膝骨關節炎患者痛敏腧穴組胺、P物質、五羥色胺的特征研究

關鍵詞]膝骨關節炎；穴位敏化；壓痛閾值；組胺；五羥色胺；P物質；炎癥細脆 [中圖分類號]R245 [文獻標志碼]B [文章編號]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.06.009

Characteristics of histamine， substance P， and 5-hydroxytryptamine in pain-sensitive acupoints of patients with knee osteoarthritis

XIE Junxid'，FAN Wenqiang'，CAO Yujiel， YIN Tingting'， LYU Peiran'， ZHANG Ning'，LIU Li2， LIU Q ;I，Z; 1.Scholof Acupuncture-moxibustionandTuinaShanxiUniversityofChineseMedicine，Xianyang，Shaanxi72046，China; 2.Shanxi Colaborative Innovation CenterforResearchandDevelopmentof TCMDiagnosis，Treatment Technologyand Equipment， Xianyang， Shaanxi 46， China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatethecharacteristicpattersoflocalhistamine（HA），substanceP（S），and5-droxytyptamine（5-Hinpain-sensitiveacupointsofpatientswithkneeosteoarthritis KOA）.MethodsThirtyKOApatientsadmitedto theAfilitedHospitalofShanxiUniversityofChineseMedicinefromAugust2O23toMarch2O24wererecruitedThirteen acupointsaroundthekneejointwereselected，andeachacupointwassubjectedtotwoonsecutivepressrepainthreshold（P） measurements，withthemeanvaluetaken.Theacupoint withthelowestPPTwasidentifiedasthepain-sensitiveacupointEight KOA patients wererandomlyselectedtocomparetheskinhistological diferencesandvariationsinthecontentofvarioussubstances betweenthepain-sensitiveacupoints （pain-sensitivegroup）ontheafectedkne andthecorrespondingacupoints （acupointgroup） onthecontralateralside.Aftersampling，HEstainingwasusedtoobservelocalskin histomorphologyoftheacupointsinthetwo groups.Toluidinebluestainingwasemployedtoquantifymastcels（MCs），andimmunofluorescencewasutilizedtodeterminethe expresionlevelsofHA，SP，and5-HT.ResultsAmongthe13acupointsaroundtheknee，thepressrepainthresholsofLiangqiu （ST34），Yinggu（KI10），Heding（EX-LE2），ndWeiang（BL39）cupintsiepainsensitiegoupweresigniicantllowra those in the acupoint group （ P lt;0.05）.Inflammatory cell infiltration was observedin the local skin tissue of both groups，witha highernumberofeosinophilsandbasophilsinthepain-sensitivegroupcomparedwiththeacupoint group.Toluidine bluestaining revealedalargenumberof blueparticlesdistributedaroundtheMCsinthepainsensitivegroup，indicating markedactivation. Comparedwiththeacupointgroup，theMCcountinthelocalskintissueofthepain-sensitivegroupsignificantlyincreased（ Plt; （204號 0.001），and the mean fluorescence intensities of HA， 5-HT，and SP all increased （ Plt;0.05 Plt;0.01 ）. Conclusion Elevated contents of HA，SP，and5-HTinthelocalskintisseatpainsensitiveacupoints，alongwiththedegraulationofMCsandinfiltratioofothr inflammatory substances，may collectively contribute to the chemical basis for acupoint sensitization.

[Keywords]kneeosteoarthritis；acupuncturesensitization；pressurepainthreshold;histamine;5-hydroxytryptamine;substance P； inflammatory cells

