水稻對惡苗病菌侵染響應的蛋白質組分析

中圖分類號：S511；Q816 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）06-0126-10

ProteomeAnalysisofRiceResponsetoGibberellafujikuroi Infection

SHAO Lihua，LI Peng （Instituteof PlantProtection，HeilongjiangAcademyofLandReclamationSciences，Harbin15oo38，China）

Abstract： Bakanae disease，a common and highly harmful fungal disease of rice，seriously impacts rice yield.To clarifytheup-regulateddiferential proteins of high-resistance varieties inresponse to the bakanaepathogen，the TMT（tandem mass tag）quantitative proteomics technology was employed to compare the proteomes before and after infection with the bakanae pathogen，and the significantly differentially expressed proteins with P?0.05 and a fold change （FC）gt;1.2 or lt;0.83 were screened.The resultsshowed that 124up-regulatedand75 down-regulated differentially expressed proteins were screened.The 124 proteins with up-regulated expression were subjected to gene ontology（GO）enrichment analysis，and got 88 enrichment items，among which 4 items were significantly enriched， including 2 biological processes （response to stress and response to oxidative stress），2 molecular functions （peroxidase activityand hemebinding），which should be beneficial toremove peroxides in rice bud tissueand had a protectiveefect oncels.Atotalof45 pathways were obtainedby（kyoto encyclopediaof genes and genomes KEGG） enrichment analysis，and3 pathways were significantly enriched for upregulated differential proteins including phenylpropanoidbiosynthesis，thebiosynthesis of secondarymetabolitesand phenylalaninemetabolism， respectively，whichshould be beneficialtoimprove diseaseresistanceof rice.Therewere3differential proteins （Os01t0327400-01，Os12t0112000-01，Os01t0963000-04）were common among 4 itemsof GO significant enrichmentand3pathways ofKEGG significant enrichment，which couldbethe keyproteins inthebakanaedisease resistance.Above results provided scientific theoretical basis for the research of disease resistance.

KeyWords：rice；bakanae disease；Gibberella fujikuroi species complex；proteome；disease resistance

水稻惡苗病又名徒長病，俗稱公稻子，其病原菌有性態最初被命名為藤倉赤霉菌[Gibberellafujikuroi（Sawada）Wollenw]，無性態命名為串珠鐮孢菌（Fusariummoniliforme），近年來將惡苗病菌有性態更名為藤倉赤霉復合種（Gibberellafujikuroispeciescomplex，GFSC），該病是危害性強的水稻常見真菌性病害，廣泛分布于世界各個稻區，在水稻生育后期發病重的地塊發病率達10%＼～20%，嚴重影響水稻產量[1-2]

化學農藥能有效殺死種子表面的病原菌或抑制其活動，控制種子傳病，降低苗期發病率，最大限度地控制病害的再侵染，降低大田產量損失。不同水稻品種惡苗病發生程度存在較大差異，甚至有不發生惡苗病的品種存在，因此種植抗惡苗病水稻品種是最經濟有效和最根本的防治方法。李鵬3對65個供試品種進行鑒定，發現有18個品種在分蘗期和孕穗期無病，可作為惡苗病的抗病育種抗源材料。Ma等4通過芽期人工接種惡苗病菌和赤霉素處理，獲得了對惡苗病具有一定抗性的3種基因型材料[d-29，sd-6，sd-q（t）]。

