中國）使用短串聯(lián)重復(fù)標(biāo)記物對這些細(xì)胞進(jìn)行了表征，并證實(shí)這些細(xì)胞不含支原體。1.4慢病毒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染慢病毒TRIM3短發(fā)夾

RNA（shTRIM3）與過表達(dá)慢病毒（LVTRIM3）均購自Genechem（中國上海）。靶向人TRIM3互補(bǔ)DNA的shRNA序列為： -GCCAAACAGAAGGTGTTGCAA-

。其中shTRIM3的對照空載病毒為CON313，LVTRIM3的對照空載病毒為CON335。過表達(dá)TRIM3慢病毒在GV492載體中構(gòu)建。TRIM3過表達(dá)質(zhì)粒（GCPE0388843，Genechem）和PIAS1過表達(dá)質(zhì)粒（oligo24-1185L，OLIGOBIO）分別使用FLAG與HIS標(biāo)簽標(biāo)記。HA標(biāo)記的泛素化質(zhì)粒來自Genechem，分別是HA-UB-WT（GOSE0327411）與HA-UB-K48R（GOSE0327405）。

1.5CCK-8實(shí)驗(yàn)將處理后的U251及U87以每孔 個的密度接種于96孔板中，分別以 10% DMEM培養(yǎng)0、1、2、3、4d，使用CCK-8溶液（biosharp，Beijing Labgic Technology Co， Ltd.）處理 ，使用微孔板酶標(biāo)儀（Denovix，America）進(jìn)行檢測對細(xì)胞生長進(jìn)行定量。每個實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)六次。

1.6平板克隆實(shí)驗(yàn)將 個細(xì)胞接種于裝有含 10% FBS的DMEM的六孔板中培養(yǎng) 左右。細(xì)胞集落用甲醛固定，并用 0.1% 結(jié)晶紫染色。拍照后使用ImageJ進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)將含有 10% FBS的DMEM中的 200uL細(xì)胞（約 個）接種于小室的上腔中，在小室下層加入含有 20% FBS 的DMEM作為趨化劑。孵育 后，清除殘留在上腔中的細(xì)胞，并將侵入下腔室的細(xì)胞使用甲醛固定后用 0.1% 結(jié)晶紫染色。進(jìn)行拍照后使用ImageJ對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并做統(tǒng)計(jì)分析。

1.8細(xì)胞凋亡分析收集對照組與實(shí)驗(yàn)組的U87與U251，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞后，加人 500uL1× BindingBuffer重懸，加入5uL Annexin V-AlexaFluor 647和10uLPI并在室溫下避光孵育 ，并立即使用FACScan流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。試劑來源于AnnexinV-AlexaFluor647/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒[Yeasen Biotechnology（Shanghai）Co.，Ltd.]。1.9蛋白質(zhì)印跡檢測收集細(xì)胞后提取蛋白并上樣，進(jìn)行凝膠電泳，設(shè)置電流 進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，使用快速封閉液（碧云天）進(jìn)行封閉，隨后一抗孵育過夜。次日洗滌后孵育二抗，再次洗滌后使用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影（天能）。用于測定所指示蛋白質(zhì)的抗體如下：TRIM3（28392-1-AP，Proteintech）； PIAS1（3550，CellSignalingTechnology ）；GAPDH（ 60004-1-Ig，Proteintech） ；STAT1（14994，Cell Signaling Technology）；Flag-tag （8146， Cell Signaling Technology ）； Ubiquitin（3936，Cell Signaling Technology ）； HA-tag （ab9110，Abcam） ；His-Tag（66005-1-Ig，Proteintech）。

1.10 實(shí)時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（real-timequantitative polymerase chain reaction， qPCR） 使用

TRIzol試劑（Invitrogen）提取膠質(zhì)瘤細(xì)胞總RNA，使用PrimeScriptRT試劑盒（Vazyme）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Real SYBR Mixed（Vazyme，）在Lightcycler 480I儀器（RocheAppliedScience）上進(jìn)行qPCR分析，以GAPDH為內(nèi)部對照，定量mRNA相對表達(dá)。用于qPCR的引物見表1。

