基于miR-96/RECK信號(hào)通路探討南蛇藤總萜對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用機(jī)制

[摘要]目的探討南蛇藤總萜（TTC）對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）細(xì)胞增殖和侵襲的影響，并研究其是否通過調(diào)控 *miR-96/ 回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白含Kazal基元基因（RECK）通路實(shí)現(xiàn)。方法 選取人ESCC 細(xì)胞系KYSE410為研究對(duì)象。將KYSE410細(xì)胞分為8組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔： Ctrl 組（無藥物處理）L-TTC組 （40μg/mL 的 TTC處理 24h ） ??M -TTC組（ 80μg/mL 的 TTC處理 24h ）、H-TTC組（ 160μg/mL 的TTC處理 24h ）、miR-96NC組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照） 組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照，并用 160μg/mL 的TTC處理 24h ）miR-96mimic組（轉(zhuǎn)染 miR-96mimic ）和miR-96mimic+TTC組（轉(zhuǎn)染 miR-96mimic ，并用 160μg/mL 的TTC處理 24h ）。MTT檢測(cè)TTC對(duì)ESCC細(xì)胞活力的影響。平板克隆實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KYSE410細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。RT-qPCR 檢測(cè) miR-96表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)具有Kazal基序的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)RECK、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9和MMP-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果KYSE410細(xì)胞經(jīng) 20.40，80，160μg/mL 的TTC處理后，可顯著抑制其細(xì)胞活力，并呈劑量依賴性（ Plt; 0.05）。與Ctrl組相比，L-TTC組、M-TTC組和H-TTC組的細(xì)胞克隆數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率及miR-96mRNA、MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低（ Plt;0.05 ），RECK蛋白表達(dá)水平顯著增加 （Plt;0.05） ，呈劑量依賴性。與miR-96NC組相比， miR-96NC+ TTC 組的miR-96mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞克隆數(shù)、細(xì)胞遷移率和穿膜細(xì)胞數(shù)及MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低 （Plt;0.05） ，RECK蛋白表達(dá)水平增加 （Plt;0.05） 。與 miR-96NC 組相比，miR-96mimic組的miR-96mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞克隆數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率及MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著增加（ Plt;0.05） ，RECK蛋白表達(dá)水平顯著降低（ Plt;0.05） 。與 組相比，miR-96mimic+TTC組的 表達(dá)水平、細(xì)胞克隆數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率及MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低 P?0.05 ，RECK蛋白表達(dá)水平顯著增加 （Plt;0.05） 。結(jié)論TTC通過調(diào)控miR-96/RECK信號(hào)通路，有效下調(diào)MMP-9和MMP-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制ESCC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。

本文引用：，靳曉彩，劉海濤，李常娟，趙學(xué)榮，馬立東，喬冠恩.基于miR-96/RECK信號(hào)通路探討南蛇藤總萜對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲的作用機(jī)制[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2025，45（6）：1021-1029.

[關(guān)鍵詞］食管鱗癌；南蛇藤總萜； miR-96 ；回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白含Kazal基元基因；增殖；侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶 [中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.06.005

Mechanism of action of total terpenoids from Celastrus orbiculatus on the proliferation and invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells based on the miR-96/RECK pathway

ZHA NG Wenjuan'， JIN Xiaocai’， LIU Haitao’，LI Changjuan ιs ， ZHAO Xuerong2， MA Lidong'， QIAO Guan'en' 1.DepartmentofGastroenterology，TheFirstHospitalofHandan，Handan，Hebei O56ooo，China; 2.Department of Immunology， Chengde Medical University， Chengde， Hebei O67Oo0， China

