二倍體長穗偃麥草HSP70基因家族鑒定及表達模式分析

中圖分類號：S512.6 文獻標志碼：A 文章編號：1008-0864（2025）06-0028-11

Genome-wide Identification and Tissue Expression Pattern Analysis of HSP7O Gene Family in Thinopyrum elongatum

SUN Jilin， ZHANG Jiaqi，MENG Fansen， SUN Silong* （NationalKeyLaboratoryofWheat Improvement，Collegeof Agronomy，Shandong Agricultural University， Shandong Tai'an271018，China）

Abstract：Heat shock protein7O（HSP7O）constitutes a highly conserved and potent protein family.However，the investigationof HSP7OinThinopyrumelongatum has notbeendocumented.To identifyand studyHSP70 gene family inThinopyrum elongatum，TeHSP7O genes wereidentified based on the systematicapplicationof bioinformatics methodsand their expression patterns under salt stress and indifferent tissues were systematicallyanalyzed.The results showed thata total of 29 TeHSP7O genes were identified in Thinopyrum elongatum，whichwascategorized into3subfamiliesand evenlydistributed across7chromosomes.There were 26 TeHSP7O genes localized in cytoplasm，and all29 TeHSP7O genes included alpha-helix，extended strand，beta-turn and random coil. The TeHSP7Os genes exhibited highlyconserved motifs and diverse gene structures，and included multiple hormonal and stres-responsive cis-acting elements inupstream.Thecollinearityanalysisrevealed the presence of3colineargene pairs，as wellas tandem repeat and segment repeat events，within 29 TeHSP7O genes，and there were numerous homologous gene pairs among Thinopyrum elongatum，riceand wheat，whereas there was a scarcityof such pairs between ThinopyrumelongatumandArabidopsis.Protein interactionnetworkanalysisrevealed thattherewere11TeHSP7O genes withacomplexandcloselyprotein interactionnetwork.Analysisofexpressionpatters showedthat，with increasing ofsalt stress（0＼～30O mmol·L-1），7 TeHSP7O genes exhibited continuous up-regulation and 6 TeHSP7O genes showed continuous down-regulation，while theremaining16memberseither did not showanyexpressionor displayed inconsistent changes.Similarly，25 TeHSP7O genes were expressed across all tisses，and 4 TeHSP70 genes were only expressed in some tissues.Above resultsprovided efective references for further analysis of HSP7O genes function of Thinopyrum elongatum.

KeyWords：Thinopyrum elongatum；HSP7O；salt stress；expression pattern

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一類具備結構特異性和功能多樣性的分子伴侶蛋白，在參與植物生長發育和響應生物及非生物脅迫方面具有重要作用[1-2]。HSPs類型多樣，依據相對分子質量可將HSPs超級家族劃分為5個亞族，分別是HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和smallHSPs[3]。在這些亞族當中，HSP70是研究最廣泛的HSP類型之一，其結構由N端ATP酶結構域（N-terminalATPasedomain，NBD）、底物結合結構域（substratebindingdomain，SBD）和可變的C端區域組成，廣泛存在于真核生物和原核生物當中4。HSP70積極參與植物的生長與發育，在植物各個組織和細胞器中廣泛存在；根據HSP70在亞細胞中的位置可分為4大類，分別是存在于細胞核/細胞質（EEVDmotif）、內質網（HDELmotif）、質體（PEGDVIDADFTDSKmotif）和線粒體（PEAEYEEAKKmotif）。HSP70作為分子伴侶在植物體中扮演著重要的角色，如參與蛋白質的損傷修復、折疊加工以及受損蛋白的移除等[8-10]。

HSP70在遭遇高溫、鹽和干旱等脅迫時會快速表達產生一種有效的緩沖體系去適應各種脅迫，其優異的抗脅迫性能已經在多物種中被全面鑒定[1l-12]。蘿卜（Raphanus sativus）RsHSP70對蘿卜生長發育和脅迫響應具有關鍵作用3；在小麥（Triticumaestiuum）及其近緣物種中發現，HSP70具有多樣的功能，不但響應鹽、低溫等逆境脅迫，同時參與生長素和赤霉素等外源激素的響應[4]隨著全球氣候變暖和人類不合理灌溉導致土壤次生鹽漬化不斷加劇，合理改良鹽堿地成為目前迫切需要解決的問題，而二倍體長穗偃麥草（Thinopyrum elongatum， 2n=2x=14 ）對鹽脅迫具備良好的抗性，但其抗鹽的分子機理尚未被完全解析和闡釋[15-16]。

