乳粉中單核細胞增生李斯特氏菌能力驗證結果及關鍵環節分析

Ability Validation Results and Key Link Analysis of Listeria monocytogenes in Milk Powder

JIANGJiaxi，HUANGZhishen，WANGYaqiYINWeilu，LIANGeidan （Guangzhou Food Inspection Institute， Guangzhou 5114oo， China）

Abstract： The laboratory participated in the Listeria monocytogenes detection ability verification project led by the National Institutes for Food and Drug Control.It was implemented inaccordance with GB 4789.30—2016and verified by real-time fluorescence PCR.The results showed that Listeria monocytogenes was not detected in sample FC0220092，and Listeria monocytogenes was detected in sample FC0222010.The testresults wereconsistent with the results published by the National Institutes for Food and Drug Control，and satisfactory results were obtained.

Keywords： milk powder; Listeria monocytogenes; ability verification; key link analysis

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes，LM），簡稱單增李斯特氏菌，是一種高致病性食源性人畜共患病原體，因其極端環境適應性與臨床危害性已成為全球公共衛生安全的重要挑戰。該菌能在 -1.5～42^°C 生存，并且能在 4‰ 條件下仍保持繁殖能力。人類食用被單增李斯特氏菌污染的食物后，可能會引起腸胃病、腦膜炎、敗血癥、孕婦流產等疾病，感染后的病死率為 30%～70% ，嬰幼兒、孕婦、老年人等免疫力低下人群更容易感染該菌[1-3]。該菌在自然界中廣泛存在，主要污染魚、肉、蛋、奶以及海產品及制品、蔬菜沙拉、冷凍食品等，給食品安全帶來很大風險[4-5]。我國2020—2022年國家食品安全風險監測數據顯示，生鮮畜禽制品中單增李斯特氏菌陽性率高達 1.7%～3.4% ，顯著高于歐盟同期水平（ 0.8%～ 1.2% ），引起國家和相關部門的廣泛關注。因此，確保食品中單增李斯特氏菌檢驗結果的準確率，是食品檢測機構能力建設的關鍵任務。

能力驗證是評定和監督實驗室和檢驗機構技術能力的重要方式之一，對實驗室和檢驗機構是一種有效的外部質量保證活動，也是內部質量控制技術的補充[。通過能力驗證，能夠更加有效地評價實驗室的檢測能力，不斷改進和提升實驗室的能力水平。本實驗室承擔廣州市監督抽檢餐飲、流通、生產環節各類食品的檢測任務，為了考核實驗室單增李斯特氏菌檢測能力，積極參與中國食品藥品檢定研究院舉辦的能力驗證活動。

1材料與方法

1.1材料與試劑

樣品由中國食品藥品檢定研究院提供，編號分別為FC02220092和FC02220010，樣品為白色球狀、真空包裝于西林瓶，對應基質為2袋奶粉，每份

單增李斯特氏菌（ATCC19115）、英諾克李斯特氏菌（ATCC33090）、斯氏李斯特氏菌（CICC21671）以及伊氏李斯特氏菌（CICC21663）、馬紅球菌（ATCC6939）與金黃色葡萄球菌（ATCC25923），標準菌株均來自國家食品安全菌種保藏中心。

李氏增菌肉湯基礎及配套試劑、革蘭氏染色液、血平板、單增李斯特氏菌生化鑒定試劑，廣東環凱微生物科技有限公司；李斯特菌顯色培養基，法國科馬嘉公司；PALCAM瓊脂基礎及配套添加劑，以及 0.6% 酵母膏的胰酪肺大豆瓊脂，北京陸橋公司；VITEK2鑒定卡，法國梅里埃公司；細菌基因組DNA提取試劑盒；天根生化科技公司； 2× TaqMan qPCR MasterMix，上海東洋紡公司；引物探針，北京六合一華大基因生物公司。

1.2儀器與設備

高壓滅菌鍋，廈門致微公司；生化培養箱，德國賓得公司；VITEK2COMPACT全自動微生物鑒定儀器，法國梅里埃公司；生物顯微鏡，德國徠卡公司；ⅡI級A2型1376生物安全柜、NANODROPONE超微量分光光度計，美國ThermoFisherScience公司；96CFXtouch實時熒光PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的處理

按照作業指導書的要求，對樣品進行如下處理在生物安全柜中，將 225mLLB₁ 增菌液倒入無菌均質袋，采用無菌操作打開西林瓶，將小球加入 LB₁ 增菌液中，待小球完全溶解后，將與西林瓶編碼一致的奶粉基質樣品加入 LB₁ 增菌液中，進行充分均質，確保樣品均勻，該樣品對應的待檢量為 25g 。陽性對照增菌液通過將標準菌株單增李斯特氏菌（ATCC19115）加入 LB₁ 增菌液中制備，陰性對照增菌液則是將標準菌株英諾克李斯特氏菌（ATCC33090）加入LB₁ 中制備。空白對照增菌液不加入任何試劑和菌株。

1.3.2 增菌與分離

參照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB4789.30—2016）[7開展前增菌，取培養 24h 后的 LB₁ 增菌液0.1mL 轉種于 10mLLB₂ 增菌液內，然后用接種環取培養后 LB₂ 增菌液劃線于李斯特顯色平板和PALCAM瓊脂平板， LB₁ 和 LB₂ 增菌液于 （ 培養 24h ，李斯特顯色平板和PALCAM瓊脂平板于（ 36±1 ） °C 培養 48h 。