1.11雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)在239T細(xì)胞中分別過表達(dá)GAS螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒（oligo24-1052L，OLIGOBIO）和ISRE螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒（oligop1237，0LIG0BI0），并且共轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶報告質(zhì)粒（oligo21-222，OLIGOBIO），在此基礎(chǔ)上濃度梯度過表達(dá)FLAG-TRIM3，轉(zhuǎn)染 后，加入螢火蟲熒光素酶檢測試劑（11405ES60，YEASENBiotechnologyCo.，Ltd.），將96孔板（96孔全白聚苯乙烯微孔板，corning）放入微孔板檢測儀（Infinite200PRO，Tecan）檢測。緊接著，再將海腎熒光素酶檢測試劑（11405ES60，YEASEN Biotechnology Co.，Ltd.）加入同樣的孔中，繼續(xù)檢測發(fā)光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組，對照組與實(shí)驗(yàn)組，其中空白組不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染。1.12環(huán)己酰亞胺（Cycloheximide，CHX）實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組使用FLAG-TRIM3轉(zhuǎn)染細(xì)胞 后，加入CHX（ 20uL ）孵育 ，收集細(xì)胞后用Westernblot法檢測。

1.13免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）將各種對應(yīng)的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染人HEK293T細(xì)胞，使用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，并使用特定抗體與總裂解物在 共同孵育過夜，再加人蛋白A/G微珠（MCE）進(jìn)行IP，最后通過蛋白質(zhì)印跡分析沉淀產(chǎn)物。免疫共沉淀使用的抗體如下：PIAS1（23395-1-AP；Proteintech ）； Flag-tag（8146， CellSignalingTechnology ）；His-Tag （66005-1-Ig，Proteintech ）；RabbitIgG（ab172730，Abcam）。在泛素化相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，收集細(xì)胞前先用蛋白酶體抑制劑MG132（ Abcam，Cambridge，UK）以20uM的終濃度處理細(xì)胞 。分別在裂解物中加人PIAS1抗體（23395-1-AP；Proteintech）或HIS抗體（66005-1-Ig，

Proteintech），通過IP測定PIAS1泛素化和降解，然后使用抗Ub、抗HA進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。

1.14動物實(shí)驗(yàn)從中國科學(xué)院上海動物中心購買四周齡的雄性裸鼠，并在無病原體的屏障環(huán)境下養(yǎng)育，所有小鼠采取隨機(jī)分組，做顱內(nèi)成瘤模型鼠備用。在穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的U87細(xì)胞中穩(wěn)定感染TRIM3的過表達(dá)慢病毒或?qū)φ章《荆⒂昧Ⅲw定位的方式將 個細(xì)胞植入裸鼠的大腦中。在接下來的7、14、21d分別使用IVISSpectrum系統(tǒng)通過生物發(fā)光成像監(jiān)測腫瘤生長，并通過LivingImageStware進(jìn)行定量。所有動物護(hù)理和處理程序均按照《實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南》進(jìn)行，并經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)（動物審查倫理號：DL2024039）。沒有小鼠被排除在評分之外。所有動物實(shí)驗(yàn)均以雙盲方式進(jìn)行。

1.15統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPadPrism8軟件進(jìn)行繪圖，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，并且數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（ 表示。兩組間比較采用雙尾 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。生存曲線采用Kaplan-Meier繪制，并且進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。以 認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1TRIM3在GBM中低表達(dá)并與其不良預(yù)后相關(guān)對GEPIA數(shù)據(jù)庫與TCGA數(shù)據(jù)庫中的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，顯示TRIM3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平明顯低于正常組織，且TRIM3的表達(dá)量與臨床預(yù)后呈正相關(guān)（圖1A－D）。在倫勃朗數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同樣的分析，得到了一致的結(jié)果（圖1E、1F）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRIM3在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況，使用膠質(zhì)瘤組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色。樣本包含76例膠質(zhì)瘤組織樣本與3例正常腦組織樣本（圖1G）。結(jié)果顯示，與正常腦組織和低級別膠質(zhì)瘤（I/Ⅱ/Ⅲ級）相比，TRIM3在高級別膠質(zhì)瘤中的含量明顯下降，且與膠質(zhì)瘤分級呈負(fù)相關(guān)（圖1H））。以上結(jié)果表明，TRIM3在膠質(zhì)瘤中低表達(dá)，并與膠質(zhì)瘤不良預(yù)后有關(guān)。

