不同抑菌劑在西洋杜鵑開(kāi)放式組織培養(yǎng)的效應(yīng)

中圖分類號(hào)：S685.21 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1005-7897（2025）05-0007-03

0引言

杜鵑花是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhodode-ndronL.）多年生木本花卉，被譽(yù)為“世界之花”“花木之王”，是中國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一，有“花中西施”的美稱。我國(guó)作為杜鵑花原產(chǎn)地之一，物種資源豐富，野外的山地灌叢或松林處經(jīng)常可以見(jiàn)到杜鵑花的身影，其花色絢麗、花型大，在園林造景中被廣泛運(yùn)用。除此之外，杜鵑體內(nèi)富含的皮素、兒茶素等黃酮類化合物，對(duì)抗炎、鎮(zhèn)痛、止咳具有很好的功效，藥用價(jià)值高。杜鵑花在生產(chǎn)中通常采用播種、扦插、嫁接、壓條等方式進(jìn)行繁殖，此類育種方式不僅耗時(shí)長(zhǎng)，還會(huì)受到生長(zhǎng)環(huán)境及氣候的影響，目前，國(guó)內(nèi)外眾多研究者已對(duì)杜鵑花科植物建立了組織培養(yǎng)體系，繁殖不再受季節(jié)與氣候的限制，且培養(yǎng)周期短，僅需部分材料便可進(jìn)行大量繁殖。

傳統(tǒng)的植物組織培養(yǎng)技術(shù)無(wú)菌操作要求嚴(yán)格，限制了該技術(shù)的推廣，提高了組織培養(yǎng)商業(yè)化應(yīng)用的成本。為克服傳統(tǒng)植物組培的不足，開(kāi)發(fā)了開(kāi)放式植物組織培養(yǎng)技術(shù)，即通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抑菌劑，使植物組織培養(yǎng)操作擺脫嚴(yán)格無(wú)菌的環(huán)境限制，在自然、開(kāi)放、有菌的環(huán)境中進(jìn)行③。該技術(shù)不需要嚴(yán)格無(wú)菌操作，減少了對(duì)儀器和設(shè)備的資金投入，操作更為方便高效，更有利于大規(guī)模培養(yǎng)4。

我國(guó)科研工作者對(duì)植物開(kāi)放式組織培養(yǎng)進(jìn)行了大量研究，并已對(duì)山丹丹馬鈴薯非洲菊大葉相思等植物建立了開(kāi)放式組織培養(yǎng)技術(shù)體系。雖然也有前人對(duì)杜鵑花開(kāi)放式組織培養(yǎng)進(jìn)行嘗試，但其技術(shù)體系還有待進(jìn)一步完善。因此，本文以西洋杜鵑（RhododendronhybridumKerGawl.）莖段為試驗(yàn)材料，探索不同抑菌劑在其開(kāi)放式組織培養(yǎng)中的影響效應(yīng)，篩選出最適抑菌劑及其使用濃度，建立西洋杜鵑花開(kāi)放式組織培養(yǎng)體系，以期為杜鵑花組培苗的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試西洋杜鵑品種為“四海波”，由浙江善鵑園藝有限公司生產(chǎn)基地提供，取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的當(dāng)年生幼嫩莖段為外植體。供試的5種抑菌劑均為市售品，包括硫酸卡那霉素、氨芐青霉素鈉（上海麥克林生化科技有限公司）、84消毒液（有效成分為NaCIO）（江蘇愛(ài)特福84股份有限公司）、代森錳鋅 80% 可濕性粉劑、多菌靈 50% 可濕性粉劑（四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

（1）培養(yǎng)基配制。西洋杜鵑誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方： 6-BA ；每升培養(yǎng)基添加瓊脂粉6.8g 蔗糖 30g ，將培養(yǎng)基 pH調(diào)至5.8，瓊脂未凝固前分別加入抑菌劑，充分?jǐn)嚢杈鶆颍唤?jīng)高溫高壓滅菌，定量分裝入潔凈的玻璃瓶中封口，冷卻后備用。對(duì)照組培養(yǎng)基采用高壓滅菌，分裝后于 壓力和 下滅菌 20min ，冷卻后備用。