1.3.3 生化鑒定

挑取李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板的可疑菌落進行純化培養，并開展木糖和鼠李糖的初步生化試驗，對木糖檢測結果為陰性、鼠李糖檢測檢測結果陽性的菌落，再利用VITEK2compact系統開展生化鑒定、染色鏡檢、溶血及協同溶血試驗、動力試驗。

1.3.4實時熒光PCR檢測

取 LB₁ 培養液 2mL 于 2.0mL 無菌離心管中，離心去除培養基，依照細菌DNA快速提取試劑盒操作DNA提取，并利用超微量紫外分光光度計對核酸進行濃度和質量測定，確保基因組DNA的 OD₂₆₀/ OD₂₈₀ 均在 1.7～2.0 ， -20^°C 保存備用。

參考《出口食品中食源性致病菌檢測方法實時熒光PCR法》（SN/T1870—2016）[單增李斯特氏菌的引物探針序列，正向引物序列為5’-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-3’，反向引物序列為 5^° -CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3’探針序列為5’-CGCGACCGAAGCCAACTA-3’其中探針的 5^° 端標記FAM， ₃? 端標記TAMRA。

采用實時熒光PCR對單增李斯特氏菌進行檢測，反應體系 25μL ：預混液 12.5μL ，正反向引物1μL ，探針（ 10μmol?L^-1 ） 1μL ，模板DNA 2μL ，補水至 25μL 。反應條件： ，1個循環; 個循環，收集熒光信號。同時，實驗采用陰性對照、陽性對照、空白對照進行質量控制，每個反應重復2次。

2 結果與分析

2.1增菌培養和平板分離結果

LB₂ 增菌液劃線接種于李斯特氏菌屬顯色平板和PALCAM平板上的菌落形態特征見表1和圖1，樣品FC02220092在顯示平板上為藍色圓形菌落、無暈圈，在PALCAM平板為灰綠色圓形菌落；而樣品FC02220010在顯示平板為藍色圓形菌落、有白色暈圈，在PALCAM平板為灰綠色圓形菌落，初步判定樣品FC02220010可能含有單增李斯特氏菌，但為了防止漏檢，對兩個編號的樣品均開展生化鑒定。

2.2生化鑒定結果分析

從樣品FC02220092、FC02220010的顯示平板和PALCAM平板中分別挑選5個典型或可疑菌落于TSA-YE平板中進行純化培養，然后開展木糖、鼠李糖初步生化鑒定，結果符合開展VITEK生化鑒定、溶血實驗、動力試驗以及鏡檢，結果見表2。綜合VITEK鑒定、革蘭氏染色結果、溶血和協同溶血試驗、動力試驗結果，樣品FC02220092未檢出單增李斯特氏菌，而樣品FC02220010檢出單增李斯特氏菌，陰陽性對照生化鑒定結果符合質量控制的要求。

2.3實時熒光PCR檢測結果

對樣品FC02220092、FC02220010、陰陽性對照、空白對照的 LB₁ 增菌液進行DNA提取，然后按照1.3.4的體系和條件開展實時熒光PCR擴增，檢測結果見圖2。樣品FC02220010有明顯的S型擴增曲線，而FC02220092未獲得S型擴增曲線，陰性對照、陽性對照、空白對照結果符合質量控制要求，說明樣品FC02220092未檢出單增李斯特氏菌，而樣品FC02220010檢出單增李斯特氏菌。

2.4 結果報告

根據國標法和實時熒光PCR檢測結果，可判定樣品FC02220092未檢出單增李斯特氏菌，樣品FC02220010檢出單增李斯特氏菌。檢測結果與中國食品藥品檢定研究院公布的實驗結果一致，說明本實驗室成功通過單增李斯特氏菌能力驗證。

3結論與討論

能力驗證是檢驗實驗室質量控制的關鍵環節，能夠有效監測實驗室檢測過程中人、機、料、法、環等要素的可靠性和結果的準確性。通過參加能力驗證，實驗室可以有效提高檢測能力水平。本研究采用國家標準法和實時熒光PCR方法對2個能力驗證樣品進行單增李斯特氏菌檢測，兩種檢測方法的結果完全符合，樣品FC02220092的檢測結果未檢出單增李斯特氏菌，樣品FC02220010檢出單增李斯特氏菌，且能力驗證最終獲得滿意評價。

在進行單增李斯特氏菌能力驗證實驗時，應注意以下幾個方面。 ① 提前做好實驗準備，準備實驗所需的培養基，并按照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》（GB4789.28—2024）對其進行技術驗收。 ② 實驗操作必須在生物安全柜內，兩個樣品的處理需形成空間隔離或時間隔離，避免交叉污染。 ③ 重點關注李斯特氏菌屬顯色平板的菌落形態。PALCAM平板無法區分李斯特氏菌屬的細菌，而單增李斯特氏菌在顯色平板形成藍綠色并具有白色暈圈的特征性菌落，從肉眼上較容易觀察[9]。 ④ 溶血實驗過程中做好陰陽性對照，穿刺不要觸到底部，避免瓊脂破裂造成實驗結果假陽性。⑤ 采用多種鑒定方法開展能力驗證試驗，本次能力驗證綜合運用傳統培養法和實時熒光PCR方法，兩種方法檢測結果完全相符，確保了結果的可靠性。

參考文獻

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[9]李鳳梅.食品微生物檢驗[M].北京：化學工業出版社，2015.