[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheeffctsoftotalterpenoidsfromCelastrusorbiculatus （TTC）ontheproliferationand invasionof esophageal squamouscellcarcinoma （ESCC）cellsandtostudywhetheritisachievedbyregulatingthemiR-96/RECK pathway.Methods Human ESCC celline KYSE410 was selected as theresearch object KYSE410cells were divided into 8 groups， each with 3 replicates： Ctrl group （no drug treatment）， L-TTC group （40 μg/mL TTC treatment for 24 h）， M-TTC group （80 μg/mL TTC treatment for 24 h）， H-TTC group （ 160μg/mL TTC treatment for 24 h）， miR-96 NC group （transfected with negative control）， miR-96 NO + TTC group （transfected with negative control and treated with 160μg/mL TTC for 24 h）， miR-96 mimic group （transfected with miR-96 mimic），and miR-96 mimic + TTC group （transfected with miR-96 mimic and treated with 160 μg/mL TTC for24h）.MTTassaywasused todetecttheefectofTContheviabilityofECcell.Platecloningassaycellscratchassay andTranswellassayereusedtoetettheproiferationmigrationandinvasionabiliesofKYSE41cellRPCRasusedto detecttheexpressonlevelofiR-96.Westernblotwasusedtochecktheproteinexpresionlevelsofreversion-inducingcysteinerichproteinwithKazalmotifs（ECK），matrixmetallproteiase9（MP-9）ndmatrixetaloproteiase2（MP-2）estsAfter KYSE410 cells were treated with 20，40， 80， 160 μg/mL TTC，the cell viability was significantly inhibited ina dose-dependent maner （P05）.ComparedwiththeCtrlgroup，thenumberofcellclones，transmembranecels，cellmigrationrate，theexpesion levelsof miR-96 mRNA，MMP-9andMMP-2 proteinsinthe L-TC group，M-TTC group，andH-TTC group weresignificantly decreased （P

[Keywords]esophageal squamouscell carcinoma;total terpenoidsfromCelastrusorbiculatus；miR-96；recoveryguide cysteine-rich protein containing Kazal motif gene；proliferation; invasion; matrix metalloproteinase

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，位居全球腫瘤相關(guān)死亡第6位，其特點(diǎn)為早期難以診斷且易轉(zhuǎn)移。食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cellcarcinoma，ESCC）是食管癌的主要組織學(xué)亞型，約占中國(guó)新診斷病例的 90%^[2] 。由于ESCC的隱匿性特點(diǎn)，患者通常于晚期確診，導(dǎo)致治療效果不理想，預(yù)后較差，5年生存率僅為 20%^[3] 。目前，臨床上尚無批準(zhǔn)的化學(xué)預(yù)防ESCC藥物，其治療仍是一個(gè)重大挑戰(zhàn)4。因此，迫切需要有效的抗癌藥物。南蛇藤為衛(wèi)矛科植物，其莖藤具有苦澀辛辣、性溫稍熱的特性，在中醫(yī)藥學(xué)中常用于祛風(fēng)除濕、疏通經(jīng)絡(luò)、緩解疼痛及促進(jìn)血液循環(huán)和解毒。相關(guān)研究證實(shí)，南蛇藤的提取物———南蛇藤總萜（the total terpenoids of Celas-trusorbiculatusThunb.，TTC）是一種很有潛力的抗腫瘤候選藥物，對(duì)多種惡性腫瘤，包括ESCC，具有顯著抗癌效果。miRNA屬于一類高度保守的小型非編碼RNA分子群體，通過誘導(dǎo)mRNA降解或經(jīng)由與非翻譯區(qū)的部分序列配對(duì)來精細(xì)調(diào)控基因的表達(dá)水平。miR-96是miRNA家族重要成員之一，在ESCC中顯著高表達(dá)，并促進(jìn)其惡性進(jìn)展。具有Kazal基序的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)富含半胱氨酸蛋白（reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK）是一種負(fù)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmet-alloproteinases，MMPs）的新型腫瘤抑制基因。近期研究顯示，RECK能抑制癌細(xì)胞系的侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成，其低表達(dá)與ESCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，RECK還受到miR-96的靶向抑制，進(jìn)而促進(jìn)食管癌的腫瘤侵襲。然而，關(guān)于TTC對(duì)ESCC的有效性，目前研究尚不充分。因此，本研究旨在探討TTC通過調(diào)控miR-96/RECK通路對(duì)ESCC細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，并初步分析其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