（2）外植體的消毒。將選取的枝條剪除葉片，留下葉柄，浸入洗潔精稀釋液中 30min ，用軟毛刷輕輕刷洗杜鵑枝條，切成長(zhǎng) 3～5cm 帶腋芽莖段，再用流水沖洗60min ；將外植體轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，倒入 75% 酒精浸泡消毒30s，倒去酒精，再用無(wú)菌水沖洗3次，倒去無(wú)菌水，轉(zhuǎn)入無(wú)菌空瓶中，用84消毒液稀釋液浸泡 10min ，期間不斷振蕩，倒去消毒液，最后用無(wú)菌水沖洗4次，轉(zhuǎn)入無(wú)菌接種盤中備用。

（③接種與培養(yǎng)。 開(kāi)放式初代組織培養(yǎng)。選擇干凈、整潔的房間作為接種室，接種前用紫外燈照射0.5h。用接種刀將外植體切成帶有1～2個(gè)腋芽的莖段，接種在添加不同含量硫酸卡那霉素 （1mg/L.1.5mg/L. 2mg/L） 、氨芐青霉素鈉 （1mg/L.1.5mg/L.2mg/L）.84 消毒液 （1ml/L.1.5ml/L.2ml/L） 、代森錳鋅 80% 可濕性粉劑（0.1g/L，0.15g/L，0.2g/L） 及多菌靈 50% 可濕性粉劑 （0.5g/L， 1g/L.1.5g/L） 抑菌劑的初代培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基不高壓，對(duì)照組為培養(yǎng)基高壓且不添加抑菌劑的初代培養(yǎng)基。每個(gè)處理接種14瓶，每瓶接種2個(gè)莖段。培養(yǎng)室溫度 ，光照強(qiáng)度 ，光照時(shí)間 ，接種28d后觀察統(tǒng)計(jì)外植體的存活率、死亡率、污染率及生長(zhǎng)狀況。 開(kāi)放式增殖培養(yǎng)。將初代培養(yǎng)獲得的長(zhǎng)勢(shì)大小基本一致的無(wú)菌材料，接種在開(kāi)放式增殖培養(yǎng)基上，每組處理接種14瓶，每瓶接3個(gè)材料，30d后統(tǒng)計(jì)存活材料的增殖系數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

污染率 （%）= （污染瓶數(shù)/該處理接種總瓶數(shù)）×100% ；存活率 （%）= （存活外植體數(shù)/外植體接種總數(shù)）×100% ；增殖系數(shù) =外植體增殖芽總數(shù)/接種外植體總數(shù)；數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和SPSS20.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同抑菌劑對(duì)培養(yǎng)基效果的影響

不同抑菌劑對(duì)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。培養(yǎng)基中添加濃度為 1mg/L.1.5mg/L.2mg/L 的硫酸卡那霉素與氨芐青霉素鈉時(shí)，培養(yǎng)基透明度高且質(zhì)地適中，未出現(xiàn)明顯理化性質(zhì)改變，說(shuō)明其與培養(yǎng)基成分相容性較好。84 消毒液的添加濃度為 1ml/L.1.5mg/L. 2ml/L 時(shí)，培養(yǎng)基透明度與質(zhì)地均保持良好。隨著代森錳鋅 80% 可濕性粉劑添加濃度的提升，培養(yǎng)基透明度逐漸降低，質(zhì)地由適中轉(zhuǎn)為稍軟，可能與代森錳鋅的顆粒懸浮特性有關(guān)。培養(yǎng)基中加入 0.5g/L、1g/L、1.5g/L 的多菌靈 50% 可濕性粉劑后，其透明度顯著降低，質(zhì)地變軟，且高濃度≥1g/L時(shí)伴隨明顯農(nóng)藥味，表明多菌靈可能對(duì)培養(yǎng)基穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，添加抗生素類（硫酸卡那霉素與氨芐青霉素鈉）和84消毒液（NaClO）抑菌劑對(duì)培養(yǎng)基物理性質(zhì)影響較小，但化學(xué)農(nóng)藥類（代森錳鋅與多菌靈）在高濃度下會(huì)降低培養(yǎng)基透明度及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

