獼猴桃根部源分散泛菌葡萄糖異構酶異源表達研究

中圖分類號：0561.3 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2025）04-0035-06

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2025.04.006

Study on Heterologous Expression of Glucose Isomerase from Pantoea dispersa of Kiwifruit Root Origin

ZHI Yong， XIA Bo* （College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410o00， China）

Abstract：Toaddressthelimitations of traditionalhigh-fructose syrup production，such as lowcatalytic efficiencyof conventional glucose isomerases，this study focused on the heterologous expressionand optimization of a novel glucose isomerase， P d -xylA， derived from Pantoea dispersa isolated from kiwifruit roots. The P d. -xylA gene was cloned and expressed in Escherichia coli BL21 （DE3），folowed by systematic optimization of induction conditions including temperature and IPTG （isopropyl- β D -thiogalactopyranoside） concentration. The results demonstrated that the optimal induction conditions were and 0.1 mmol/L IPTG， under which P d？ -xylA achieved the highest soluble expressonlevel.This study provided theoretical support for the development of enzyme resources with enhanced catalytic activity and industrial applicability， thereby advancing the biotechnological productionof

high-fructose syrup.

Keywords： Pantoea dispersa； glucose isomerase； optimization of induction conditions； heterologous expression

在食品工業和醫藥領域，隨著消費者對甜味產品需求的不斷增長，甜味劑的應用越來越廣泛。果葡糖漿（high fructose corm syrup，HFCs）甜度高、溶解性良好、穩定性強，生產成本較低，已成為重要的糖類替代品，廣泛應用于飲料、糖果、烘焙食品等多個領域。與傳統蔗糖相比，果葡糖漿在低溫環境下不易結晶，且具有更高的甜味，備受食品生產企業的青睞。果葡糖漿按照果糖含量的不同，可分為HFCS-42、HFCS-55和HFCS-90等幾種類型，分別含有 42%55% 和 90% 的果糖，用途各異[2-4]。

果葡糖漿的生產依賴于葡萄糖異構酶（glucoseisomerase，GI），GI 又稱為木糖異構酶（xylose isomerase，xylA），能夠將葡萄糖轉化為果糖，是果葡糖漿生產過程中的核心催化劑。目前，果葡糖漿的生產主要通過微生物酶轉化法完成，主要來源是微生物，尤其是嗜熱或嗜堿的細菌和放線菌。這種方法不僅成本較低，而且減少了酸水解法生產中的副產物，具有較好的環境友好性。葡萄糖異構酶的獲得方法有天然菌株發酵生產、異源表達。然而，葡萄糖異構酶的表達效率并不高，這成為果葡糖漿工業化生產中的關鍵技術瓶頸之一[6-10]。

在食品工業中，開發微生物酶具有重要意義。研究表明分散泛菌體內包含蔗糖異構酶以及參與類胡蘿卜素轉化的相關酶系，可為不同酶系在食品加工中的應用奠定基礎。同時，對分散泛菌體內其他類型酶資源的挖掘也值得研究。本研究以實驗室前期從獼猴桃根部篩選出的分散泛菌（Pantoeadispersa）為研究對象，成功克隆了其葡萄糖異構酶基因（Pd-xylA），并在大腸桿菌BL21（DE3）中實現了異源表達。為了確保該酶的高效生產，本研究系統地優化了誘導表達條件，包括溫度、IPTG濃度等因素；通過對不同誘導條件的測試，確定最佳的表達參數，以期為葡萄糖異構酶的工業化應用提供理論指導，也為果葡糖漿的高效生產提供技術支持。

大腸桿菌BL21（DE3）細菌蛋白制備裂解液（含PBS），上海生工生物工程股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質粒小提中量試劑盒、pGM-T連接試劑盒、IPTG（ 50mg/mL 氨芐西林鈉鹽 ，天根生化科技有限公司；His標簽純化試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司； Tris- 硼酸電泳緩沖液（ 10×TBE） ，雷根生物科技有限公司； ，寶日醫生物技術（北京）有限公司；三色預染蛋白Marker（10-310KD），安諾倫（北京）生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

T100PCR擴增儀，美國伯樂公司；DYY-600C電泳儀，北京東方瑞利電泳設備有限公司；HB120-S恒溫金屬浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；DUT-486藍光顯色儀，上海巴玖實業有限公司；ZQPW70恒溫振蕩培養箱，天津萊玻特瑞儀器設備有限公司；SPX-250BSH-II恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；FA20048分析天平，精度0.0001g ，上海佑科儀器儀表有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；HR-T16M臺式高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；JY96-IIN超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因克隆

