調(diào)肝益血湯調(diào)控肝細(xì)胞TPO分泌對(duì)IT大鼠 CD34⁺ 造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的影響

[關(guān)鍵詞]免疫性血小板減少癥；調(diào)肝益血湯；血小板生成素；造血干細(xì)胞；巨核細(xì)胞 [中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.06.003

Effects of Tiaogan Yixue Decoction on the differentiation of CD34⁺ hematopoietic stem cells into megakaryocytes in IT rats by regulating the secretion of TPO in hepatocytes

NIE Tian'， YI Qinl*， XU Ronghua’， YANG Lin'， ZHOU Xinxin'，HAO Jingquan'，LI Qinghu2* 1.The First Hospital of Hunan Universityof Chinese Medicine，Changsha Hunan 41oo07，China;2.The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 41ooo5，China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffectsof Tiaogan Yixue Decoction （TGYXD）onthediferentiationofbonemarrow （204 CD34⁺ hematopoieticstemcells intomegakaryocytesinimmune thrombocytopenia（I）ratsbypromoting thrombopoietin （TPO） productioninhepatocytes.MethodsSixtySDratswerestratifiedbybodyweightintoablankgroup（1Orats，receivinganequal volumeofpurifiedwater）andamodelinggroup（5Orats.ThemodelinggroupestablishedtheITatmodelusingtheserummethodof rabbitanti-SDrats.Aftersucesfulmodeling，theyweredividedintoamodelgroup（equalvolumeofpurifiedwater），apositive control group （ 3.6mg/kg dexamethasone），and low-，medium-，and high-dose groups of Chinese medicine （4.275，8.55，17.1 g/kg TGYXD，respectively）according totherandomnumbertablemethod.Gavagebeganonthethirddayafterthesuccesful modeling. After four weks，therats ineach groupweresacrificedThetotal numberof megakaryocytesandthe numberof platelet-producing megakaryocytesweredeterminedbyopticalmicroscope.ThemorphologyofhepatocyteswasmeasuredbyHEstaining.Bonemarrow CD34 ?⁺ hematopoietic stem celswereexaminedbyimmunohistochemical staining.The concentrationsof TPO inserumand bone marrow weredeterminedbyELISA.Results Comparedwiththeblank group，inthemodel group，thetotalnumberofbonemarrow megakaryocytes and the number of platelet-producing megakaryocytes decreased （ P lt;0.05），the number of hepatocytes decreased， the number of bone marrow CD34 + hematopoietic stem cells decreased（ P lt;0.05），and the concentrations of TPO in serum and bone marrow decreased （ P + hematopoietic stem cells decreased （ P lt;0.05），and the concentrations of TPO in serum and bone marrow decreased （ P lt;0.05）;in the high-dose Chinese medicine group，the total number of bone marrow megakaryocytes，thenumberof platelet-producing megakaryocytes，andthenumberofbonemarrow CD34hematopoieticstemcels increased （ P lt;0.05），and the concentrations of TPO in serum and bone marrow increased （ P lt;0.05）.Compared with the low-dose Chinesemedicinegroup，inthemedium-andhigh-doseChinese medicinegroups，thetotalnumberofbonemarow megakaryocytes， thenumerof platelet-producing megakaryocytes，andthenumberof bone marowCD34+hematopoieticstemcelsincreased（ Plt; （204 0.05），and the concentrations of TPO in serum and bone marrow increased（ P lt;0.05）.Compared with the medium-dose Chinese medicinegroup，inthe high-dose Chinese medicinegroup，thetotalnumberofbone marow megakaryocytes，thenumberof platelet-producing megakaryocytes，and the number of bone marrow CD34+ hematopoietic stem cells increased （ P lt;0.05）， and the concentrations of TPO in serum and bone marrow increased （ P lt;0.05）.Conclusion TGYXD may promote the diferentiation of bone marrow CD34 ?⁺ hematopoietic stem celsinto megakaryocytes in ITrats byregulating the productionof TPO in hepatocytes，thus alleviating the maturation disorder of megakaryocytes in IT rats.

ywords] immune thrombocytopenia; Tiaogan YixueDecoction; thrombopoietin; hematopoietic stem cellmegakar