從功能基因組學角度挖掘和解析惡苗病抗性相關基因是大通量且快速的途徑，然而關于這方面的報道還很少[5]。Matic等利用RNA-Seq技術，比較了抗、感惡苗病水稻品種Selenio和Dorella在接種惡苗病菌前后的轉錄組水平變化發現，在抗惡苗病品種Selenio 中，PR1（pathogenesis-related protein1）、類萌發素蛋白、糖普水解酶、促分裂原激活蛋白激酶、WRKY轉錄因子等上調表達。Ji等利用RNA-Seq技術分析了抗、感惡苗病品種93-11和日本晴的轉錄組表達差異發現，WRKYs、WAK和MAP3Ks基因在轉錄水平的上調與93-11的惡苗病抗性相關，而且差異表達基因在第1、3、10染色體上分布較多。Ji等8首次報道了水稻惡苗病抗性在蛋白質組學水平上的變化，通過TMT（tandemmasstags）技術鑒定了93-11和日本晴中的214個差異表達蛋白，只有11個差異表達蛋白為2個品種共有，其中水通道蛋白在93-11中極顯著上調，上調倍數達100以上，而在日本晴中未發生變化，推測該蛋白是抗惡苗病的關鍵蛋白。

蛋白質組概念最早由MarcWilkins提出，這一術語的提出很快在生物學界得到廣泛的關注，也常常被用于植物與病原菌互作的蛋白變化研究。常用的定量蛋白質組學策略按照是否需要穩定同位素標記可以分為非標記定量方法（label-freemethod）和標記定量方法（labellingmethod）。標記定量方法是指利用穩定同位素標記樣本后再進行相應的質譜鑒定與定量分析，大致有3種，基于凝膠的蛋白定量方法、基于一級質譜的定量方法和基于二級質譜的定量方法。前人對水稻惡苗病蛋白質組學研究是基于中抗品種8，若能從高抗品種中找到抗惡苗病的關鍵蛋白，對惡苗病防治具有積極的推動作用，因此本研究以高抗惡苗病水稻品種墾稻26為材料，在水稻催芽時接種惡苗病菌，采用TMT定量蛋白質組學技術，比較感染惡前后的差異蛋白質，發掘抗惡苗病的關鍵蛋白，以期為惡苗病抗病研究和防治工作提供科學的基礎理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

以高抗惡苗病水稻品種墾稻26為試驗材料，采用 4% 嘧啶核苷類抗菌素水劑1000倍液（武漢科諾生物科技股份有限公司）浸種。惡苗病菌株為FY3菌株，保存于PDA斜面培養基。

1.2試驗方法

1.2.1菌種活化將PDA培養基斜面上的惡苗病菌株FY3活化到PDA平板培養基上，培養5d后用于接種試驗。

1.2.2試驗設計以不接種處理為對照（CK），設置接種處理（KDI）。每處理稱取水稻種子 100g 150mL4% 嘧啶核苷類抗菌素水劑 1 000 倍液浸種2d后，更換清水浸種， 24h 后再更換1次清水，共浸種4d，然后置于 32^°C 恒溫催芽，催芽 24h 后接種。CK處理接種清水；KDI處理接種惡苗病菌株FY3孢子懸浮液 1.75×10⁵cell?mL^-1 ，接種的孢子懸浮液用量為種子質量的 10%（10g） ，接種后繼續 32^°C 恒溫催芽 24h 后取樣。每處理取3個樣本，每個樣本取水稻芽至少 0.3g 。水稻芽取下后使用錫箔紙包裹并塞入 1.5mL 進口連蓋離心管中做好標記，同一處理的重復樣本放入同一自封袋中，在自封袋中放入標簽紙注明樣本信息，再放入液氮中保存，干冰郵寄至北京諾禾致源科技股份有限公司進行檢測。

1.2.3蛋白質組檢測分析將液氮速凍的水稻芽樣本使用改進的FASP（fitter-aided samplepreparation）提取方法提取總蛋白質，并將檢測合格的蛋白質樣品進行蛋白質組分析。