根據 P d. -xylA序列設計兩端含酶切位點的引物，以分散泛菌基因組DNA為模板進行克隆。正向引物中引入EcorI酶切位點，反向引物中引入 NotI 酶切位點，引物序列表1所示。

PCR反應程序： 預變性 變性 30s ， 退火 30s，72degreeC 延伸 60s ，進行30次循環， 后延伸 5min 。反應結束后取 ${5＼upmu＼mathrm{L}}$ PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 基因的T/A克隆

1材料與方法

1.1 材料與試劑

分散泛菌，314實驗室 保存；克隆菌株大腸桿菌 DH5α 、表達菌株

將純化回收的PCR產物通過T4DNA連接酶與pGM-T載體進行連接，構建重組克隆質粒，將PCR產物與pGM-T載體以及T4DNA連接酶裝入離心管，輕輕彈動離心管以混合內容物，室溫離心 孵育連接

表1引物序列

過夜，反應結束后， 保存備用，并進行藍白斑篩選。

1.3.3 質粒鑒定

將經過雙重篩選得到的白色菌落接種于 1mL LB（Luria-BertaniBroth）液體培養基（含濃度 50μg/mL 氨芐西林）中培養， 搖床振蕩培養過夜，保存菌種后提取質粒進行PCR檢測。

1.3.4表達載體的構建

對提取的質粒表達載體pGBTNH2分別用EcorI和NotI兩個限制性內切酶在 下酶切 3h C

1.3.5 IPTG誘導

按接種量 3% ，將種子液轉接到 15mL 卡那霉素抗性的LB培養液中，培養 4～5h ，直至 為 0.5～0.6 ，加人IPTG至終濃度 誘導表達過夜，采用SDS-PAGE電泳分析樣品，觀察酶誘導情況，視情況優化誘導條件（誘導溫度、誘導時間及IPTG濃度）。

1.3.6 誘導溫度條件優化

將過夜活化培養的大腸桿菌BL21（DE3）-pGBTNH2-Pd-xylA 按 3% 接種量接種至含 50μg/mL 氨芐青霉素抗生素的LB液體培養基（ 20mL 中， 培養至菌液 為 0.5～0.6 ，加入終濃度為0.1mmol/L的IPTG，于 $16、28、37＼mathrm{～＼textdegreeC}$ 誘導過夜后，取 1mL 誘導后菌液進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.3.7 IPTG誘導濃度的優化

將過夜活化培養的大腸桿菌BL21 （DE3）-pGBTNH2-Pd-xylA 按 3% 接種量接種至新的含50μg/mL 氨芐青霉素抗生素的LB液體培養基（ 20mL 中， 培養至菌液 約 0.5～0.6 ，分別添加IPTG至終濃度 IPTG，于 誘導過夜后，取 1mL 誘導后菌液進行SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠）電泳檢測。

1.3.8 重組酶的純化

按照His標簽純化試劑盒說明書要求進行。取 4mL P d. -xylA破碎粗酶液與經過平衡的 50% BeyoGoldTMHis-tagPurificationResin混勻，在冰浴環境下，于脫色搖床中緩慢搖動 60min ，使得His標簽重組蛋白與鎳柱充分結合。將混合物裝入親和層析柱空柱管中并收集流出液（FT），再用 0.5mL 的非變性洗滌液從柱頭端緩慢滴人，洗滌1次，含有雜蛋白的洗滌液W1收集至離心管中，最后用非變性洗脫液洗柱6次，收集洗脫液（E1～E6）至離心管中。對得到的各組分收集液進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.4數據處理與統計分析

所有實驗過程均獨立重復至少3次；使用GraphPadPrism9.0 統計軟件進行數據分析和處理；數據以“平均值 ± 標準差” 的形式表示。對各組進行單因素方差分析，然后進行新復極差法多重比較檢驗。

2結果與分析

2.1 Pd-xyIA基因的克隆

通過PCR擴增獲得 P d-x y l A 基因，并對其產物進行電泳分析，結果顯示電泳條帶位置與理論值相符 1323bp ，如圖1所示。

隨后，對電泳產物進行切膠回收，獲取Pd-xylA基因，并將其構建至pGEM-T載體中，生成pGEM-T-Pd-xylA克隆載體。該載體隨后被轉化至宿主大腸桿菌 DH5α 中，利用藍白斑篩選法篩選陽性克隆，篩選結果如圖2所示。通過提取陽性克隆的質粒，并將其送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。所得序列利用NCBI數據庫中的Blastn工具進行核酸序列比對，結果表明該序列與序列號WP_222951480.1的相似度為100% ，由此確認Pd-xylA基因已成功克隆。