二倍體長穗偃麥草屬于小麥族偃麥草屬，因其可以與小麥進行雜交，且蘊含豐富的優異性狀基因，被廣泛用于小麥遺傳改良。近年來，二倍體長穗偃麥草全基因組測序的完成為其在分子和基因功能層面的研究提供了很大的便利[18]。目前，HSP70基因家族已在擬南芥（Arabidopsisthaliana）水稻（Oryza sativa）玉米（Zeamays）小麥和大豆（Glycinemax）等多種植物中被鑒定，而在二倍體長穗偃麥草中尚未被充分研究[9]。因此，本研究基于生物信息學方法對二倍體長穗偃麥草HSP70基因進行了全面鑒定，同時分析其特征和表達模式，為二倍體長穗偃麥草HSP70基因的功能和分子機制研究奠定良好基礎。

1材料與方法

1.1二倍體長穗偃麥草HSP70基因的鑒定

通過TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）[20]和Genome Warehouse（https：//ngdc.cncb.ac.cn/gwh/Assembly/965/show）數據庫分別下載擬南芥和長穗偃麥草的基因組與注釋文件。使用BLASTP（v2.13.0）軟件以長穗偃麥草注釋基因的氨基酸序列作為庫文件，以擬南芥HSP70基因序列作為比對文件進行比對，設置E值 lt;1×10^-20 ;從Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）[2i]下載HSP70（PF00012）的隱馬爾可夫模型，使用HMMER3.3.2軟件[22]，設置E值 lt;1×10^-20 。合并2種方法獲得的候選蛋白序列，然后分別提交至SMART（https：//smart.embl.deI ）[23]和InterPro （https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）[24]數據庫，剔除含不完整HSP70結構域和相對分子質量小于 60kD 的序列，最后根據二倍體長穗偃麥草的拉丁文名稱以及各基因在染色體上的位置順序依次進行命名，得到TeHSP70基因[13]。

1.2理化性質分析、亞細胞定位和二級結構預測

使用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）數據庫2預測TeHSP70蛋白的氨基酸長度、分子量、理論等電點、不穩定系數、脂肪系數、總平均親水性等理化性質。利用CELLO（http：//cello.life.nctuedu.tw/）在線工具預測TeHSP70蛋白的亞細胞定位。利用 SOPMA[27]（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page ：=I NPSA/npsa_sopma.html）在線工具預測TeHSP70蛋白的二級結構。

1.3保守基序、順式作用元件和基因結構分析

通過MEME（v5.5.3）軟件（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）在線網站[28]分析TeHSP70蛋白的保守基序，motif數設置為10，其他參數采用默認值；提取TeHSP70基因上游 2000bp 序列，利用在線網站PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）[29]分析順式作用元件；使用TBtools軟件（v1.120）[30分析TeHSP70基因的結構；最后使用TBtools對以上分析結果進行可視化展示。

1.4基因在染色體上的定位和共線性分析

使用TBtools對TeHSP7O基因在染色體上的定位進行可視化。為驗證TeHSP70與其他植物間的共線性，從RGAP（http：//rice.plantbiology.msu.edu）網站3和IWGSC（https：//wheat-urgi.versailles.inra.fr/Seq-Repository/Assemblies）網站[32分別下載水稻和小麥基因注釋序列，然后使用TBtools的MCScanX模塊對TeHSP70進行共線性分析。

1.5進化分析和蛋白質互作網絡分析

使用軟件MAFFT（v7.520）[33]對鑒定的TeHSP70蛋白序列與已公布的擬南芥和水稻的HSP70蛋白序列進行比對，結果使用軟件IQ-TREE（v2.2.2.7）[34采用最大似然法構建系統發育進化樹，bootstrap設置為1000，并使用在線網站iTOL（https：//itol.embl.de/）[35]對進化樹進行美化。利用STRING（https：//cn.string-db.org/）數據庫[預測分析TeHSP70蛋白的互作網絡，選用擬南芥作為比對模板，使用Cytoscape軟件（v3.10.2）[37]美化。