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種慢性退行性疾病，主要表現為膝關節腫脹、疼痛、活動不利，多好發于中老年人群，發病率隨著老齡化呈逐年上升趨勢，嚴重影響患者的日常生活。穴位敏化是人體在各種病理狀態下腧穴呈現出一些形式或功能改變，并對外界不同形式刺激的敏感性增加，穴位由“靜息態\"轉變為“激活態\"的過程。其敏化形式涉及痛敏、熱敏、電敏、壓敏、化學敏、聲敏、光敏等，其中痛敏最為常見3。臨床也發現針刺痛敏腧穴治療效果更好4。探索腧穴敏化規律及物質特征，有助于進一步闡釋穴位敏化的可能機制，完善腧穴理論內涵。組胺（histamine，HA）P物質（substanceP，SP）、五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）等物質與穴位敏化的相關性在許多研究中被證實，敏化區皮膚會出現SP、5-HT等物質含量增加[2-5]、肥大細胞（mastcell，MC）聚集和脫顆粒等現象[]。KOA是針灸優勢病種和穴位敏化研究的良好載體，由于受試者招募的難度大，關于KOA患者痛敏穴位局部HA、SP、5-HT含量的研究并不多見，為了給人體穴位敏化局部微量物質相關研究提供更為有價值和直接的證據，本團隊通過嚴格的倫理和臨床研究程序，招募30例KOA患者進行痛敏化規律檢測后，獲得8名受試者同意并成功對膝關節敏化穴位局部皮膚進行采樣，檢測MC狀態和 HA，SP，S-HT 的含量，明確了KOA痛敏穴位局部有關物質的含量和規律特征，以探索穴位敏化的規律和可能機制。

1資料與方法

1.1 病例來源及分組方法

2023年8月至2024年3月在陜西中醫藥大學附屬醫院招募KOA患者30例，患者均符合《中國骨關節炎診療指南（2021年版）》中的K0A診斷標準。隨機選擇8例單側膝關節受累的KOA患者，為盡可能排除個體差異因素，以患者患側膝關節局部組織為痛敏組，健側膝關節局部組織為腧穴組。本研究方案經陜西中醫藥大學附屬醫院醫學倫理審查委員會審查同意（倫理審批號：SZFYEC-PJ-2023年第[66]號）。

1.2 病例選擇標準

1.2.1 納入標準

（1）符合《膝骨關節炎中西醫結合診療指南（2023年版）》中的KOA診斷標準；（2）年齡40＼～80歲；（3）患者本人或家屬簽署本研究的知情同意書；（4）理解本研究內容和方法，接受相關操作且配合度高。1.2.2排除標準 （1）合并扭挫傷等外傷者;（2）患有嚴重的其他骨關節疾病者，如膝骨關節腫瘤、類風濕性關節炎等;（3）合并有嚴重糖尿病、心血管病、肝腎功能損傷等患者；（4）近1周進行其他治療（口服、外用藥物等）者；（5）正在參與其他臨床試驗者。1.2.3中止與剔除標準 （1）不符合納入標準而被誤納入的患者；（2）撤銷知情同意書并主動退出試驗的患者；（3）于檢測或取樣期間出現嚴重不良反應或并發癥，需要停止試驗者；（4）研究期間使用激素等藥物可能會影響結果者。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1主要試劑蘇木素染液、伊紅染液、甲苯胺藍染液（批號：YK0944、YK2220、YK2226，陜西依科生物技術服務有限公司）；二甲苯（批號：10023418，國藥集團化學試劑有限公司）；中性樹膠（批號：BL704A，蘭杰柯科技有限公司）；兔源HRH1多克隆抗體、兔源5-HT多克隆抗體、兔源SP多克隆抗體（批號：

BC09096215、BC12051593、BB05273732，陜西義博賽思生物科技有限公司）；山羊抗兔 IgG （批號：EK022，西安壯志生物科技有限公司）；抗熒光淬滅封片劑（批號：18L05A36，武漢博士德生物工程有限公司）;DAPI（批號：HY-D0814，美國MCE生物科技公司）；檸檬酸抗原修復液（批號：C1032，北京索萊寶科技有限公司）；PBS緩沖液（批號：20210722，陜西依科生物技術服務有限公司）;BSA（批號：EZ2811C238，廣州賽國生物科技有限責任公司）。