ns：無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（no significance）；NB：正常腦組織（NormalBrain）A、B：GEPIA數(shù)據(jù)庫中TRIM3表達(dá)數(shù)據(jù)；C、D：TCGA數(shù)據(jù)庫中TRIM3表達(dá)數(shù)據(jù)；E、F：REMBRANDT腫瘤數(shù)據(jù)庫表達(dá)數(shù)據(jù)；G：GBM組織芯片中IHC結(jié)果；H：正常腦組織和不同分級的膠質(zhì)瘤組織中TRIM3的表達(dá)； ， ，表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2TRIM3在GBM中發(fā)揮抑癌作用選定U251與U87兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，并在兩種細(xì)胞系中分別穩(wěn)定過表達(dá)與敲降TRIM3及其對照空載病毒。過表達(dá)TRIM3后的U251和U87細(xì)胞在培養(yǎng)0、1、2、3、4d后，增殖能力明顯低于對照組。在SHTRIM3組中，細(xì)胞增殖水平得到提升（圖2A）。平板克隆實(shí)驗(yàn)用結(jié)晶紫染色后觀察細(xì)胞成團(tuán)情況，轉(zhuǎn)染了SHTRIM3后的膠質(zhì)瘤成團(tuán)的大小與數(shù)量均有提高，相反過表達(dá)TRIM3后細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量遠(yuǎn)低于對照組（圖2B）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，在GBM細(xì)胞中過表達(dá)TRIM3可以明顯抑制GBM細(xì)胞遷移的能力，而敲降TRIM3后的GBM細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)量增加明顯（圖2C）。流式細(xì)胞術(shù)顯示，與對照組相比，上調(diào)TRIM3明顯誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，相反下調(diào)TRIM3后膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的比例明顯低于對照組（圖2D）。這些結(jié)果提示，TRIM3能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、成團(tuán)與遷移能力，誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

A：CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力；B：平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞成團(tuán)能力并統(tǒng)計(jì)克隆細(xì)胞團(tuán)數(shù)；C：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力并統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)量；D：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況； ， ，表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3TRIM3解除PIAS1對STAT1的轉(zhuǎn)錄活性抑制作用在U251細(xì)胞中過表達(dá)FLAG-TRIM3并做質(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)PIAS1與TRIM3具有相關(guān)性（圖3A）。對電泳凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色進(jìn)行驗(yàn)證，PIAS1分子量處確有對應(yīng)條帶，驗(yàn)證TRIM3與PIAS1存在相互關(guān)系（圖3B）。在膠質(zhì)瘤雙細(xì)胞系（U87和U251）中過表達(dá)TRIM3后，Westernblot結(jié)果顯示PIAS1蛋白水平下降明顯，而PIAS1的效應(yīng)分子STAT1的蛋白含量并沒有變化，但是P-STAT1（701）蛋白水平有一定的升高，這一現(xiàn)象是濃度梯度依賴的（圖3C）。qPCR結(jié)果提示，STATI與PIASI的mRNA含量并無明顯變化（圖3D）。以往的研究表明，PIAS1是通過阻斷STAT1的DNA結(jié)合活性，降低了Tyr-701位點(diǎn)的STAT1磷酸化水平，從而特異性影響某些IFN誘導(dǎo)的基因表達(dá)，而ISRE 和 GAS 證實(shí)正是 PIAS1 的敏感基因[17-18]。于是采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證STAT1介導(dǎo)的下游基因轉(zhuǎn)錄活性，濃度梯度過表達(dá)TRIM3后，U87和U251細(xì)胞的熒光素酶信號明顯升高，這提示STAT1被PIAS1抑制的轉(zhuǎn)錄活性得到恢復(fù)（圖3E）。以上數(shù)據(jù)證明，TRIM3在膠質(zhì)瘤中調(diào)控PIAS1-STAT1軸，解除PIAS1對STAT1的轉(zhuǎn)錄活性抑制。