免疫性血小板減少癥（immunethrombocytopenia，IT）是一種自身免疫性出血性疾病，特征表現(xiàn)為骨髓巨核細(xì)胞成熟障礙，外周血血小板數(shù)減少，皮膚紫癲。造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞成熟障礙是IT血小板產(chǎn)生不足的主要原因，其具體發(fā)病機(jī)制已成為國(guó)際研究的重點(diǎn)[2]。肝細(xì)胞產(chǎn)生的血小板生成素（thrombopoietin，TPO）是機(jī)體最重要的內(nèi)源性細(xì)胞因子，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為TPO在巨核細(xì)胞生成血小板過(guò)程中扮演重要角色，其促進(jìn)了巨核祖細(xì)胞的增殖、巨核細(xì)胞的成熟，參與血小板的產(chǎn)生

IT中醫(yī)病名為“紫癲病”，臟腑辨證是其重要的辨證方法，肝血虛為病理關(guān)鍵4。《靈樞·本神》認(rèn)為，肝以生血，肝血化生腎精以充髓。正如葉天士在《本草經(jīng)解·草部上·五味子》所說(shuō)：“肝者敢也，以生血?dú)庵K也。\"現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，肝臟可以產(chǎn)生TPO，促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，從而產(chǎn)生血小板，達(dá)到“生血\"作用。本研究團(tuán)隊(duì)在“肝生血\"理論的指導(dǎo)下，確立了調(diào)肝益血法，在張仲景小柴胡湯基礎(chǔ)上遣方用藥，形成調(diào)肝益血方，從肝細(xì)胞產(chǎn)生TPO調(diào)控造血干細(xì)胞分化切入，探討其治療IT的作用機(jī)制。

1材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，購(gòu)于斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，6＼～7周齡，體質(zhì)量 200～240g 普通級(jí)新西蘭兔6只，購(gòu)于太平生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2023-0011，自由進(jìn)食、飲水，每天觀察各組大鼠毛色、體溫、飲水量、運(yùn)動(dòng)量、大便濕潤(rùn)度的變化。實(shí)驗(yàn)全程按照動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：ZYFY20221111-89。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

調(diào)肝益血湯中藥材購(gòu)于，組方：柴胡 12g ，黃芩 ，人參 9‰ ，白芍10g ，熟地黃 10g ，生地黃 10g ，淫羊藿 10g ，大棗9g ，巴戟天 10g ，甘草 6g_o 調(diào)肝益血湯由制劑室用韓國(guó)東華DHJ-02煎藥機(jī)制備。所有藥物均用冷水浸泡 30min ，水煎煮30min ，水煎濃縮成終濃度 1.71g/mL ，保存?zhèn)溆谩４姿岬厝姿善ǔ?lè)制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：D2403021，國(guó)藥準(zhǔn)字：H41020216，規(guī)格： 0.75mg× 100片/瓶）。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

瑞氏-吉姆薩染色液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：413123）；蘇木素染色液、伊紅染色液（生工生物工程上海股份有限公司，批號(hào)：607317-0100、E607321-0100）；CD34抗體（博奧森生物技術(shù)公司，批號(hào)：bs-8996R）;羊抗兔IgG（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SHB134）；大鼠TPO ELISA 試劑盒（睿信生物科技有限公司，批號(hào)：RX302163R）。

倒置顯微鏡（日本尼康有限公司，型號(hào)：NikonCi-S）；病理切片機(jī)（德國(guó)徠卡有限公司，型號(hào)：RM2235）;酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek有限公司，型號(hào)：Syner-gyH4）;KHB科華生物洗板機(jī)（上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：ST-36WT）。