1.3.2主要儀器脫水機、包埋機（型號：JJ-12J、JB-P5，武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（型號：RM2016，上海徠儀器有限公司）；正置顯微鏡（型號：ci-s，日本尼康株式會社公司）;WANGER壓痛儀（型號：WAGNERPAINTESRFPX，德國WANGER公司）；皮膚取樣器（型號：Rapid-Core，上海威爾泰工業自動化股份有限公司）。

1.4 研究方法

1.4.1痛敏腧穴檢測和穴位皮膚組織取樣痛敏腧穴檢測：依次對膝關節周圍的13個腧穴（足三里、委中、委陽、鶴頂、內膝眼、曲泉、犢鼻、血海、陽陵泉、梁丘、陰陵泉、膝關、陰谷）進行檢測，采用手持WANGER壓痛儀在所選腧穴上逐漸進行加力按壓，詢問患者感覺，當產生疼痛或酸脹感時，記錄該穴位壓痛閾值，間隔 5min 后測量第2次，取兩次測量的平均值作為該穴位壓痛閾，按壓痛閾值大小對13個穴位進行排序。

穴位皮膚組織取樣：取患者患側膝關節壓痛閾值最低的穴位，常規消毒后，用皮膚取樣器對準穴位，適當按壓刺入皮下約 1mm 后，輕微旋轉取皮器，取出皮膚組織約 （1mm×1mm×1mm） 。選取患者另一側（健側）相同穴位，按照同樣方法進行取樣。取得的皮膚組織均迅速置于 4% 多聚甲醛溶液進行固定，隨后按照常規步驟進行石蠟包埋、切片等實驗操作。

1.4.2HE 染色和甲苯胺藍染色HE 染色：將石蠟切片脫蠟后水化，蘇木素染色 ，切片依次進行梯度乙醇脫水，入伊紅染液中染色 1～3min ，最后梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察組織形態及炎癥細胞表達。

甲苯胺藍染色：常規脫蠟后，甲苯胺藍染色15min ，蒸餾水漂洗2次（ 5min 次）， 95% 乙醇分化，鏡下觀察著色情況，無水乙醇迅速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡觀察并采集圖像，每個樣本采集1個200倍視野圖片，利用ImageJ軟件對MC進行計數。

1.4.3免疫組化檢測取出制備好的兩組皮膚組織的石蠟切片，在檸檬酸抗原修復液（ ΔpH=6.0 的高壓鍋中進行抗原修復，冷卻后PBS（ pH=7.4 沖洗3次，5min/ 次。 0.3% 甲醇過氧化氫滅活 15min ，再次PBS（ pH=7.4 沖洗3次， 6min/ 次。組化筆畫圈，圈內滴加 5%BSA ，室溫封閉 1h 去除封閉液，于相應樣本上滴加一定比例配制好的一抗（HA1：200、5-HT1：200、SP1：200），于濕盒內 4‰ 孵育過夜。PBS（ pH= 7.4）沖洗3次， 8min/ 次，甩干貼片，滴加二抗覆蓋組織，室溫孵育 120min ，再次PBS（ pH=7.4 沖洗3次， 8min/ 次。同樣方法洗滌甩干玻片，滴加DAPI染液，孵育 10min，PBS（pH=7.4） 沖洗3次， 6min 次。抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，利用ImageJ軟件分析 HA?5-HT?SP 陽性表達的平均熒光強度值。

1.5 統計學方法

采用SPSS27.0統計軟件對數據進行分析處理。計量資料以‘ ”表示，數據均先進行正態分布及方差齊性檢驗：符合正態分布時，采用配對樣本 χ_t 檢驗；不符合正態分布時，采用非參數檢驗。檢驗水平 α=0.05 ，均以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1 兩組腧穴痛閥值比較

對兩組腧穴壓痛閾值進行比較發現，膝周13個穴位中，痛敏組梁丘、陰谷、鶴頂、委陽4個腧穴的壓痛閥值低于腧穴組 （Plt;0.05） ，其余腧穴壓痛閾值組間比較差異均無統計學意義 （Pgt;0.05） 。詳見表1。

