基于創新能力培養的“細胞生物學實驗”教學改革與探索

摘"要：為了提升“細胞生物學實驗”教學的質量，將金屬離子誘導細胞死亡的實驗設計引入“細胞生物學實驗”教學。實驗項目以細胞死亡為主題，鼓勵學生自主設計實驗，從細胞群體、細胞個體、細胞核等三個層面探究銅離子在誘導細胞死亡中的具體效應。銅離子誘導細胞死亡的過程呈現明顯的劑量依賴效應，且細胞核破裂現象清晰，便于觀察，適合作為“細胞生物學實驗”課程的綜合探究類實驗開展。該教學設計整合了MTT比色法、細胞形態觀察法、熒光染色法等實驗技術，旨在提高學生的綜合素質和創新能力。

關鍵詞：細胞生物學；實驗教學；創新能力；細胞死亡；銅離子

Reform"and"Exploration"of"\"Cell"Biology"Experimental\""Teaching

Based"on"Cultivation"of"Innovation"Ability

Shen"Hongyu"An"Sainan

Experimental"Teaching"Platform，Beijing"Normal"University"at"Zhuhai"GuangdongZhuhai"519087

Abstract：To"enhance"the"quality"of"cell"biology"experiment"teaching，the"experimental"design"of"metal"ioninduced"cell"death"is"introduced"into"cell"biology"experiment"teaching.The"project"revolves"around"cell"death，encouraging"students"to"independently"design"experiments"to"investigate"copper"ions'"effects"on"cell"death"from"three"aspects：cell"population，individual"cells，and"the"nucleus.The"process"of"copper"ioninduced"cell"death"shows"a"clear"dosedependent"effect，and"the"phenomenon"of"nuclear"fragmentation"is"clear"and"easy"to"observe，making"it"suitable"for"conducting"comprehensive"exploratory"experiments"in"cell"biology"experimental"courses.This"teaching"design"integrates"techniques"like"MTT"colorimetry，cell"morphology"observation，and"fluorescence"staining，aiming"to"boost"students'"comprehensive"abilities"and"innovative"thinking.

Keywords：cell"biology；experimental"teaching；innovation"ability；cell"death；copper"ion

“細胞生物學實驗”是生物科學專業師范生課程體系的重要組成部分。生物科學師范生不僅要牢固掌握細胞生物學的基礎理論和實踐技能，還應具備對生物科學前沿領域的敏銳洞察力和持續跟進的能力。然而，現行的教學實驗內容以基礎性和驗證性實驗為主，缺乏探究性，在一定程度上限制了學生在實驗設計和創新思維方面的鍛煉。

《細胞死亡》是“細胞生物學”課程的重要章節，也是當前科學研究的前沿領域［1］。細胞死亡主要表現為細胞膜結構的解體和細胞內容物的釋放，包括凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡和銅死亡等方式［2］。引起細胞死亡的因素很多，其中金屬離子誘導的細胞死亡是近年來細胞生物學的研究熱點［3］。銅是細胞必需的微量金屬元素。過量的銅離子具有氧化性，會對線粒體造成損傷，進而誘發細胞毒性［4］。

在細胞死亡相關的實驗教學設計中，常常引入細胞殺傷藥物檢測對細胞死亡的影響［56］，而金屬離子相關的細胞學效應探索較少。最近的研究揭示，高濃度的銅離子會誘發細胞發生銅死亡，且這一過程受到蛋白質脂酰化機制的調控［7］。因此，基于銅離子設計綜合性探究實驗，有利于使學生對銅金屬組學這一前沿領域有感性認識，并加深學生對細胞死亡的理解，培養學生的綜合素質和創新能力。

1"實驗原理

MTT是3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴鹽。MTT比色法是測定貼壁細胞活力的常用方法，其原理是活細胞線粒體里的琥珀酸脫氫酶能將外源性的黃色MTT還原成不溶于水的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞里，而死細胞無此功能。在一定范圍內，甲臜在490nm或570nm波長處的吸光值與細胞數量成正比。IC50值是半數抑制濃度，即對細胞生長抑制率為50%時的藥物濃度。IC50值越小，藥物抑制細胞生長的作用越強。因此，可根據IC50值判斷銅離子對細胞死亡的效力。

熒光染料Hoechst"33342可以穿透正常細胞和凋亡細胞的細胞膜，與細胞核DNA結合發出藍色熒光，而凋亡細胞的膜通透性增強，因此凋亡細胞的熒光強度比正常細胞的高。此外，碘化丙啶（Propidium"Iodide，PI）染料通常無法穿透細胞膜完整的正常細胞和早期凋亡細胞，而能穿透喪失細胞膜完整性的晚期凋亡和壞死細胞，因此后者可被PI染料染色發出紅色熒光。根據這些特性，利用Hoechst"33342結合PI染料對細胞進行雙染色，就能將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區分開來。

2"教學設計

2.1"教學目標

2.1.1"引入細胞死亡相關的教學內容

本實驗引入基于銅金屬組學的研究熱點，具有一定的前沿性，對原有實驗教學內容是很好的補充，使學生從細胞群體、細胞個體、細胞核等多個角度觀察到銅離子對細胞死亡的影響。

2.1.2"培養學生的綜合探究能力

實驗設計建立在學生已掌握的基礎實驗技能之上，鼓勵學生利用已有知識和技能探究新的科學問題，有利于提高知識遷移運用的能力。實驗結果具有一定的開放性，有助于提高學生提出假設、設計實驗、分析和解決問題的綜合探究能力。