1.4IT大鼠模型的建立與動(dòng)物分組

60只SD大鼠按體質(zhì)量分層分為空白組（10只）和造模組（50只）。造模組根據(jù)兔抗SD大鼠血小板血清法建立IT大鼠模型，取SD大鼠血小板懸液與 10mL 弗氏完全佐劑等量混勻形成乳白色黏稠乳劑，向新西蘭兔兩后肢足墊及背部多點(diǎn)注射致敏，末次免疫后腹主動(dòng)脈取血，獲取兔抗SD大鼠血小板血清。SD大鼠腹腔注射兔抗SD大鼠血小板血清造模，造模后血小板低于 100×10⁹/L ，而白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)均正常為造模成功。造模成功后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組及中藥低、中、高劑量組。中藥組于造模成功后第3天灌胃給藥，中藥低、中、高劑量組大鼠灌胃量分別為4.275、8.55、17.1g/kg，1 次/d（均按常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人的體表面積比值表折算成大鼠等效灌胃劑量；模型組和空白組大鼠給予等體積的純凈水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃4周；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠參照《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)指南（2020版）》8給予大劑量地塞米松連續(xù)沖擊干預(yù)，每次灌胃 3.6mg/kg 01次/d，連續(xù)灌胃 。

1.5 取材方法

（1）外周血采集：各組大鼠采用 10% 水合氯醛（0.3mL/100g） 腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血 3mL EDTA抗凝。（2）骨髓采集：剝離大鼠股骨，剪斷兩端，取骨髓做骨髓涂片，另用PBS沖洗骨髓腔，獲取骨髓懸液。（3）肝臟剝離：麻醉后打開腹腔，取出完整肝臟，PBS沖洗后將其固定在甲醛溶液中。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1光學(xué)顯微鏡檢測(cè)大鼠巨核細(xì)胞數(shù)取各組大 鼠骨髓細(xì)胞涂片，晾干，置于染色臺(tái)，加瑞氏染色液 染色 10min ，瀝干，加吉姆薩染色液染色 5min ，蒸 餾水沖洗，晾十，普通光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)各組大鼠骨 髓巨核細(xì)胞總數(shù)和產(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞數(shù)。

1.6.2HE染色觀察大鼠肝細(xì)胞形態(tài)將大鼠肝臟組織放于標(biāo)記編號(hào)的包埋盒中，常規(guī)梯度乙醇脫水，石蠟包埋，將切片置于 烤箱烘烤 ⁴h ，行HE染色進(jìn)行病理觀察

1.6.3免疫組化染色觀察大鼠骨髓 CD34⁺ 造血干細(xì)胞形態(tài)將抗原修復(fù)后的切片稍甩干后用免疫組化筆圈定玻片的待測(cè)組織區(qū)域，PBS溶液沖洗3次，每次 5min 。在圈定的區(qū)域內(nèi)加 100μL 樣本的 3% H₂O₂ ，室溫孵育 10min_c 除去PBS溶液，用濾紙擦掉多余的溶液，加 100μL 樣本封閉液，室溫濕盒中孵育 ¹h 。除去封閉液，按1：2000比例加一抗CD34抗體，4 C 濕盒過(guò)夜。復(fù)溫 30min ，除去一抗工作液，PBS溶液沖洗3次，每次 5min ，按1：500比例加二抗羊抗兔 IgG ，室溫濕盒中孵育 ¹h 。PBS溶液沖洗3次，每次 5min 。除去PBS溶液，用濾紙擦掉多余的溶液，加 100μL 新鮮配制的DAB顯色液，室溫孵育 3min ，干燥后，顯微鏡下進(jìn)行視野采集。

1.6.4ELISA檢測(cè)各組大鼠血清和骨髓TPO含量設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μL 、空白孔加標(biāo)本稀釋液 50μL 樣本孔中加入待測(cè)樣本 50μL 除空白孔外，其他孔均加入 50μL 生物素化抗原，混勻，用封板膜封住反應(yīng)孔， 37°C 溫育 60min ，洗板。每孔加入 50μL 酶標(biāo)親和素，用封板膜封住反應(yīng)孔， 37°C 孵育 30min 。洗板5次，用封板膜封住反應(yīng)孔， 37°C 避光孵育15min 。每孔加人 50μL 終止液，在 15min 內(nèi)，于450nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的OD值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS23.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用‘ x± s ”表示，所有資料進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)性和方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析，若不符合正態(tài)性和方差齊性，多組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以 Plt;0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況變化