人食管鱗系KYSE410細(xì)胞（貨號(hào)：BFN6021517）和正常食管上皮細(xì)胞HEEC（貨號(hào)：BFN60806561）購(gòu)自上海細(xì)胞庫。南蛇藤購(gòu)于廣州至信中藥飲片公司；DMEM培養(yǎng)基（貨號(hào)：11965118）胎牛血清（貨號(hào)：A5256701）購(gòu)自美國(guó)GibcoInvitrogen公司;MTT試劑（貨號(hào)：CT01-5）和雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：LUC1-1KT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;miR- 及其陰性對(duì)照（無貨號(hào)）購(gòu)自武漢金開瑞生物工程有限公司；野生型RECKUTR（RECK-WT）序列 5^′. -CUGCUACUUAUAUAAUUGCCAAA -3^′ 和突變型RECK-UTR（RECK-MUT）序列 5^′. -CUGCUGCU-CACAUAAUACUCUUC- -3^′ 報(bào)告載體由山東Vigenebio公司構(gòu)建；基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）抗體（貨號(hào)：ab76003）基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）抗體（貨號(hào)：ab181286）、具有Kazal基序的逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)富含半胱氨酸蛋白（RECK）抗體（貨號(hào)：ab88249）和 β- 肌動(dòng)蛋白（ β -actin）抗體（貨號(hào)：ab179467）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenqPCRMix試劑（貨號(hào)：FP201）購(gòu)自北京天根科技有限公司。多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：SpectraMaxMini）購(gòu)自上海美谷分子儀器（上海）有限公司；流式細(xì)胞儀（型號(hào)：FACSAriaTMFusion）購(gòu)自美國(guó)BD公司；熒光定量PCR儀（型號(hào)：QuantStudio）購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 TTC的制備

參考既往研究[]，制備TTC：南蛇藤經(jīng)過粉碎處理并干燥，隨后使用 95% 乙醇進(jìn)行3次加熱回流提取，過濾，得到醇提液，減壓濃縮得到醇浸膏；將醇浸膏加水混懸，采用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，得到乙酸乙酯浸膏，該浸膏的主要活性成分為TTC，包括二萜和三萜類。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

ESCC細(xì)胞系KYSE410均在含有 10% 胎牛血清及 1% 青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 % （204號(hào) CO₂ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。

1.4細(xì)胞分組及處理

在培養(yǎng)好的KYSE410細(xì)胞中，加入0、20、40、80、160μg/mL 的TTC培養(yǎng) 24h 和 ^48h ，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，篩選TTC的最佳干預(yù)濃度。將KYSE410細(xì)胞分為8組： Ctrl 組（無藥物處理）L-TTC 組（ ?40|μg/mL 的 TTC 處理 24h ）、M-TTC組（ 80μg/mL 的 TTC處理 24h ）、H-TTC組（ 160μg/mL 的 TTC 處理 24h ）、miR-96NC組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照） 組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照，并用 160μg/mL 的 TTC 處理 24h ）、miR-96mimic組（轉(zhuǎn)染 miR-96mimic ）和miR-96mimic+TTC組（轉(zhuǎn)染 miR-96mimic ，并用 160μg/mL 的TTC處理 24h ）。按照分組，分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的miR-96mimic及其陰性對(duì)照，并用藥物進(jìn)行處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

經(jīng)過胰蛋白酶的消化步驟后，將KYSE410和HEEC細(xì)胞以 1×10⁴ 個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁時(shí)分別加入濃度為0、20、40、 的TTC溶液分別干預(yù) 24h 和 48h_? 0處理結(jié)束后，向各孔中加入 20μL 濃度為 5mg/mL 的MTT溶液，并在室溫條件下繼續(xù)培養(yǎng) ⁴h 。隨后移除培養(yǎng)液，并向每孔內(nèi)加入 150μL 的DMSO。經(jīng)過 10min 的輕微振蕩，確保結(jié)晶物充分溶解。最后，在 490nm 波長(zhǎng)下，使用分光光度計(jì)測(cè)定各孔的OD值。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)