1.6二倍體長穗偃麥草轉錄組測序及分析

為分析TeHSP70在鹽脅迫中的表達模式，將長穗偃麥草種植在溫度為 、光周期為 16h/8h （光/暗）的生長室中，并進行 0，100，200 和300mmol^-1 NaCl處理。處理1周后，收集長穗偃麥草的葉片，每處理3次生物學重復，共12個樣本，保存在 -80^°C 液氮中。使用RNAprepPurePlantKit提取樣品總RNA，并用NanoDrop1000分光光度計進行RNA定量后，進行Illumina轉錄組測序。

為分析TeHSP70的表達模式，分別采集長穗偃麥草的幼苗、根部、節間、旗葉，3次生物學重復，使用TRIzol@試劑（Invitrogen）提取總RNA進行轉錄組測序。另外，從NCBISRA數據庫下載二倍體長穗偃麥草幼穗、掛花穗、花前穗、子房膨大期、半籽粒和籽粒的轉錄組數據（登錄號為PRJNA540081）。在得到以上測序數據后，使用軟件fastqc（v0.12.1）對所有樣品進行檢查，參數默認。然后，使用軟件HISAT2（v2.2.1）[38將上述RNA-Seq數據比對到二倍體長穗偃麥草參考基因組。使用HTseq-count（v2.0.2）[39計算每個樣本基因表達的count值。通過自定義的R腳本結合每個基因的長度計算TeHSP7Os的TPM（transcriptper million）值，以 log₂（TPM+1） 表示， log₂（TPM+1） gt;0 即為表達，并使用TBtools的HeatMap模塊繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1TeHSP70的鑒定與理化性質分析

在二倍體長穗偃麥草中共鑒定到29個TeHSP70基因，結合拉丁文名和在染色體上的順序位置，將其命名為TeHSP70-01＼～TeHSP70-29（表1）。TeHSP70蛋白質長度為544＼～887aa;分子量為 60.80～97.70kD ；理論等電點為5.01＼～8.84，其中有26個為酸性蛋白，有3個為堿性蛋白；不穩定系數為23.51＼～50.39，其中大于40的有7個，說明大多TeHSP70蛋白是穩定蛋白；脂肪系數為75.13＼～99.83；總平均親水性均為負值，說明TeHSP70蛋白有較強的親水性。

亞細胞定位分析（表2）顯示：除TeHSP70-01位于周質、TeHSP70-08和TeHSP70-15定位在外膜，其他26個成員皆定位在細胞質內，說明TeHSP70蛋白主要在細胞質中參與代謝。二級結構分析（表2）顯示， ∝ -螺旋占比為 31.18% 48.91% ，延伸鏈占比為 13.19%～23.16%， β-折疊占比為 2.59%8.40% ，無規則卷曲占比為 27.47% 41.32% 。在29個TeHSP70蛋白中除TeHSP70-24的二級結構中無規則卷曲占比最高外，其他均為∝ -螺旋占比最高，無規則卷曲次之，延伸鏈第3，β -折疊占比最低，表明TeHSP70蛋白的結構具有一定的相似性。

2.2保守基序、順式作用元件和基因結構分析

在TeHSP70蛋白中共鑒定出10個保守基序（圖1A），這些基序以motif10、motif8、motif9、motif 1， motif7、motif3、motif2、motif6、motif5、motif4的順序排列。29個TeHSP70蛋白中均包含motif 1， motif2 和 motif 6；TeHSP70-27、TeHSP70-28、TeHSP70-29不 包含motif 10;TeHSP70-01、TeHSP70-04、TeHSP70-08和TeHSP70-11不包含motif8;TeHSP70-20不包含motif9;TeHSP70-01、TeHSP70-04和TeHSP70-20不包含motif7;TeHSP70-01和TeHSP70-24不包含motif3；TeHSP70-01、TeHSP70-02、TeHSP70-03和TeHSP70-04不含motif4和motif5。由此推斷，TeHSP70蛋白中某個基序的丟失與序列的進化存在密切關系，進化關系近的成員間保守基序的數量和順序具有高度的保守性。

