七葉皂苷對RAW264.7巨噬細胞炎癥模型的作用研究

[摘要]"目的"研究七葉皂苷（Escin）對巨噬細胞極化因子、炎癥因子和炎癥相關通路的調控作用。方法"分別使用0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μmol/L的Escin處理RAW264.7巨噬細胞，MTT法測定不同濃度Escin對細胞活性的影響；采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，根據處理方式將細胞分為6組：空白組、模型組（500ng/ml"LPS）、治療1組（500ng/ml"LPS+0.5μmol/L"Escin）、治療2組（500ng/ml"LPS+1.0μmol/L"Escin）、治療3組（500ng/ml"LPS+2.0μmol/L"Escin）、治療4組（500ng/ml"LPS+4.0μmol/L"Escin）。蛋白質印跡法檢測Escin對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated"protein"kinase，MAPK）信號通路的蛋白表達及巨噬細胞相關分子表達的影響。結果"0.5～5.0μmol/L"Escin對RAW264.7巨噬細胞沒有毒性。蛋白質印跡實驗結果顯示，4.0μmol/L"Escin顯著下調腫瘤壞死因子-α表達（Plt;0.05），0.5～4.0μmol/L"Escin顯著上調CD206和CD163的表達（Plt;0.05）；0.5～4.0μmol/L"Escin顯著下調胞外信號調節激酶的表達（Plt;0.05），4.0μmol/L"Escin顯著下調c-Jun氨基端激酶的表達（Plt;0.05）。結論"Escin在體外可一定程度抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞M1型極化，促進M2型極化，并通過調控MAPK信號通路，發揮Escin對類風濕關節炎的治療作用。

[關鍵詞]"七葉皂苷；抗炎；作用機制；RAW264.7巨噬細胞

[中圖分類號]"R967""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.16.016

Study"on"the"effect"of"Escin"in"RAW"264.7"macrophage"inflammatory"model

HU"Yang，"SUN"Guangchen

College"of"Pharmacy，"Guilin"Medical"University，"Guilin"541199，"Guangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"study"the"regulatory"effects"of"Escin"on"macrophage"polarization"factors，"inflammatory"factors"and"inflammation-related"pathways."Methods"RAW"264.7"macrophages"were"treated"with"Escin"at"concentrations"of"0"，"0.5，"1.0，"2.0，"5.0，"10.0，"and"20.0"μmol/L"respectively."The"effects"of"different"concentrations"of"Escin"on"cell"viability"were"determined"by"the"MTT"assay."The"inflammation"model"of"RAW264.7"macrophages"was"induced"by"lipopolysaccharide"（LPS）."The"cells"were"divided"into"6"groups"according"to"treatment"methods："Blank"group，"model"group"（500ng/ml"LPS），"treatment"group"1"（500ng/ml"LPS+0.5μmol/L"Escin），"treatment"group"2"（500ng/ml"LPS+1.0μmol/L"Escin），"treatment"groupnbsp;3"（500ng/ml"LPS+2.0μmol/L），"and"treatment"group"4"（500ng/ml"LPS+4.0μmol/L"Escin）."Western"blotting"was"used"to"detect"the"effect"of"Escin"on"the"expression"of"mitogen-activated"protein"kinase"（MAPK）"signaling"pathway"proteins"and"the"expression"of"macrophagy-related"molecules"in"the"LPS-induced"RAW264.7"macrophage"inflammation"model."Results"0.5-5.0μmol/L"Escin"had"no"toxicity"to"RAW264.7"macrophages."The"results"of"the"Western"blotting"experiment"showed"that"4.0μmol/L"Escin"significantly"downregulated"the"expression"of"tumor"necrosis"factor–α"（Plt;0.05），"and"0.5-4.0μmol/L"Escin"significantly"upregulated"the"expressions"of"CD206"and"CD163"（Plt;0.05）."0.5-4.0μmol/L"Escin"significantly"downregulated"the"expression"of"extracellular"signal-regulated"kinase"（Plt;0.05），"and"4.0μmol/L"Escin"significantly"downregulated"the"expression"of"c-Jun"N-terminal"kinase"（Plt;0.05）."Conclusion"In"vitro，"Escin"can"to"a"certain"extent"inhibit"LPS-induced"M1-type"polarization"of"RAW264.7"macrophages，"promote"M2-type"polarization，"and"exert"the"therapeutic"effect"of"Escin"on"rheumatoid"arthritis"by"regulating"the"MAPK"signaling"pathway.