從KYSE410細(xì)胞懸液中吸取 100μL （細(xì)胞密度為 1×10³ 個(gè) /mL ）接種于6孔培養(yǎng)板中，隨后將細(xì)胞置于含有不同濃度 T T C "（ 0 . 4 0 "、 8 0"、 1 6 0" μg / m L "）"的DMEM完全培養(yǎng)基（含 10% 胎牛血清及 1% 青霉素/鏈霉素雙抗）中，在 37°C 恒溫且含有 5% CO₂ 的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)2＼～3周。培養(yǎng)結(jié)束后，使用PBS清洗細(xì)胞， 4% 多聚甲醛溶液室溫固定 15min ，再次用PBS清洗，并使用 0.1% 結(jié)晶紫溶液染色 10min 統(tǒng)計(jì)各孔中的細(xì)胞克隆數(shù)量。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)

在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，首先將Transwell小室置于冰上進(jìn)行預(yù)處理，隨后將KYSE410細(xì)胞以 1× 10⁵ 個(gè) /mL 細(xì)胞的密度接種至上室，上室預(yù)先加入了含有不同濃度 TTC（0.40，80，160μg/mL） 的無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行孵育。同時(shí)，在下室中加入含有 20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為化學(xué)趨化因子，以誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。經(jīng)過 ^48h 的培養(yǎng)周期后，使用4% 多聚甲醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定處理，并采用 0.1% 結(jié)晶紫溶液染色 15min 。利用光學(xué)顯微鏡（放大倍數(shù) ）觀察并拍攝細(xì)胞的侵襲情況，對(duì)侵襲細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)與分析。

1.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

KYSE410細(xì)胞被接種至6孔培養(yǎng)板中，待其生長(zhǎng)至約 80% 的融合狀態(tài)。利用槍頭在培養(yǎng)板底部垂直劃線，并借助PBS沖洗步驟以去除游離的細(xì)胞。在 0h 時(shí)間點(diǎn)，記錄劃痕區(qū)域的面積并拍攝照片以供后續(xù)比對(duì)。向各孔中分別添加了含有不同濃度TTC（0.40，80，160μg/mL） 的新鮮培養(yǎng)基，并將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng) 24h 。利用ImageJ圖像分析軟件，對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積進(jìn)行量化分析，并據(jù)此數(shù)據(jù)計(jì)算出細(xì)胞的遷移速率。

1.9qRT-RCR

從各組細(xì)胞中提取總RNA，操作遵循TRIZOL試劑盒提供的指南。隨后，利用反轉(zhuǎn)錄過程合成 。接下來，準(zhǔn)備qRT-PCR反應(yīng)體系，其中包含 2μL cDNA 、2μL 正向引物 、2μL 反向引物 以及 10μL SYBR Green Master Mix。使用β -actin作為內(nèi)參基因，通過qRT-PCR反應(yīng)檢測(cè)目標(biāo)基因。最終，采用 2^-ΔΔG 方法計(jì)算得出 NA的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列詳見表1。

1.10 雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)

利用LipofectamineTM3000試劑盒，用miR-96 mimic或NCmimic和RECK-WT和RECK-MUT共轉(zhuǎn)染KYSE410細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 ^48h 后，使用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)量熒光素酶活性。

1.11 Western blot

收集KYSE410細(xì)胞后，用RIPA裂解液提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用 5% 脫脂牛奶封閉 2h ，隨后與一抗（RECK、MMP-9、MMP-2，1：10OO稀釋）4 C 孵育過夜，次日加二抗室溫孵育 ²h ，ECL顯色并拍照記錄，以 β -actin為內(nèi)參，用QuantityOne4.6.6軟件分析條帶相對(duì)表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS21.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以 ”的形式表示。對(duì)于兩組間的差異比較，采用獨(dú)立樣本 χ_t 檢驗(yàn)；對(duì)于多組間的差異分析，選用單因素方差分析（ANOVA），進(jìn)一步利用SNK- ?q 進(jìn)行組間兩兩比較。以 Plt;0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TTC對(duì)KYSE410細(xì)胞活力的影響