2.2兩組腧穴局部皮膚組織病理學結果

HE染色可見兩組腧穴局部皮膚組織結構均完整，皮膚層清晰，可見表皮、真皮和皮下組織，表皮分為角質層、透明層、顆粒層、棘層、基底層。兩組腧穴局部皮膚組織均有炎癥細胞浸潤，與腧穴組比較，痛敏組的嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等炎癥細胞增多。詳見圖1。

表1兩組腧穴壓痛閾值比較 表2兩組腧穴局部皮膚組織MC數量比較

2.3 兩組腧穴局部皮膚組織MC數量比較

甲苯胺藍染色結果顯示，痛敏組MC外周分布大量藍色顆粒，呈明顯激活狀態。與腧穴組相比，痛敏組的MC數量顯著增加 _（Plt;0.001 ）。詳見圖2、表2。

2.4 兩組腧穴局部皮膚組織HA、5-HT、SP表達比較

免疫熒光檢測結果顯示，痛敏組HA、5-HT、SP在角質層高表達，在毛囊、血管周圍聚集。與腧穴組相比，痛敏組 HA，5-HT，SP 平均熒光強度均增高（Plt;0.05，Plt;0.01） 。詳見表3、圖3。

3討論

穴位敏化是指腧穴在機體病理或功能異常狀態下，由“沉寂態\"向“激活態\"轉化的動態過程，表現為穴位對刺激的敏感性增強或功能特異性改變。這一過程具有動態性、多樣性、普遍性和特異性，實時反映腧穴的功能狀態8-。穴位痛敏又是穴位敏化的重要內容，穴位痛敏的物質基礎可能涉及局部組織結構的改變（如肥大細胞聚集、神經末梢分布變化）以及生物活性分子（如組胺、細胞因子）等的釋放[10-]。《靈樞·外揣》曰：“有諸形于內，必形于外。\"敏化穴位不僅是疾病在體表的反應點，也是體表針刺的治療點，在敏化穴位進行針刺治療具有更好的療效，這是因為“內\"\"外\"受同一脊神經后根傳入纖維支配，共同終止于灰質后角的相同區域，所以當內臟發生病變時，內臟沖動興奮大量進入灰質后角，經軸突反射或背根反射逆向傳導至皮膚，在體表出現穴位敏化的表征8。此外，敏化穴位皮膚的神經末梢可釋放多種生物活性物質，例如降鈣素基因相關肽以及MC激活后釋放的HA、SP、5-HT等炎癥介質，使穴位局部形成一種“炎性湯\"狀態，雖然有研究發現這些物質與痛敏化有聯系，但這些物質與痛敏化的機制并不完全清楚。

Fig.3Comparison of HA，5-HT，and SP expression levels in local skin tissues at the acupoints between the two groups

KOA是針灸的優勢病種，也是穴位敏化臨床研究的良好疾病載體。本試驗測量臨床30名KOA患者13個標準穴位的壓痛閾值，取兩次測量均值作為最終閾值，閾值最低者定為痛敏穴位。納入8例單側KOA患者，通過比較患側痛敏穴位（痛敏組）與健側同名穴位（腧穴組）的組織學特征及生物標志物差異，結果發現與腧穴組相比，痛敏組嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞等炎癥細胞較多，MC數量增多，且HA、SP、5-HT的平均熒光強度均增高。因此，檢測KOA患者敏化穴位局部MC、HA、SP、5-HT等，對研究穴位痛敏的物質基礎特征規律具有重要意義。