2.2不同抑菌劑對(duì)開(kāi)放式初代培養(yǎng)的效果

通過(guò)對(duì)比15組添加抑菌劑及對(duì)照組（CK）的培養(yǎng)基污染率、外植體存活率及生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)抑菌劑種類與濃度對(duì)開(kāi)放式初代培養(yǎng)效果差異顯著，如表1所示。硫酸卡那霉素與氨芐青霉素鈉的添加濃度在 1mg/L. 1.5mg/L.2mg/L 時(shí)，污染率較高，存活率僅為 0～14.28% ，且外植體無(wú)新生莖葉或生長(zhǎng)停滯，表明該濃度抗生素抑菌效果有限。添加 和 1.5ml/L 的84消毒液，培養(yǎng)基污染率較低 （7.14% 和 14.29% ），存活率達(dá) 100% ，外植體莖段伸長(zhǎng)明顯，新生葉片呈淺綠色，但濃度提升至 2ml/L 時(shí)，外植體存活率下降，葉片黃化，可能是由于較高濃度次氯酸鈉的氧化作用對(duì)植物組織產(chǎn)生輕度損傷。培養(yǎng)基中代森錳鋅 80% 可濕性粉劑的添加濃度為0.1g/L.0.15g/L 時(shí)，污染率較低，存活率高，外植體生長(zhǎng)狀態(tài)與對(duì)照組接近，但濃度提升至 0.2g/L 時(shí)葉片黃化，可能因高濃度金屬離子積累抑制代謝。添加 0.5g/L 的多菌靈 50% 可濕性粉劑，外植體存活率為 78.57% ，但隨濃度升高，存活率下降至 64.29% ，莖段出現(xiàn)腐爛跡象，表明其抑菌效果有限且高濃度毒性顯著。對(duì)照組的污染率和外植體生長(zhǎng)狀況與84消毒液和代森錳鋅 80% 可濕性粉劑低濃度組相近，說(shuō)明開(kāi)放式培養(yǎng)使用合適抑菌劑可達(dá)到與傳統(tǒng)滅菌相近的效果。培養(yǎng)基中添加84消毒液 （1ml/L.1.5ml/L） 與代森錳鋅 80% 可濕性粉劑0.1g/L、0.15g/L在開(kāi)放式初代培養(yǎng)中表現(xiàn)出最佳抑菌效果與植物適應(yīng)性。

2.3不同抑菌劑對(duì)開(kāi)放式增殖培養(yǎng)的效果

初代培養(yǎng)篩選后，硫酸卡那霉素與氨芐青霉素鈉因污染率過(guò)高被排除，后續(xù)增殖培養(yǎng)重點(diǎn)評(píng)估84消毒液、代森錳鋅 80% 可濕性粉劑及多菌靈 50% 可濕性粉劑的效果。不同抑菌劑對(duì)西洋杜鵑增殖培養(yǎng)的影響如圖1所示。代森錳鋅 80% 可濕性粉劑在3個(gè)測(cè)試濃度下均表現(xiàn)出較高的增殖系數(shù)和較好的生長(zhǎng)狀況。隨著濃度的增加，增殖系數(shù)略有下降，但總體影響不大。84消毒液在適當(dāng)?shù)臐舛认?（1ml/L.1.5ml/L） 也表現(xiàn)出較高的增殖系數(shù)和較好的生長(zhǎng)狀況，但在較高濃度下 ，其增殖系數(shù)有所下降。多菌靈 50% 可濕性粉劑在3個(gè)測(cè)試濃度下均表現(xiàn)出較低的增殖系數(shù)和較差的生長(zhǎng)狀況，部分出現(xiàn)頂端枯死現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)其不適合西洋杜鵑的開(kāi)放式組織培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加代森錳鋅 80% 可濕性粉劑 （0.15g/L） 與84消毒液 （1.5ml/L） 在增殖培養(yǎng)階段仍保持高效抑菌能力，且對(duì)芽體增殖無(wú)顯著抑制，表明開(kāi)放式培養(yǎng)結(jié)合適宜抑菌劑可實(shí)現(xiàn)高效增殖。