2.4TRIM3與PIAS1存在物理結(jié)合根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，TRIM3和PIAS1可能存在直接結(jié)合，對此進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。在GBM細(xì)胞中用PIAS1抗體進(jìn)行內(nèi)源性IP初步試驗(yàn)，結(jié)果證明PIAS1與TRIM3確實(shí)可以結(jié)合（圖4A）。同樣的，在U87和U251細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FLAG-TRIM3后用FLAG抗體進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)，證明外源性的TRIM3也可以和內(nèi)源性的PIAS1進(jìn)行結(jié)合（圖4B）。為了進(jìn)一步證明二者存在物理結(jié)合，在HEK-293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染FLAG-TRIM3和HIS-PIAS1，并用相應(yīng)的抗體進(jìn)行外源性IP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示外源性的TRIM3和PIAS1存在互作（圖4C）。以上結(jié)果提示，TRIM3和PIAS1確實(shí)存在直接物理結(jié)合。

2.5TRIM3促進(jìn)PIAS1在K48位點(diǎn)的多聚泛素化為了探索TRIM3通過何種方式使PIAS1蛋白含量下降，在U251細(xì)胞系中過表達(dá)FLAG-TRIM3，分別加入放線菌酮（CHX）共同孵育 。CHX加入后，新蛋白質(zhì)的合成被終止，而細(xì)胞內(nèi)已存在的蛋白質(zhì)則會通過蛋白酶體或溶酶體系統(tǒng)逐漸降解。在異位表達(dá)TRIM3存在的情況下，Westernblot結(jié)果顯示PIAS1的半衰期減少約 左右，因此證明TRIM3使PIAS1水平下降是通過誘導(dǎo)PIAS1的降解（圖5A）。在U251和U87細(xì)胞中用FLAG-TRIM3轉(zhuǎn)染 后，用蛋白酶體抑制劑MG132處理 ，收集細(xì)胞。電泳結(jié)果顯示MG132處理后與對照組相比，PIAS1的蛋白水平上升，且在轉(zhuǎn)染了TRIM3的細(xì)胞中，MG132有效地恢復(fù)了PIAS1的蛋白含量（圖5B）。眾所周知，TRIM家族的大多數(shù)成員都起到E3泛素連接酶的作用[19-20]，TRIM3也不例外[9，21]。在膠質(zhì)瘤雙細(xì)胞系中過表達(dá)TRIM3，隨著TRIM3的濃度提高，PIAS1的內(nèi)源性多聚泛素化水平也隨之升高（圖5C）。在HEK293T工具細(xì)胞中驗(yàn)證TRIM3可誘導(dǎo)PIAS1的外源性泛素化（圖5D）。而泛素化作為極為重要的蛋白翻譯后修飾方式，不同位點(diǎn)上產(chǎn)生的修飾擁有不同的作用[-23]。其中，K48-linked的典型泛素化則是被多次報道證明與蛋白降解有關(guān)[24-25]。為了進(jìn)一步探索 TRIM3是否是在K48位點(diǎn)上誘導(dǎo)了PIAS1的多聚泛素化，將HISPIAS1、FLAG-TRIM3和HA-UB-WT或HA-UB-K48R后共轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞中，進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)檢測PIAS1泛素化的水平。Westernblot結(jié)果顯示將K48位點(diǎn)突變后，TRIM3促進(jìn)的PIAS1多聚泛素化明顯減少（圖5E）。根據(jù)以上結(jié)果得出結(jié)論，TRIM3可以通過誘導(dǎo)PIAS1在K48位點(diǎn)的多聚泛素化來促進(jìn)其降解。

2.6過表達(dá)TRIM3可顯著抑制裸鼠顱內(nèi)成瘤將轉(zhuǎn)染了熒光素酶的U87細(xì)胞注人裸鼠顱內(nèi)，分別在第7、14與21天進(jìn)行生物發(fā)光活體成像。結(jié)果顯示，與對照組相比，接種U87-LVTRIM3的裸鼠顱內(nèi)成瘤的大小與速度明顯較低（圖6）。此結(jié)果證明，TRIM3可以抑制體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長。