KYSE410細(xì)胞經(jīng) 的 TTC處理后，可顯著抑制其細(xì)胞活力，并呈劑量依賴性（Plt;0.05） 。詳見表2。 20μg/mL 的TTC雖能抑制細(xì)胞活力 （Plt;0.05） ，但抑制效果相對(duì)較弱，因此選擇 的TTC作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2各組KYSE410細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的情況

與Ctrl組相比，L-TTC組、L-TTC組和H-TTC組的細(xì)胞克隆數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率均顯著降低 （Plt;0.05） 。詳見圖1。

2.3各組KYSE410細(xì)胞miR-96/RECK信號(hào)通路和MMPs蛋白表達(dá)的情況

與 NCmimic 組相比，miR-96mimic組的RECK-WT螢光素酶活性顯著降低 （Plt;0.05） ，RECK-WUT螢光素酶活性無顯著變化（ （Pgt;0.05） 。與 Ctrl 組相比，L -TTC組、L-TTC組和H-TTC組的 及MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低 _{（Plt;0.05）} ，RECK蛋白表達(dá)水平顯著增加 （Plt;0.05） ，并呈劑量依賴性。詳見圖2。

Fig.1Efectsof total terpenoids from Celastrusorbiculatusonproliferation，migrationand invasionof KYSE410cells 注：A.平板克隆實(shí)驗(yàn)；B.Transwell實(shí)驗(yàn)（標(biāo)尺： 50μm ）；C.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。與 Ctrl 組相比， ^*Plt;0.05 ;與L-TTC組相比， ^#Plt;0.05 ;與M-TTC 組相比， ^ΔPlt;0.05， 。

Fig.2Effects of total terpenoids from Celastrus orbiculatus on miR-96/RECK signaling pathway and MMPs protein expression in KYSE410 cells

注：A.雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)：B.miR-96mRNA相對(duì)表達(dá)量;C.RECK蛋白相對(duì)表達(dá)量;D.MMPs蛋白相對(duì)表達(dá)量。與miR-96 mimic組相比， ^?Plt;0.05 ；與 Ctrl 組相比， ^*Plt;0.05 ；與 L -TTC組相比， ^*Plt;0.05 ;與M-TTC 組相比， ^ΔPlt;0.05 9

2.4各組miR-96過表達(dá)KYSE410細(xì)胞增殖、遷移 和侵襲的情況

與miR-96NC組相比，miR-96 NC+TTC 組的miR-96mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞克隆數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率顯著降低 （Plt;0.05） ，RECK蛋白表達(dá)水平顯著增加 （Plt;0.05） 。與miR-96NC組相比，miR-96mimic 組的 表達(dá)水平、細(xì)胞克隆數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率顯著增加 （Plt;0.05） ，RECK蛋白表達(dá)水平顯著降低 （Plt;0.05） 。與 miR-96NC+ TTC組相比， miR-96mimic+TTC 組的 NA表達(dá)水平、細(xì)胞克隆數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率顯著增加（ Plt;0.05） ，RECK蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.05） 。與miR-96mimic組相比， miR-96mimic+ TTC組的 表達(dá)水平、細(xì)胞克隆數(shù)、穿膜細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率顯著降低， （Plt;0.05） ，RECK蛋白表達(dá)水平顯著增加 （Plt;0.05） 。詳見圖3。

2.5各組miR-96過表達(dá)KYSE410細(xì)胞MMPs蛋白表達(dá)的情況

與miR-96NC組相比，miR-96 NC+TTC 組的MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低 （Plt;0.05） 。與miR-96NC組相比，miR-96mimic組的MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著增加 （Plt;0.05） 。與miR-96 ΔNC+TTC 組相比，miR-96mimic+TTC組的MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著增加 （Plt;0.05） 。與miR-96mimic組相比， miR-96mimic+TTC 組的MMP-9和MMP-2蛋白表達(dá)水平顯著降低 （Plt;0.05） 。詳見圖4。