[Key"words]"Escin;"Anti-inflammatory;"Action"mechanism;"RAW"264.7"macrophage

類風濕關節炎（rheumatoid"arthritis，RA）是一種病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病，可伴隨多系統損害。研究表明RA的發病與多種細胞表型和炎癥相關信號通路有關[1-2]。涉及的細胞主要包括巨噬細胞、滑膜細胞、成骨細胞和破骨細胞等[3-5]；涉及的分子機制包括Toll樣受體（Toll-like"receptor，TLR）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated"protein"kinase，MAPK）信號通路和JAK-STAT信號通路等[6]。七葉皂苷（Escin）是由七葉樹干燥成熟的種子即傳統中藥娑羅子中提取的一類三萜皂苷化合物[7]。娑羅子具有寬中、理氣、殺蟲之功效，臨床多用于胸腹脹悶、胃脘疼痛等治療[8]。Escin作為其主要活性成分，具有抗炎、抗滲出、抗腦水腫、抗腫瘤、增加靜脈張力、保護胃腸道等多種作用，亦可用于治療各類術后軟組織腫脹[9]。研究表明Escin可通過影響糖皮質激素受體相關信號分子、核因子κB信號通路，調節腫瘤壞死因子-α（tumor"necrosis"factor"alpha，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β等炎癥因子的表達，在炎癥治療中發揮重要作用[10-12]。根據RA的發病機制與Escin的藥理作用，推斷Escin對RA有潛在治療作用，但目前國內外并無報道Escin是否對巨噬細胞極化產生影響。本實驗通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導RAW264.7巨噬細胞，在體外條件下研究Escin對巨噬細胞極化因子和MAPK信號通路的調控作用，探討Escin對RA的潛在治療機制。

1""材料與方法

1.1""實驗材料

1.1.1""實驗細胞""小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自武漢梓杉生物技術有限公司。

1.1.2""實驗試劑""Escin（貨號：wkq23021606）購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度97%。LPS購自美國Sigma-Aldrich公司。DMEM高糖培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司。噻唑藍、二甲基亞砜購自Solarbio公司。TNF-α（貨號：AF7014）購自江蘇親科生物研究中心有限公司。胞外信號調節激酶（extracellular"signal-regulated"kinase，ERK）1+ERK2（貨號：ab184699）、c-Jun氨基端激酶（c-Jun"N-terminal"kinase，JNK）1+JNK2+JNK3（貨號：ab208035）、CD206（貨號：ab64693）、CD163（貨號：ab182422）、IL-10（貨號：ab189392）購自Abcam公司。p38（貨號：9212）購自Cell"Signaling"Technology公司。內參GAPDH（貨號：6004-1-Ig）購自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.1.3""實驗儀器設備""氣套式CO2培養箱購自Thermo"Fisher公司。光學顯微鏡購自Olympus公司。光柵型連續波長酶標儀購自NanoQuant公司。超聲波細胞破碎儀購自SONICS公司。

1.2""實驗方法

1.2.1""RAW264.7巨噬細胞培養""取處于對數生長期的RAW264.7巨噬細胞，采用臺盼藍法對活細胞進行計數，計算細胞數量。將細胞按照5×103/孔接種至96孔板中，貼壁培養過夜。分別使用0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μmol/L的Escin處理細胞，培養24h。

1.2.2""MTT法檢測不同濃度Escin對細胞活性的""影響""按1.2.1方法接種細胞于96孔板并給藥后檢測細胞活性。每孔加入20μl"MTT（5mg/ml）培養箱內培養4h。棄培養基，每孔加入200μl二甲基亞砜，搖床避光室溫孵育15min，酶標儀測定490nm處各組的光密度值，并計算細胞活力。

1.2.3""蛋白印跡實驗檢測炎癥因子及MAPK信號通路相關因子表達""將RAW264.7巨噬細胞以5×105/孔的密度接種于6孔板中，貼壁培養過夜，使用不同濃度的Escin預處理2h后加入500ng/ml"LPS處理24h。根據處理方式將細胞分為6組：空白組、模型組（500ng/ml"LPS）、治療1組（500ng/ml"LPS+0.5μmol/L"Escin）、治療2組（500ng/ml"LPS+1.0μmol/L"Escin）、治療3組（500ng/ml"LPS+2.0μmol/L"Escin）、治療4組（500ng/ml"LPS+4.0μmol/L"Escin）。細胞冰浴裂解后低溫離心，提取細胞總蛋白，使用BCA試劑盒對細胞總蛋白進行蛋白定量，加入上樣緩沖液，100℃加熱10min；采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離；將蛋白轉膜至PVDF膜；加入封閉液室溫封閉2h；洗滌后，孵育一抗過夜（TNF-α稀釋比例1∶500，ERK稀釋比例1∶10"000，JNK稀釋比例1∶2000，CD206稀釋比例1∶1000，CD163稀釋比例1∶1000，IL-10稀釋比例1∶1000，p38稀釋比例1∶1000，GAPDH稀釋比例1∶50"000）；洗滌后，室溫孵育二抗1h；洗滌后，涂抹發光液成像儀顯影得到蛋白影像。通過Image"Lab軟件計算條帶灰度值。目標蛋白表達水平以蛋白/內參GAPDH的比值表示。

1.3""統計學方法

采用SPSS"Statistics"20.0統計軟件進行數據分析，采用GraphPad"Prism"8軟件進行作圖分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""Escin對RAW264.7巨噬細胞活性的影響