造模和干預(yù)期間，各組大鼠毛色、體溫、飲水量、運(yùn)動(dòng)量、大便濕潤(rùn)度無(wú)顯著變化，無(wú)死亡發(fā)生。

2.2各組大鼠骨髓巨核細(xì)胞數(shù)比較

與空白組比較，模型組骨髓總巨核細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞數(shù)減少（ （Plt;0.05） 。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和中藥低、中、高劑量組骨髓總巨核細(xì)胞數(shù)及產(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞數(shù)增多 （Plt;0.05） 。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，中藥低劑量組骨髓總巨核細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞數(shù)減少（ _{（Plt;0.05）} ，中藥高劑量組骨髓總巨核細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞數(shù)增多（Plt;0.05） 。與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組骨髓總巨核細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞數(shù)增多（ Plt; 0.05）。與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組骨髓總巨核細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞數(shù)增多 （Plt;0.05） 。詳見表1。

2.3各組大鼠肝細(xì)胞HE染色結(jié)果

空白組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，排列致密。模型組大鼠肝細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞腫脹。陽(yáng)性對(duì)照組和中藥低、中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞數(shù)均有不同程度增多。詳見圖1。

2.4各組大鼠骨髓 CD34⁺ 造血干細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果

與空白組比較，模型組骨髓CD34+造血干細(xì)胞數(shù)減少（ （Plt;0.05） 。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和中藥低、中、高劑量組骨髓 CD34⁺"造血干細(xì)胞數(shù)增多（ Plt; 0.05）。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，中藥低劑量組骨髓 CD34⁺"造血干細(xì)胞數(shù)減少（ Plt;0.05 ，中藥高劑量組骨髓CD34⁺"造血干細(xì)胞數(shù)增多 （Plt;0.05） 。與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組骨髓CD34+造血干細(xì)胞數(shù)增多 （Plt;0.05） 。與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組骨髓CD34+造血干細(xì)胞數(shù)增多 （Plt;0.05） 。詳見圖2、表2。

表1各組大鼠骨髓總巨核細(xì)胞數(shù)量和產(chǎn)血小板型巨核細(xì)胞數(shù)比較 ，個(gè)， n=10 ）

2.5 各組大鼠血清和骨髓TPO濃度比較

與空白組比較，模型組血清和骨髓TPO濃度降低 （Plt;0.05） 。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和中藥低、中、高劑量組血清和骨髓TPO濃度升高 （Plt;0.05） 與陽(yáng)性對(duì)照組比較，中藥低劑量組血清和骨髓TPO濃度降低（ Plt;0.05） ，中藥高劑量組血清和骨髓TPO濃度升高 （Plt;0.05） 。與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組血清和骨髓TPO濃度升高 （Plt;0.05） 。與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組血清和骨髓TPO濃度升高 （Plt;0.05） 。詳見表3。

3討論

IT是一種抗血小板抗體致敏外周血血小板導(dǎo)致的自身免疫性出血性疾病[9-10]。低血小板計(jì)數(shù)對(duì)于IT紫癲形成至關(guān)重要，血小板起源于骨髓巨核細(xì)胞，抗血小板抗體誘導(dǎo)巨核細(xì)胞成熟障礙是其特征性骨髓病理改變]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為IT屬本虛標(biāo)實(shí)之證，涉及肝、脾、腎三臟2]。肝臟的功能與血液的生成密切相關(guān)，《靈樞·本神》提出“肝生血\"的觀點(diǎn)，其機(jī)制與肝應(yīng)春有促進(jìn)、催生血液生成相關(guān)。《素問(wèn)·六節(jié)藏象論篇》載：“肝者，罷極之本，魂之居也，其華在爪，其充在筋，以生血?dú)猓湮端幔渖n，此為陽(yáng)中少陽(yáng)，通于春氣。\"明確指出肝生血的論述，正如柯琴在《傷寒論注·陽(yáng)明脈證上》所說(shuō)“精道由腎，血道由肝”，葉天士在《本草經(jīng)解·草部上·五味子》所說(shuō)“肝者敢也，以生血?dú)庵K也”。本研究團(tuán)隊(duì)在“肝生血”理論的指導(dǎo)下，確立了調(diào)肝益血法，在張仲景小柴胡湯基礎(chǔ)上遣方用藥，形成調(diào)肝益血方。調(diào)肝益血方由柴胡、黃芩、人參、白芍、熟地黃、生地黃、淫羊藿、大棗、巴戟天、甘草組成。小柴胡湯有疏肝解郁之功效，以此加白芍、熟地黃入肝經(jīng)，調(diào)肝益血，體現(xiàn)補(bǔ)血以調(diào)肝柔肝為要；其能促進(jìn)少陽(yáng)生發(fā)之氣，肝生血，腎藏精，養(yǎng)血生精，精血相互資生，則“余臟從之”，加淫羊藿、巴戟天溫腎益精血。因此，全方調(diào)肝生血，養(yǎng)肝