2.2表達載體構建

首先對表達載體pGBTNH2和 P d. -xylA基因片段進行雙酶切處理，隨后使用T4連接酶將兩者按 1：3 摩爾比在過夜條件下進行連接。連接產物轉化至大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，隨后挑取轉化菌株并送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序分析。測序結果使用SnapGene軟件進行序列比對，表明載體與基因片段成功連接，如圖3所示，所得序列與 P d. -xylA基因完全匹配，證明了表達載體pGBTNH2與 P d. -xylA基因片段成功連接。

2.3 蛋白表達

通過SDS-PAGE電泳分析，結果顯示在誘導前后樣品中存在顯著差異。與誘導前樣品相比，誘導后樣品的破碎蛋白上清液在 49kDa 位置出現明顯的蛋白條帶，而破碎沉淀中的蛋白量顯著少于上清液，如圖4所示。該蛋白條帶與Expasy網站預測的 P d -xylA蛋白的理論分子量（ $＼mathrm{49＼kDa}$ ）一致（https：//web.expasy.org/protparam/），表明Pd-xylA蛋白成功以可溶性形式表達。

2.4誘導溫度的優化

由圖5可知，隨著誘導溫度的升高，蛋白的可溶性表達逐漸減少。較低溫度有助于蛋白的正確折疊，減少包涵體的形成，但 的低溫環境會顯著減緩菌體的生長速度，如圖5所示。經過比較， 被確定為Pd-xylA蛋白的最佳誘導溫度。在較高溫度下，蛋白折疊速度過快，導致可溶性表達量減少。誘導溫度不僅影響蛋白的表達水平，還對菌體的生長產生一定的影響。研究表明，低溫表達有助于提高可溶性蛋白的表達-4，因此，本研究最終選擇 作為Pd-xylA蛋白的最優誘導溫度。

2.5 IPTG誘導濃度優化

由圖6可知，隨著IPTG濃度的增加，觀察到的重組Pd-xylA蛋白表達量并未發生顯著變化。這可能是由于較高濃度的IPTG對菌體生長產生抑制作用，當IPTG濃度超過聞值時，菌體生長減緩，從而導致蛋白表達量的變化不顯著[15-21]。如圖6所示，當IPTG濃度為 0.1mmol/L 時，蛋白的可溶性表達量達到最高。因此，本研究確定0.1mmol/L 為Pd-xylA蛋白表達的最佳IPTG誘導濃度。

M：Marker；1：無誘導劑誘導； IPTG誘導；3：0.1mmol/LIPTG誘導；4：0.2mmol/LIPTG誘導；5：0.5mmol/LIPTG誘導；6：1mmol/LIPTG誘導；7：5mmol/LIPTG誘導

Fig.6 IPTG concentration optimization

2.6 蛋白純化

根據Pd-xylA的理論分子量為 49kDa ，圖7所示，經過鎳柱純化后，可以看到清晰的單條帶，即為Pd-xylA的純化條帶，這與預期設計的蛋白分子質量一致。如圖7所示，Pd-xylA經過鎳柱純化后與雜蛋白分離。

M：Marker；E1～E6：含有咪唑的洗脫液洗脫次數；FT：過柱流穿液；W1：不含咪唑的洗滌液洗柱次數；CL：細菌裂解液

3結論

迄今為止，xylA酶憑借其催化葡萄糖轉化為果糖的特性，已被廣泛應用于工業果葡糖漿的生產。因此，開發不同來源的xylA酶用于工業生產具有重要意義。來自細菌的xylA酶在工業化應用中具有生產成本低、反應條件溫和、產率高等優勢，因而更具應用潛力。然而，迄今尚無關于來源于分散泛菌（Pantoeadispersa）的xylA酶在大腸桿菌中表達條件優化的相關報道。

本研究成功構建了含有Pd-xylA基因的重組表達質粒，并通過單因素優化實驗，確定了最佳表達條件：誘導溫度為 ，IPTG濃度為 0.1mmol/L 在此條件下，成功獲得大量重組Pd-xylA蛋白。該研究為未來工業化酶法生產果葡糖漿提供了理論依據和技術支持，對于加速果葡糖漿在食品、保健品及醫療領域的產業化應用，并降低相關應用成本具有重要的推動作用。

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