3結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)比5種抑菌劑在“四海波”西洋杜鵑開(kāi)放式組織培養(yǎng)中的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加84消毒液（1ml/L、1.5ml/L） 和代森錳鋅 80% 可濕性粉劑 （0.15g/L） 的綜合表現(xiàn)最優(yōu)，其污染率低（ ≤14.29%λ 、存活率高（100%） ，且外植體生長(zhǎng)與增殖能力接近傳統(tǒng)滅菌培養(yǎng)。84消毒液的有效成分次氯酸鈉（NaCIO）通過(guò)氧化作用破壞微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，兼具廣譜抑菌性及低殘留特性，與Peiris等在馬鈴薯開(kāi)放式培養(yǎng)中的結(jié)論一致。代森錳鋅作為保護(hù)性殺菌劑，通過(guò)抑制病原菌孢子萌發(fā)降低污染，但其顆粒特性可能影響培養(yǎng)基透明度，需控制濃度以避免物理干擾。 1mg/L，1.5mg/L，2mg/L 硫酸卡那霉素與氨芐青霉素鈉因抑菌效果差，不適用于西洋杜鵑開(kāi)放式培養(yǎng)。多菌靈 50% 可濕性粉劑雖在低濃度 （0.5g/L） 下具有一定抑菌效果，但高濃度毒性顯著，且影響培養(yǎng)基質(zhì)量和殘留農(nóng)藥味可能限制其應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著84消毒液和代森錳鋅濃度 80% 可濕性粉劑的添加濃度提高，雖然污染率有所下降，但外植體存活率和生長(zhǎng)狀況也受到一定程度的影響。因此，需要進(jìn)一步優(yōu)化抑菌劑的濃度，以找到最佳的抑菌效果和外植體生長(zhǎng)狀況的平衡點(diǎn)。除了抑菌劑的選擇和濃度優(yōu)化外，培養(yǎng)基的優(yōu)化也是提高開(kāi)放式組織培養(yǎng)效果的重要途徑。在本實(shí)驗(yàn)中，雖然不同抑菌劑對(duì)培養(yǎng)基的透明度、質(zhì)地等有所影響，但總體來(lái)說(shuō)，并不足以完全解釋不同抑菌劑對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響。因此，未來(lái)可以進(jìn)一步探索培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，以提高外植體的生長(zhǎng)速度和繁殖效率。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，西洋杜鵑開(kāi)放式組培的最適抑菌劑為84消毒液 （1.5ml/L） 或代森錳鋅 80% 可濕性粉劑 （0.15g/L） ，二者可有效控制污染并促進(jìn)外植體生長(zhǎng)，為工廠化育苗提供了低成本、高效率的技術(shù)方案。未來(lái)研究可進(jìn)一步優(yōu)化抑菌劑組合或探索天然抑菌物質(zhì)，以提升開(kāi)放式培養(yǎng)的穩(wěn)定性與安全性。

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基金項(xiàng)目：嘉興市公益性研究計(jì)劃項(xiàng)目“光照強(qiáng)度對(duì)攜李果實(shí)花青苷合成的調(diào)控機(jī)理研究”（2024AY10058）；科研項(xiàng)目“西洋杜鵑開(kāi)放式組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化”（JZYY202422）。

作者簡(jiǎn)介：毛雅琳（1995一），女，漢族，安徽宿州人，碩士研究生，主要從事植物組織培養(yǎng)研究工作。