藏血，肝腎和合，以治 Π

IT患者血小板免疫性破壞，需要骨髓不斷有巨核細(xì)胞驅(qū)動(dòng)來(lái)維持血小板數(shù)量，此過(guò)程需要造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行刺激補(bǔ)充[13]。LIU等[4對(duì)骨髓CD34+造血干細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，IT患者中 Lin-CD34^′CD45RA -造血干細(xì)胞數(shù)量減少，當(dāng)與IT患者前B細(xì)胞與CD34*造血干細(xì)胞體外共培養(yǎng)時(shí)其向巨核細(xì)胞譜系分化受到影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組IT大鼠骨髓造血干細(xì)胞CD34+染色表達(dá)率顯著低于空白組，說(shuō)明被動(dòng)免疫狀態(tài)下抗血小板抗體容易對(duì)CD34+造血干細(xì)胞造成損傷。經(jīng)過(guò)低、中、高劑量調(diào)肝益血湯干預(yù)后，IT大鼠骨髓造血干細(xì)胞CD34+染色表達(dá)率均有不同程度的恢復(fù)，同時(shí)IT大鼠骨髓巨核細(xì)胞數(shù)均明顯增加，表明調(diào)肝益血湯具有調(diào)控造血干細(xì)胞，促進(jìn)巨核細(xì)胞分化的作用。

TPO是一種主要源自肝組織的泛造血細(xì)胞因子，其配體為血小板生成素受體，是I型細(xì)胞因子受體家族的成員，主要廣泛表達(dá)于各種造血組織和細(xì)胞中。TPO從肝臟釋放入血后與其受體特異性結(jié)合，從而激活受體，促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞自我更新和增殖，從而促進(jìn)骨髓巨核細(xì)胞分化與增殖[15-1σ。已有研究表明，TPO基因敲除的動(dòng)物血小板數(shù)量降低，巨核細(xì)胞系集落生成細(xì)胞僅為正常數(shù)量的 5%～10%¹⁷ 。本研究結(jié)果表明，與空白組相比，模型組IT大鼠造模后肝細(xì)胞數(shù)量顯著減少，同時(shí)血清、骨髓TPO濃度顯著降低，提示抗血小板抗體容易造成大鼠肝細(xì)胞壞死，引起TPO分泌減少，這可能是IT大鼠CD 34⁺ 造血干細(xì)胞不能向巨核細(xì)胞分化的原因之一。給予各劑量調(diào)肝益血湯干預(yù)后，IT大鼠肝細(xì)胞數(shù)量均不同程度增加，同時(shí)IT大鼠血清、骨髓TPO濃度均顯著增加，這說(shuō)明調(diào)肝益血湯具有促進(jìn)肝細(xì)胞分泌TPO，促進(jìn)改善骨髓造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的作用。

綜上所述，肝細(xì)胞產(chǎn)生的TPO對(duì)促進(jìn)IT大鼠骨髓造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化具有重要作用。調(diào)肝益血湯可以促進(jìn)骨髓CD34+造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，其機(jī)制可能與促使肝細(xì)胞產(chǎn)生TPO有關(guān)。調(diào)肝益血可能是IT重要的中醫(yī)治法，本課題組將進(jìn)一步從TPO信號(hào)下游機(jī)制探索調(diào)肝益血湯干預(yù)IT的分子機(jī)制。

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（本文編輯 周旦）