0、0.5、1.0、2.0、5.0μmol/L的Escin并未對RAW264.7巨噬細胞的活性產生抑制作用，且0.5、1.0、2.0μmol/L的Escin可促進細胞增殖，10.0μmol/L的Escin造成細胞大量死亡，20.0μmol/L的Escin幾乎沒有細胞存活，見圖1。以上結果表明0.5～5.0μmol/L的Escin對RAW264.7巨噬細胞不具備細胞毒性。但5.0μmol/L"Escin給藥后，部分實驗孔中觀察到Escin對細胞造成輕微損傷，故選擇0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L的Escin進行后續實驗。

2.2""Escin對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞極化相關蛋白及炎癥因子表達的影響

與空白組相比，模型組的CD206、CD163、TNF-α、IL-10表達均顯著上調（Plt;0.05）。與模型組相比，4.0μmol/L"Escin顯著下調TNF-α表達（Plt;0.05），其他濃度Escin處理后，TNF-α表達未見顯著變化；0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L"Escin均顯著上調CD206和CD163表達（Plt;0.05）；經Escin處理后，IL-10表達未見顯著變化，見圖2。

2.3""Escin抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中MAPK信號通路相關蛋白表達

模型組的ERK和JNK表達水平顯著高于空白組（Plt;0.05）。與模型組比較，0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L"Escin顯著下調ERK表達（Plt;0.05）；4.0μmol/L"Escin顯著下調JNK表達（Plt;0.05）；Escin處理對p38的表達沒有影響，見圖3。

3""討論

生物出現組織損傷時，巨噬細胞聚集并向不同的細胞表型和功能狀態分化，引起炎癥反應，同時炎癥因子又可通過反饋機制激活單核細胞、巨噬細胞促進炎癥反應[13-15]。巨噬細胞分兩類極化狀態：M1型巨噬細胞主要產生TNF-α和IL-1等，可造成關節損傷；M2型巨噬細胞分泌抗炎細胞因子IL-10、轉化生長因子-β等，有助于血管生成、組織重塑和修復[16-17]。巨噬細胞M1/M2的不平衡影響RA進程，調節M1/M2平衡有助于控制RA病情[18]。

為深入研究Escin對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中M1/M2極化的影響，本研究首先評估Escin對RAW264.7巨噬細胞活性的作用。結果顯示0.5～5.0μmol/L"Escin對RAW264.7巨噬細胞均無顯著細胞毒性效應。然而，在5.0μmol/L"Escin處理組中，觀察到Escin對細胞造成輕微損傷。此外，后續實驗中LPS誘導亦會對細胞產生一定程度的損傷。因此，為防止細胞損傷對實驗結果造成影響，本研究未采用5.0μmol/L"Escin濃度，而是選擇0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L"Escin進行后續實驗。

TNF-α是重要的炎癥因子，TNF-α升高誘導巨噬細胞向M1型極化。本研究發現LPS誘導RAW264.7巨噬細胞后促炎因子TNF-α表達升高，表明LPS刺激后使巨噬細胞向M1型極化；Escin處理后TNF-α表達降低，表明Escin可抑制巨噬細胞向M1型極化。CD206和CD163是M2型巨噬細胞標志物，其表達在巨噬細胞受到LPS刺激后向M1型極化時理應呈現下降趨勢。然而，現有研究指出在LPS刺激作用下，細胞內IL-10表達量增加，促進巨噬細胞向M2型極化，增加M2型巨噬細胞標志物分泌[19]。本研究中，LPS刺激巨噬細胞后IL-10表達升高，進而導致CD206與CD163表達量增加。經Escin處理后CD206和CD163表達進一步升高，而IL-10表達未顯示出明顯變化。表明巨噬細胞向M2型極化的趨勢得到加強。Escin能抑制巨噬細胞向M1型極化，促進巨噬細胞向M2型極化，減輕炎癥癥狀。

研究表明RA發病的分子機制包括多種信號通路，其中MAPK信號通路的激活可導致炎癥，MAPK信號通路可激活包括p38、ERK、JNK等在內的多種信號通路[20]。MAPK信號通路激活可活化轉錄激活因子蛋白家族成員c-Fos和c-Jun，活化后的c-Fos和c-Jun可促進M1型巨噬細胞炎癥因子的合成釋放，在激活MAPK信號通路時，還可激活核因子κB信號通路。因此，抑制MAPK信號通路可起到雙重抗炎效果，有效治療RA[21]。本研究發現LPS刺激RAW264.7巨噬細胞后，ERK和JNK表達均上調，表明MAPK信號通路激活；經Escin處理后ERK和JNK的表達均顯著下調，表明Escin可抑制MAPK信號通路的蛋白表達，通過調控MAPK信號通路發揮抗炎作用。

綜上，本研究發現Escin在體外可一定程度抑制LPS誘導RAW264.7巨噬細胞M1型極化，促進M2型極化，并通過調控MAPK信號通路發揮抗炎作用，為Escin應用于RA治療提供一定的依據。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2025–03–18）

（修回日期：2025–05–15）