3討論

PIAS1作為一種SUMOE3連接酶，能夠通過SUMO化修飾來抑制STAT1介導(dǎo)的基因激活，在調(diào)節(jié) STAT1活性中扮演著重要角色[26]。PIAS1與激活的STAT1特異性結(jié)合，并抑制其DNA結(jié)合活性，從而阻斷了STAT1介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。這種相互作用在配體刺激后發(fā)生，且依賴于STAT1的Tyr-701位點(diǎn)的磷酸化。PIAS1還能抑制干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)，并通過負(fù)調(diào)控STAT1在先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[2]。進(jìn)一步研究表明，除了STAT1外，PIAS1還調(diào)節(jié)NF 和Smads等其他轉(zhuǎn)錄因子的活性，并且PIAS1通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄因子[28-29]。此外，PIAS1 在多種生理和病理過程中都有重要作用，包括在腫瘤細(xì)胞的生長進(jìn)程中。PIAS1在不同類型的腫瘤中可能發(fā)揮促進(jìn)或抑制腫瘤進(jìn)展的作用，使其成為癌癥治療的潛在靶點(diǎn)[30]PIAS1通過促進(jìn)SnoN的SUMO化，與 TIF1γ 協(xié)同作用，抑制乳腺細(xì)胞衍生的類器官的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[31]。環(huán)狀 RNA circPIAS1 在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，通過激活miR-455-3p/NUPR1/FTH1這一分子軸來抑制鐵死亡，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)展[15]。除此以外，在肺癌、乳腺癌等其他腫瘤中，PIAS1也可能通過促進(jìn)DNA修復(fù)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡等作用，正向調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11，32]。因此 PIAS1作為研究較多的促癌因子，有望成為癌癥治療的一個重要靶點(diǎn)。

E3泛素化連接酶大約有 種，可分為四組：HECT型、RING型、U盒型和 PHD 指型[33]其中，RING家族是最大的，其功能尚不完全清楚。TRIM3屬于RING指蛋白家族，由鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域、RING 結(jié)構(gòu)域、B1/2 結(jié)構(gòu)域和卷曲螺旋區(qū)組成[34]。有報道稱TRIM3在結(jié)直腸癌中是低表達(dá)的，其可以通過抑制FABF4的泛素化并且抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和脂滴形成[35]。在GBM中，也有相關(guān)報道稱TRIM3在GBM中表達(dá)量少且可能與腫瘤抑制有關(guān)。但是TRIM3在GBM中具體的調(diào)控分子機(jī)制尚未明確。

本研究驗(yàn)證了目前已有研究，通過公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析證明了TRIM3在GBM中低表達(dá)。同時體外細(xì)胞功能試驗(yàn)證實(shí)TRIM3可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、成團(tuán)、遷移等能力，同時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步確認(rèn)了TRIM3是膠質(zhì)瘤中的一個抑癌分子。接下來的分子研究揭示了不同的調(diào)控機(jī)制，TRIM3可以通過促進(jìn)PIAS1在K48位點(diǎn)的泛素化使PIAS1降解，從而對STAT1的轉(zhuǎn)錄活性抑制降低，使

STAT1可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄效應(yīng)作用，從而達(dá)到抑癌的目的。進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)也證明了TRIM3體內(nèi)可以抑制顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的形成和發(fā)展，這提示了TRIM3可以成為一個潛在的臨床治療靶點(diǎn)（圖7）。

綜上所述，本研究明確了TRIM3在膠質(zhì)瘤中的抑癌作用，探索了其中具體的分子機(jī)制，TRIM3可以通過介導(dǎo)PIAS1在K48位點(diǎn)上的多聚泛素化誘導(dǎo)其降解，從而釋放被PIAS1抑制的STAT1的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)STAT1下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抑癌作用。這一發(fā)現(xiàn)不僅進(jìn)行了對TRIM3在GBM中如何發(fā)揮抑癌作用的探索，還增加了PIAS1的翻譯后修飾的理解，并且進(jìn)一步揭示了PIAS1對STAT1的轉(zhuǎn)錄抑制作用的調(diào)控，提示TRIM3可以通過許多不同的分子在多種癌癥中發(fā)揮不同功能。本研究尚存在不足之處，比如沒有明確TRIM3在調(diào)控PIAS1后STAT1的磷酸化水平及P-STAT1與PIAS1的結(jié)合是否發(fā)生改變，TRIM3對STAT1的人核情況的影響，因此仍有待進(jìn)一步的補(bǔ)充與探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳昱寧負(fù)責(zé)論文選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究、采集與分析數(shù)據(jù)、撰寫文稿；焦建同負(fù)責(zé)論文選題、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、起草文稿；郭卉、何其晟負(fù)責(zé)實(shí)施研究、統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)巍負(fù)責(zé)分析數(shù)據(jù)、修改文稿；邵君飛負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究項(xiàng)目管理、文稿審閱及修訂。

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