2.2nbsp;教學重點和難點

教學重點在于通過綜合性的實驗設計，鞏固細胞傳代、細胞計數、熒光染色、MTT比色法等基本實驗技術，熟練掌握熒光顯微鏡的使用，以及對細胞死亡的多角度分析方法。

教學難點在于引導學生圍繞“銅離子對細胞死亡的效應”這一新的問題，綜合應用所學技能，獨立設計實驗方案并實施實驗。

2.3"教學安排

本校“細胞生物學實驗”課程針對三年級下學期的生物專業本科生開設，學生已在前期的實驗課程學習細胞傳代、細胞計數、細胞微絲骨架的熒光染色、MTT比色法測定細胞群體的相對數量等實驗內容。因此，該實驗適宜作為綜合性的探究實驗，設置在學習完以上內容后的兩周內完成。

采用翻轉課堂教學模式進行教學［8］。（1）教師提出“銅離子是否會影響細胞死亡”的問題后，課前要求學生以小組為單位查閱資料并進行小組討論。（2）課上引導學生提出實驗假設，思考如何運用所學過的實驗技術驗證銅離子誘導細胞死亡的現象，共同討論后，完善并實施實驗方案。（3）實驗完成后，各組同學整理并分析實驗數據，以組為單位進行項目匯報，與教師和其他同學共同討論和反思實驗結果。

2.4"實驗試劑和儀器

實驗試劑：MTT溶液、硫酸銅溶液、PI溶液、Hoechst"33342溶液、二甲基亞砜、DMEM培養基、青霉素和鏈霉素、胎牛血清、胰酶、無菌離心管。

實驗儀器：酶標儀、熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、超凈工作臺、細胞培養箱、臺式離心機。

3"實驗步驟

（1）教師為每個小組準備1瓶細胞。第1天學生用胰酶消化細胞鋪到96孔板，每孔接種10000個細胞，體積為100μL，培養過夜。設置調零孔為加空白培養基，以扣除非特異性背景值。鋪板剩下的細胞進行傳代培養，供后續實驗使用。

（2）用無血清DMEM將銅離子稀釋為不同的濃度梯度，每孔加入100μL不同濃度的銅離子，設置4～6個復孔。

（3）銅離子處理細胞24h后，每孔加10μL"MTT，細胞培養箱孵育4h。

（4）吸走培養液，每孔加入100μL二甲基亞砜，使用酶標儀在570nm檢測吸光值，計算銅離子處理后的細胞存活率。

（5）用胰酶消化細胞鋪到6孔板，用銅離子處理細胞24h。

（6）倒置顯微鏡觀察細胞狀態后，收集脫落細胞和貼壁細胞，1000rpm離心10min。

（7）棄上清后，100μL"PBS重懸細胞，使用PI和Hoechst"33342染色10min。

（8）將細胞懸液滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

4"實驗結果

4.1"MTT法測定銅離子對細胞活性的影響

在MTT法檢測細胞存活率的實驗中，隨著銅離子濃度增大，細胞的存活率呈現下降趨勢。當細胞存活率被抑制一半時，銅離子濃度為47.7μM，說明銅離子對細胞有一定的細胞毒作用（見圖1）。

4.2"明場視野下低倍鏡觀察細胞形態

在顯微鏡下，觀察到正常的細胞呈現為多邊形，細胞內容物完整，細胞膜界限清晰，邊緣光亮、透明。銅離子處理后的大量細胞變圓、脫落，貼壁細胞形態不規則，表面有突起（圖2）。細胞形態學的變化提示了銅離子能夠誘導細胞死亡。

4.3"熒光染色觀察細胞核的狀態

Hoechst"33342熒光染色結果顯示，銅離子處理細胞后，部分細胞核破裂，細胞核形態不完整。部分細胞被染成低藍色和高紅色，說明其細胞膜已經破損，因而能被PI染料穿透并染色，是發生晚期凋亡或壞死的細胞。部分細胞被染成高藍色和低紅色，說明該細胞的膜通透性增強但還未完全破損，可能發生了早期凋亡（見圖3）。

5"實驗安排的可行性

該實驗項目安排6課時，前期階段，教師提供培養至對數期的細胞，學生在超凈臺中計數和接種，并將銅離子稀釋至不同的濃度梯度后，加入貼壁后的細胞培養一定時間，使用酶標儀進行檢測。后期階段，學生根據前期測得的銅離子抑制濃度數據，選擇相應濃度的銅離子處理細胞，經消化、染色等步驟制備樣品，使用熒光顯微鏡進行觀察。

結語

該實驗是融入細胞生物學學科的“細胞死亡”這一研究熱點的特色實驗項目，綜合性強并具有一定的探究價值。該實驗為學生提供了一個將理論知識與實際操作緊密結合的機會，通過親手設計并執行實驗方案，學生能夠深入理解生物學的復雜性和多樣性，加深對細胞死亡現象及其機制的認識。這一過程不僅鞏固了課堂所學的實驗技術，還激發了學生的探究興趣，培養了科學思維和創新能力。

參考文獻：

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［7］TSVETKOV"P，COY"S，PETROVA"B，et"al.Copper"induces"cell"death"by"targeting"lipoylated"TCA"cycle"proteins［J］.Science，2022，375（6586）：12541261.

［8］南剛，尉丁，蔣建利，等.基于微課和翻轉課堂的混合式教學在細胞生物學進展教學中的應用［J］.中國細胞生物學學報，2024，46（5）：10301037.

基金項目：北京師范大學珠海校區教學建設與改革項目（jx2023027）

作者簡介：沈虹宇（1993—"），女，漢族，廣東揭陽人，博士研究生，實驗師，研究方向：分子細胞生物學。