在TeHSP70基因啟動子上游區，共鑒定出11種參與激素和脅迫響應的順式作用元件（圖1B），分別為生長素響應元件（TGA-element）、赤霉素（TATC-box）、水楊酸響應元件（TCA-element）、ABRE（脫落酸）AuxRR-core（生長素）CGTCA-motif（茉莉酸甲酯）和TGACG-motif（茉莉酸甲酯）；參與脅迫應答的分別是干旱（MBS）、TC-richrepeats（防御和脅迫響應）、LTR（低溫）和厭氧誘導（ARE）。其中響應茉莉酸甲酯的順式作用元件數量最多，響應赤霉素的順式作用元件數量最少。29個TeHSP70基因的外顯子數量為1＼～13，其中TeHSP70-23基因的外顯子數量最多，而TeHSP70-24和TeHSP70-26的外顯子數量最少，結構相似的TeHSP70基因外顯子數量大致相同（圖1C）。

2.3基因在染色體上的定位與共線性分析

由圖2可知，29個TeHSP70較均勻地分布在二倍體長穗偃麥草的7條染色體上，其中4號染色體上最多，共鑒定出7個；3號染色體上最少，只有2個；1號染色體有5個，2號染色體有3個；5＼～7號染色體上各有4個（圖2）。

二倍體長穗偃麥草種內共線性分析（圖3）顯示，有3組基因涉及串聯重復和片段重復，分別是TeHSP70-05和TeHSP70-10、TeHSP70-15和

TeHSP70-16、TeHSP70-16和TeHSP70-17，說明在長穗偃麥草進化過程中復制事件對TeHSP70的擴增起重要作用。物種間共線性分析（圖4）發現，

29個TeHSP70基因分別與擬南芥、水稻和小麥的3、15、37個基因存在共線性，說明單子葉植物間有更好的共線性關系。在二倍體長穗偃麥草與小麥間有共線性的14個TeHSP70基因中，有11個與小麥A、B和D染色體組同時存在共線性關系，且在染色體上的位置相近。

2.4TeHSP70基因的系統進化分析

對18個擬南芥和32個水稻的HSP70基因與TeHSP70構建系統發育進化樹，結果（圖5）表明，這些基因分成了I、Ⅱ、Ⅲ共3個亞族，其中Ⅲ亞族的成員最多（33個），Ⅱ亞族成員最少（16個）；擬南芥HSP70基因主要集中在I亞族；而水稻HSP70基因在3個亞族中均有分布；TeHSP70基因與水稻HSP70基因成員相間分布，說明二者間親緣關系較近。

2.5TeHSP70蛋白質互作網絡分析

由圖6可知，29個TeHSP70蛋白中有11個成員間存在明顯的相互作用，分別是TeHSP70-01、TeHSP70-03、TeHSP70-04、TeHSP70-08、TeHSP70-11、TeHSP70-12、TeHSP70-15、 TeHSP70-18、TeHSP70-20、TeHSP70-24和TeHSP70-29；不同蛋白間相互作用強弱存在明顯差異，這11個成員相互之間都存在至少2對相互作用，其中，TeHSP70-01與其他10個成員間都存在相互作用，TeHSP70-18和TeHSP70-20只存在2對相互作用。

2.6TeHSP70在鹽脅迫中的表達模式分析

為研究TeHSP70對鹽脅迫的響應模式，對0、100、200和 NaCl處理下的二倍體長穗偃麥草進行轉錄組測序，分析（圖7）發現，29個TeHSP70基因中有26個響應鹽脅迫，僅TeHSP70-04、TeHSP70-26和TeHSP70-28未表達。其中，TeHSP70-01、TeHSP70-05、TeHSP70-09、TeHSP70-16、TeHSP70-17、TeHSP70-20和TeHSP70-22的表達量隨著鹽脅迫程度的增加持續上升；而

Fig.4Colinearityanalysisof TeHSP7Os withgenesfromArabidopsis thaliana，OryzasativaLand TriticumaestivumL.