3討論

目前，食管癌的主要治療手段包括手術(shù)切除、化療、放療和分子靶向治療。化療主要包括順鉑、氟尿嘧啶和紫杉醇，在ESCC的治療中發(fā)揮著重要作用，尤其針對(duì)于無法手術(shù)的晚期患者[2]。然而，這些藥物存在非選擇性毒性、毒副作用顯著及患者依從性差等問題[13]。隨著免疫療法的發(fā)展，曲妥珠單抗、拉穆單抗、派姆單抗雖已獲批用于治療食管癌，但常與化療聯(lián)用才能達(dá)到理想療效，且成本高昂，適用患者有限[14]。因此，探索一種新的ESCC化學(xué)預(yù)防藥物勢(shì)在必行。中藥作為一種很有前景的抗腫瘤療法，可以通過促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。研究表明，中藥對(duì)ESCC有良好的治療作用[I5-16]。而南蛇藤作為傳統(tǒng)中草藥，具有消腫止痛、祛風(fēng)活血及解毒等多重功效，應(yīng)用廣泛。其乙酸乙酯提取物TTC是抗癌作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，已在胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及肺癌等多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲與遷移抑制方面展現(xiàn)顯著效果[17-18]。在ESCC的治療，研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤的提取物能夠聯(lián)合miR-302通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移6。另一項(xiàng)研究也表明，TTC通過下調(diào)環(huán)氧化酶-2（COX-2）相關(guān)通路，誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞Eca-109 凋亡，抑制其侵襲轉(zhuǎn)移[。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，TTC在抑制ESCC細(xì)胞生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用，能抑制錨定非依賴性生長(zhǎng)。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的必要條件。癌細(xì)胞首先要有移動(dòng)的能力才能轉(zhuǎn)移，這意味著癌細(xì)胞的移動(dòng)是癌細(xì)胞攻擊周圍組織的先決條件。通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)等功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TTC對(duì)ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲表現(xiàn)出高度的抑制活性。進(jìn)一步證實(shí)，TTC具有良好的抗腫瘤活性，能夠顯著抑制ESCC細(xì)胞的惡性行為。

miRNAs被廣泛報(bào)道參與腫瘤的發(fā)病機(jī)制，涵蓋增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程。在ESCC中，多種miRNA已被確認(rèn)為腫瘤促進(jìn)因子，例如 miR-503^[19] miR-301a-3p^[20] 和 miR-623^[21] 。作為miR-183家族的一員，miR-96已被證明可通過抑制基因表達(dá)調(diào)節(jié)多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和增殖[22]。研究表明， miR-96 可通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA網(wǎng)絡(luò)影響EGFR信號(hào)通路，誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[23；也能夠靶向調(diào)控叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O1（FOX01），抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，并促其凋亡[24]。RECK作為一種腫瘤相關(guān)基因，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖和遷移中起重要作用。先前研究證實(shí)，RECK在正常組織中廣泛表達(dá)，但在ESCC組織中顯著降低，且該基因的啟動(dòng)子高甲基化與ESCC的低表達(dá)和低生存率相關(guān)[25。RECK表達(dá)的恢復(fù)可減少癌細(xì)胞侵襲2。據(jù)報(bào)道，miR-96能通過靶向RECK的3UTR，抑制RECK的表達(dá)，從而促進(jìn)食管癌、非小細(xì)胞肺癌等癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移9，27]。本研究結(jié)果顯示，TTC能顯著降低ESCC細(xì)胞中miR-96的表達(dá)量，并上調(diào)ESCC細(xì)胞的RECK的表達(dá)水平。提示TTC可能通過調(diào)控miR-96/RECK信號(hào)通路，抑制ESCC細(xì)胞的增殖和侵襲。MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)降解的重要因子，一直被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。其中，MMP-9和MMP-2作為MMPs家族的核心成員，能夠通過降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，從而推動(dòng)惡性腫瘤細(xì)胞向其他器官或組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[28。先前研究表明，南蛇藤提取物能下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中MMP-9和MMP-2的表達(dá)水平，進(jìn)而影響其惡性生物學(xué)行為[29。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，TTC能顯著抑制ESCC細(xì)胞中MMP-9和MMP-2的蛋白表達(dá)。據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞中RECK表達(dá)水平的恢復(fù)主要通過降低MMPs（尤其是MMP-2和MMP-9）的表達(dá)抑制遷移和侵襲活性[30。基于上述研究，推測(cè)TTC或可通過調(diào)控miR-96/RECK信號(hào)通路，降低MMPs的表達(dá)，從而抑制ESCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。為深入驗(yàn)證這一機(jī)制，本研究在ESCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了miR-96模擬物（miR-96mimic）及其陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TTC能夠顯著逆轉(zhuǎn)miR-96mimic對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的促進(jìn)作用，并減少M(fèi)MP-9和MMP-2的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了本研究的假設(shè)，即TTC通過抑制miR-26/RECK通路，進(jìn)而抑制MMPs的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)ESCC細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用。