1.3 數據分析

將下機后的raw文件直接導入到ProteomeDiscoverer2.5軟件進行數據庫檢索（NCBI數據庫：1738381-Oryza_sativa.fasta（42355 sequences），然后基于數據庫搜索的結果進行蛋白質鑒定，同時分析肽段、蛋白和母離子質量容差分布來評定質譜檢測數據的質量；對鑒定到的蛋白質進行功能注釋；對蛋白質的定量分析，對比CK和KDI處理間的差異蛋白質，將 P?0.05 且差異倍數（foldchange，FC） gt;1.20 或 lt;0.83 的差異蛋白質定義為顯著差異蛋白質。對顯著差異蛋白質進行表達模式、聚類分析和GO（geneontology）[o]、KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）[1-2]富集分析等。

2 結果與分析

2.1數據質控、蛋白質鑒定與定量分析

基于質譜檢測得到存放質譜數據完整掃描信息的raw文件，經ProteomeDiscoverer2.5軟件進行數據庫檢索和去除 FDRgt;1% 的肽段和蛋白質后，6個樣本中共鑒定到58349個肽段和8046種蛋白質，其中定量蛋白質8027種。肽段長度為6＼～35，且肽段母離子的實測分子量和理論分子量的質量偏差小，唯一的肽段數量較多；蛋白質分子量范圍較廣、可信度較高。主成分（principalcomponent，PC）分析處理和對照組間樣本分散，組內樣本聚在一起（圖1）;變異系數（coefficientofvariation，CV）曲線上升快，各樣本重復性好（圖2）。

2.2 蛋白質功能注釋

2.2.1G0功能注釋有4586個蛋白質在G0數據庫中有注釋功能，涉及G0條目929個，其中生物過程（biologicalprocess，BP）361個，細胞組分（cellularcomponent，CC）120個，分子功能（molecularfunction，MF）448個。在生物過程中，氧化還原過程注釋到的蛋白質數量最多，為471個；其次是代謝過程和蛋白質磷酸化；氧化應激反應注釋到的蛋白質數量為65個；跨膜運輸注釋到的蛋白質數量為89個。在細胞組分中，膜的整體組成部分注釋到的蛋白質數量最多，為214個；其次是核糖體和膜。在分子功能中，蛋白質結合注釋到的蛋白質數量最多，為564個；其次是ATP綁定和核酸結合以及氧化還原酶活性和蛋白激酶活性等（圖3）。

2.2.2KEGG功能注釋由圖4可知，檢測到的蛋白質主要參與氨基酸代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、聚糖的生物合成和代謝、脂質代謝、輔助因子和維生素的代謝、核苷酸代謝、萜類和多酮類的代謝及其他次生代謝物的生物合成等。

2.3 差異蛋白質分析

將KDI與CK處理進行對比，篩選出顯著上調表達蛋白質124個，顯著下調表達蛋白質75個（圖5）。

2.3.1GO富集分析將顯著差異蛋白質進行GO富集分析，得到123個G0條目，其中顯著富集的

GO條目38個，其中生物過程17個、細胞組分5個、分子功能16個；以校正后的 P 值 （P_Adj） 進行篩選，確定顯著性富集的G0條目15個，其中生物過程、細胞組分、分子功能各5個；主要集中在光合作用、光系統、對應激的反應、氧化應激反應、過氧化物酶活性、氧化還原過程等方面（圖6）。

2.3.2KEGG富集分析將顯著差異蛋白質進行KEGG富集分析，富集到45條通路（圖7），其中顯著性富集通路10條；以 P_Adj?0.05 為標準，富集到4個顯著性富集通路，主要集中在光合作用和苯丙素、黃酮類化合物、角質素、木栓質、蠟質的生物合成及苯丙氨酸、氰基氨基酸、氮代謝等方面。

2.4上調差異蛋白質富集分析

2.4.1G0富集分析將顯著上調表達的124個蛋白質進行G0富集分析，得到88個富集條目，其中顯著性富集的條目21個，包括生物過程10個、分子功能11個，富集的蛋白質主要集中在對應激的反應、對氧化應激的反應、對生物刺激的反應、氧化還原過程、防御反應、脂肪酸生物合成過程、幾丁質分解代謝過程、細胞壁大分子分解代謝過程等生物過程和過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、幾丁質酶活性、鐵離子結合、有機環化合物結合、雜環化合物結合、血紅素結合、幾丁質結合等分子功能（圖8）。以 P_Adj?0.05 為標準，顯著性富集的G0條目有4個（表1），包括對應激的反應、對氧化應激的反應2個生物過程和過氧化物酶活性、血紅素結合2個分子功能。