注：紅、綠、藍色字分別代表二倍體長穗偃麥草、水稻、擬南芥。

Note：Red，greenandbluelettersindicateThnopyrumelongatum，OryzasativaLandArabidopsisthaliana，rspctiv

TeHSP70-03、TeHSP70-10、TeHSP70-12、TeHSP70-18、TeHSP70-19和TeHSP70-29隨著鹽脅迫程度的增加表達量持續下降。由此說明，隨著鹽脅迫的變化，TeHSP70基因通過表達量的變化來響應鹽脅迫，以此來保證植物的生命機能的正常運行。

2.7TeHSP70基因的組織表達模式分析

TeHSP70基因在二倍體長穗偃麥草各器官和各發育階段的整體表達水平均較高（圖8），29個TeHSP70基因在幼苗、根部、節間、旗葉、幼穗、花前穗、掛花穗、子房膨大期、半籽粒、籽粒中均表達，其中有25個TeHSP70基因在各器官中均表達，有4個TeHSP70基因僅在部分器官中表達。TeHSP70-28在根、半籽粒和籽粒中不表達；TeHSP70-04、TeHSP70-15和TeHSP70-26在幼苗、根、節間和旗葉中不表達；此外，TeHSP70-04在幼穗中不表達，TeHSP70-15在半籽粒和籽粒中不表達。并且不同基因在不同器官中的表達量存在差異。

3討論

HSP70是一類廣泛參與植物生長發育和脅迫應答的基因家族[40]。目前HSP70基因的功能已在許多物種中被鑒定和揭示，但其在二倍體長穗偃麥草中尚未被全面鑒定和研究，二倍體長穗偃麥草全基因組測序為其奠定了基礎。本研究在二倍體長穗偃麥草中共鑒定出29個TeHSP70基因，其蛋白的相對分子量均大于 60kD ，符合HSP70基因家族的特性。研究表明，在二倍體長穗偃麥草的近緣物種烏拉爾圖小麥（Triticumurartu）中共鑒定到30個HSP70基因，在擬斯卑爾脫山羊草（Aegilopsspeltoides）中鑒定到41個HSP70基因，在粗山羊草（Aegilopstauschii）中鑒定到28個HSP70基因[4。29個TeHSP70基因均勻地分布在二倍體長穗偃麥草染色體上，其中，5、6、7號染色體都各包含4個TeHSP70基因。通過物種內共線性分析發現，串聯重復和片段重復在TeHSP70成員的擴張過程中起重要作用4；物種間共線性分析發現，TeHSP70與水稻的同源基因數明顯具有較高共線性，表明單子葉植物間的進化關系更近；此外，本研究將29個TeHSP70基因分為3個亞族，根據3個亞族的特征及分布同樣發現，二倍體長穗偃麥草與水稻的關系更近；與小麥間的共線性分析發現，有11個TeHSP70基因與小麥A、B、D基因組同時存在共線性關系，表明了二倍體長穗偃麥草與小麥間有非常近的親緣關系。理化性質分析顯示，29個TeHSP70蛋白中有26個為酸性蛋白；亞細胞定位分析顯示，有26個TeHSP70蛋白定位于細胞質，說明其主要在細胞質中發揮作用，其保守基序motif1＼～motif10高度保守，但不同基因的外顯子數存在較大差異，說明不同TeHSP70基因在進化過程中雖然基因結構發生了復雜的變化，但其編碼的蛋白依然高度保守[42]。順式作用元件分析發現，在TeHSP70基因的上游存在多種與激素和脅迫響應相關的順式作用元件。通過蛋白質互作網絡分析發現，11個TeHSP70蛋白間有著非常強的相互作用，其中TeHSP70-01與其他10個成員間均存在互作，表明該基因家族成員間組成了復雜的蛋白與蛋白間的互作網絡[43]

鹽脅迫是影響作物生長和產量的重要因素[44]。研究表明，長穗偃麥草E組染色體在鹽脅迫中有著優良的抗性[16.45]。本研究分析了TeHSP70基因在0、100、200和 300mmol?L^-1 NaCl脅迫下的表達模式，發現有3個TeHSP70基因不表達，而其他基因均持續上調和持續下調表達，說明TeHSP70基因積極響應鹽脅迫。此外，分析TeHSP70基因在不同器官中表達發現，該基因積極參與二倍體長穗偃麥草的生長發育。本研究通過對TeHSP70的全基因組鑒定和系統分析豐富了HSP70基因功能的多樣性和存在的廣泛性，為進一步解析其分子機理奠定了堅實的基礎。同時，二倍體長穗偃麥草作為小麥遺傳改良的重要資源，通過鑒定和發現其優良的抗鹽基因可為小麥遠緣雜交提供有效的參考。

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