綜上所述，TTC通過調(diào)控miR-96/RECK信號(hào)通路，有效下調(diào)了MMP-9和MMP-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制了ESCC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。本研究為開發(fā)新型抗ESCC藥物提供了新思路。然而，TTC是否通過調(diào)節(jié)其他miRNA或信號(hào)通路發(fā)揮抗ESCC作用，仍有待進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn)

[1]THRIFTAP.Global burdenand epidemiology of Barrett oe-sophagus and oesophageal cancer[J]. Nature Reviews Gastroen-terologyamp;Hepatology，2021，18（6）：432-443.

[2] YAO L H， WU P， YAO F Y， et al. ZCCHC4 regulates esophageal cancer progression and cisplatin resistance through ROS/c-myc axis[J].Scientific Reports，2025，15（1）：5149.

[3] MA R J， MA C，HU K， et al. Molecular mechanism， regulation， and therapeutic targeting of the STAT3 signaling pathway in esophageal cancer （Review）[J].International Journal of Oncology， 2022， 61（3）： 105.

[4] CAO YY，YUJ，LIU T T，etal.Plumbagininhibits the proliferationand survival of esophageal cancer cellsby blocking STAT3-PLK1-AKT signaling [J]. Cell Death amp; Disease，2018， 9 （2）： 17.

[5]毛佛有．南蛇藤的價(jià)值及應(yīng)用[J]．林業(yè)科技情報(bào)，2022，54（4）： 114-117.

[6] 于耀洋，趙佳，李向楠．南蛇藤提取物聯(lián)合 miR-302 通過 PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的研究[J]. 中草藥，2019，50（10）：2371-2376.

[7]金鳳，劉延慶，錢亞云，等．南蛇藤提取物對(duì)人食管鱗癌 TE-8 細(xì)胞凋亡的影響[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（8）：3474-3477.

[8] LIN J，LIU Z W，LIAO SS，et al. Elevation of long non-coding RNAGAS5 and knockdown of microRNA-21 up-regulate RECK expression to enhance esophageal squamous cell carcinoma cellradio-sensitivityafterradiotherapy[J]. Genomics，2020， 112（3）： 2173-2185.

[9] XIA HF，CHEN S M， CHEN K， et al. miR-96 promotes proliferation and chemo-or radioresistance by down-regulating RECK inesophageal cancer[J]. Biomedicine amp;Pharmacotherapy，2014， 68（8）： 951-958.

[10]楊慶偉，梁海鵬，陳小鵬，等．南蛇藤總萜對(duì)人食道癌 Eca-109 細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2020，43（1）： 27-29.

[11] YANG HO， LI X W， YANG W H. Advances in targeted therapyand immunotherapy for esophageal cancer[J]. Chinese Medical Journal，2023，136（16）：1910-1922.

[12] IKEDA G， YAMAMOTO S， KATO K. The safety of current treatment options for advanced esophageal cancer after first-line chemotherapy[J].Expert Opinion on Drug Safety， 2022，21（1）： 55-65.