2.4.2KEGG富集分析由圖9可知，以 P?0.05 為顯著性指標，得到顯著性富集通路7個，分別為苯丙素生物合成、次生代謝物的生物合成、苯丙氨酸代謝、MAPK信號通路-植物等，均與植物防衛反應有關。其中，MAPK信號通路參與細胞信號轉導，具有調節著細胞的生長、分化、對環境的應激適應等功能，有利于提高植株抗病能力。以校正后的 P_Adj?0.05 為顯著性指標，確定顯著性富集通路3個（表2），分別為苯內素生物合成、次生代謝物的生物合成、苯丙氨酸代謝。

2.5抗病關鍵蛋白質

在GO顯著性富集的4個條目和KEGG顯著性富集的3條通路中共有的上調差異蛋白質有3個，分別為Os01t0327400-01、Os12t0112000-01、Os01t0963000-04。其中Os01t0327400-01在CK處理中相對定量為583.4，在KDI處理中相對定量為792.7，為CK的1.36倍；蛋白質Os12t0112000-01在CK處理中相對定量為403.7，在KDI處理中相對定量為561.5，為CK處理的1.39倍；Os01t0963000-04在CK處理中相對定量為264.6，在KDI處理中的相對定量為327.3，為CK處理的1.24倍。Os01t0327400-01是過氧化物酶體蛋白（peroxisomeprotein），過氧化物酶體蛋白占亞細胞定位差異蛋白質總量的 5.71% ;Os12t0112000-01和Os01t0963000-04是細胞質蛋白（cytoplasmprotein），細胞質蛋白占亞細胞定位差異蛋白質總量的 20.95% （圖10）。由此推斷，Os01t0327400-01、Os12t0112000-01、Os01t0963000-04參與細胞的氧化應激反應和代謝物生物合成等生命活動，是抗惡苗病的關鍵蛋白。

3討論

病原菌侵害植物機體的過程中，植物受到外界刺激后，運用自身的信號轉導途徑，刺激產生特異性的蛋白質表達，參與植株防御反應。本研究對水稻惡苗病菌脅迫后抗病水稻品種的總蛋白質進行TMT分析，比較感染惡苗病菌前后的差異表達蛋白質，以 P?0.05 且 FCgt;1.20 時，篩選出顯著上調表達蛋白質124個；當 P?0.05 且 FClt;0.83 時，篩選出顯著下調表達蛋白質75個。對124個顯著上調表達蛋白質進行GO富集分析，得到顯著富集的GO條目4個，主要集中在對應激的反應、對氧化應激的反應2個生物過程和過氧化物酶活性、血紅素結合2個分子功能，有利于清除水稻芽組織內過氧化物，對細胞起保護作用；KEGG富集分析得到顯著性富集通路3條，主要包括苯丙素和次生代謝產物的生物合成及苯丙氨酸代謝，從而提高水稻抗病性。

蛋白質組學也常常被用于植物與病原菌互作的蛋白變化研究，水稻被病原菌侵染后，與未侵染健康植株比較，3-磷酸甘油醛脫氫酶顯著增加；抗氧化物酶中的抗壞血酸過氧化物酶、真菌細胞壁降解酶（包括幾丁質酶和 β -葡聚糖酶）及其他病程相關蛋白在抵御病菌過程中大量積聚[13-18]。Ji等推測水通道蛋白是抗惡苗病的關鍵蛋白，本研究推測過氧化物酶體蛋白和細胞質蛋白是抗惡苗病的關鍵蛋白。

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