本研究發現，痛閾值最低的腧穴多位于膝關節內外側，為梁丘、陰谷、鶴頂、委陽等腧穴，多位于足陽明胃經、足少陰腎經、足太陽膀胱經、足厥陰肝經等經絡上。脾胃屬于后天之本。《素問·太陰陽明論篇》言：“四肢皆稟氣于胃，而不得至經，必因于脾，乃得稟也。\"故當四肢關節出現疾患，皆可從脾胃尋求病因。脾主肌肉、主四肢，胃與脾互為表里，相輔相成，脾胃虛弱，氣血生化不足，則肌肉失養，出現萎軟無力[12-13]。脾虛不能溫化水飲，容易生痰生濕，凝聚于關節處，阻滯經絡氣血，血行阻滯也是加重KOA的重要病機之一[14]。《素問·生氣通天論篇》曰：“腎氣乃傷，高骨乃壞。”腎精虧虛，則不足以生髓，骨髓不足，致骨密度降低，從而關節軟骨退化，活動時兩骨相互磨損致疼痛。足太陽膀胱經行于體表背面及下肢后側，經脈及經別多次人胸中，受損時，易致膝關節活動困難，屈伸牽扯痛。膝為筋之府，肝在體為筋，肝血不足，筋不能動，筋不束膝骨，其動靜態穩定遭到破壞，則難以正常運動，久而肉萎為骨痹[15]。因此，KOA患者痛敏穴位多位于膝關節內外側，且其痛敏穴多位于胃經、腎經、膀胱經、肝經經脈上。研究發現，KOA患者膝關節周圍陰谷、曲泉、血海穴位出現敏化的概率高達 48.7%¹³¹ 鶴頂、梁丘、曲泉、陰谷、內膝眼、犢鼻、委陽、陰陵泉、膝關、陽陵泉、血海、委中等穴位壓痛敏化率有升高趨勢，為KOA患者痛敏穴的確定提供有效依據，這與本研究的痛敏腧穴研究結果相吻合。

MC廣泛分布于皮膚及內臟黏膜的微小血管周圍，參與人體免疫調節，正常情況下呈紡錘形，儲有肝素、組胺和顆粒物質[。SP是一種廣泛分布于細神經纖維內的神經肽，參與痛覺傳遞，不僅能促進MC脫顆粒，還與MC脫顆粒的神經突觸傳遞遞質有關[18-19]。研究發現，穴位敏化區域的MC 密度顯著高于非敏化區域，且脫顆粒比例更高，這可能與穴位區微環境中神經遞質（如SP）的釋放刺激MC活化有關[]。MC脫顆粒釋放HA和5-HT，且根據其脫顆粒程度決定釋放HA 的量[17，20-2I]。有研究證實，采用甲苯胺藍對穴位敏化的KOA大鼠足三里穴區皮膚染色，發現MC脫顆粒數及脫顆粒率顯著高于不敏化組22，這與本研究中痛敏組MC數量較腧穴組明顯增多，且痛敏組SP、HA、5-HT水平較腧穴組增高的結果具有一致性。以上結果表明，KOA患者痛敏穴位局部MC數量增加且活性增強，繼而引起炎癥因子增多，炎癥因子是導致疼痛的關鍵因素之一，而針刺痛敏穴能夠通過調節局部血流和神經興奮性，促使MC脫顆粒，促進HA、SP等介質釋放，調節局部免疫反應，降低炎癥，進而減少患者疼痛，改善臨床癥狀[23]，這一結果和針刺抗炎鎮痛相關基礎研究的一致，為KOA臨床治療選擇針刺痛敏穴提供了理論依據。

本研究通過對MC和HA、SP、5-HT3種物質特征的研究發現，KOA患者痛敏腧穴局部皮膚炎癥細胞增多，MC脫顆粒現象明顯，HA、SP和5-HT含量增加，于毛囊、血管周圍高度聚集，一方面為解釋穴位敏化現象內涵、明確物質基礎和特征規律提供了重要參考，另一方面總結了KOA穴位敏化規律，對指導臨床針灸治療選穴提供了依據。本研究為了最大化排除個體差異進行自身對照研究，屬于一項探索性研究，隨著檢測技術的發展，本研究亦為進一步開發基于穴位敏化理論指導的穴位檢測、干預都將提供一定的證據和參考。

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（本文編輯 匡靜之）