[13] CHEN JH， GUO Q F，LIU Q G， et al. Chaetoglobosin E inhibits tumor growth and promotes theanti-tumor effiacy of cytotoxic drugs in esophageal squamous cell carcinoma by targeting PLK1[J].Annalsof Translational Medicine，202210（22）： 1236.

[14] LUY，XUML，GUANLL，et al. PD-1 inhibitor plus chemotherapyversuschemotherapyas first-line treatment for advanced esophageal cancer： A systematic review and meta-analysis[J]. Journal of Immunotherapy，2022，45（5）：243-253.

[15] 王敏丹，劉莉，崔夏蓮，等.冬凌草甲素對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌 細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽代謝網(wǎng)絡(luò)影響的研究[J]：上海中醫(yī)藥雜志，2024， 58（7）： 77-82， 94.

[16]李冰，郭占領(lǐng)，周平，等.葛根素通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào) 通路影響食管鱗狀細(xì)胞癌體內(nèi)外生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[J].中藥藥理與臨 床，2020，36（1）：109-114.

[17] FENG X Y，YIN ZX，OU SY，et al.The anti-tumor effects of Celastrus orbiculatus Thunb.and its monomer composition：A review[J]. Journal of Ethnopharmacology，2023，310： 116363.

[18] JANG HJ， KIM K H，PARK E J，et al.Anti-inflammatory activity of diterpenoids from Celastrus orbiculatus in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 cells[J]. Journal of Immunology Research，2020，2020：7207354.

[19]鞏彤陽，陳洪巖，劉芝華．miR503宿主基因通過調(diào)控hsamiR-503信號(hào)通路促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖侵襲和遷移[J].中華 腫瘤雜志，2022，44（11）：1160-1167.

[20] 壽雨薇.食管鱗癌源性外泌體中miR-301a-3p通過誘導(dǎo)巨噬 細(xì)胞向M2型極化促進(jìn)血管生成的研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)， 2022.

[21]費(fèi)松，吳偉東，李丹，等.miR-623 靶向MMP1調(diào)控食管 鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2024，32（14）： 2511-2517.

[22] WAN L，CHENG Z X， SUNQ C， et al. LncRNA HOXC-AS3 increases non-small cell lung cancer cell migration and invasionby sponging premature miR-96[J]. Expert Review of Respiratory Medicine，2022，16（5）：587-593.

[23] DING H，CHU MQ，YUE J J，et al. miR-96 induced nonsmall-cell lung cancer progression through competing endogenousRNA network and affecting EGFR signaling pathway[J]. Iranian Journal of Basic Medical Sciences，2019，22（8）：908- 914.

[24]李峰，劉卓，機(jī)紅平.miR-96在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的變化 及其對(duì)癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜 志，2021，28（3）：275-282.

[25] ZHUJ，LING Y，XU Y，et al.Promoter hypermethylation of the RECK gene isassociated with its low expression and poor survival of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncology Letters，2017，13（3）： 1911-1918.

[26] MASUDA T， FUKUDA A， YAMAKAWA G，et al. Pancreatic RECK inactivation promotes cancer formation，epithelial-mesenchymal transition，and metastasis[J].The Journal of Clinical Investigation， 2023，133（18）： e161847.

[27]GUO HZ，LIQP，LI WH， et al.miR-96 downregulatesRECK topromote growth and motility of non-smallcell lung cancer cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry，2014， 390（1/2）：155- 160.

[28] CHEN L，BI SN，WEI QR， et al. Ivermectin suppresses tumour growth and metastasis through degradation of PAK1 in oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Journal of Cellularand Molecular Medicine，2020，24（9）：5387-5401.

[29]王威，鄧瑞，周培華.南蛇藤提取物通過調(diào)控微小RNA378 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J].河北中醫(yī)，2024，46 （12）： 2017-2023.

[30] TENGMY，HUCY，YANGBM，et al.Salvianolic acidB targets mortalin and inhibits the migration and invasion of hepatocellular carcinoma via the RECK/STAT3pathway[J]. Cancer Cell International，2021，21（1）： 654.

（本文編輯蘇維）