超高效液相色譜-串聯質譜法檢測保健品中的二氟拉松丙酸酯

Determination of Diflorasone Propionate in Health Products byUltra PerformanceLiquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

MA Xin， WU Junfa， PAN Zhiqi， QIN Yuxin （Guangzhou Inspectionand Testing Certification Group Co.，Ltd.，National Quality Inspection and Testing Center for Processed Food （Guangdong）， Guangzhou 511447， China）

Abstract： Objective： To establish an ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of diflurazone-17-propionateand diflulazone-2l-propionate in health products. Method： The samples were extracted by ultrasonication or vortexing of acetonitrile and 70% acetonitrile， eluted and separated by Waters BEH- ?C₁₈ column （100mm×2.1mm，3.0μm） ， and then determined by electrospray ionization source.Result： The linear relationship between the two diflularsone propionate esters was good in the range of 2.0～ 100.0μg?L^-1 ，and the correlation coefficient R²?0.9987. ，and the average recoveries were 72.3%～92.3% and the relative standard deviations were 4.43%～8.09% under the three spike levels.The limit of detection of solid tablets was 15μg?kg^-1 and the limit of quantification was 40μg?kg^-1 . The limit of detection and quantification of oil-based capsules was 30μg?kg^-1 and 100μg?kg^-1 .Conclusion： This method has short time， low solvent consumption， high recovery，sensitivity and precision，and can accurately analyze difulasone propionate in health care products.

Keywords： ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; health; simultaneous detection; diflulasone propionate

二氟拉松（Diflorasone）及其酯類作為一種高效的皮質類固醇激素制劑，展現出卓越的抗炎、抗瘙癢特性，同時兼備顯著的免疫抑制與縮血管功能，因此在醫學領域中被廣泛應用于治療多種頑固性與復雜性皮膚病[1-2]，為患者提供了有效的緩解與治療方案，顯著改善了患者的皮膚健康狀況。目前，二氟拉松在保健品范疇內的長期使用安全性尚缺乏充分評估。若長期或過量攝入，可能誘發皮膚萎縮、褶皺形成、毛囊炎以及痤瘡等一系列不良皮膚反應[3-5]，從而違背保健品保障健康的初衷。

對于皮質類固醇激素的測定方法主要有液相色譜法[6-7]、液相色譜－串聯質譜法[8-10]。其中，液相色譜法檢測成本低，但分離難度大、耗時較長，且譜圖容易受到雜質峰的干擾，影響分析效果，方法整體靈敏度普遍較低，對于含量為ppb級別的樣品難以檢出。基于此，本研究建立了采用超高效液相色譜-串聯質譜法（Ultra-PerformanceLiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）測定保健品中二氟拉松-17-丙酸酯和二氟拉松-21-丙酸酯的方法，旨在為后續二氟拉松的系列化合物測定提供技術參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

保健食品：廣州市超級市場及跨境電商平臺。

二氟拉松 -17- 丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯標準品：純度大于 98% ，上海安譜實驗科技股份有限公司；甲酸、甲醇、乙腈、正己烷及乙酸乙酯：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2儀器與設備

SCIEX 5500+ 液相色譜-串聯質譜儀：美國SCIEX公司；LC-30AD液相色譜系統：日本島津公司；Milli-QAdvantageA10超純水系統：法國默克密理博公司；4k-15高速離心機：德國西格瑪公司；KQ-800DB超聲波清洗儀：昆山超聲儀器有限公司；MultiReax渦旋振蕩器：德國海道夫公司。

1.3標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取二氟拉松-17-丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯標準品各 10mg ，分別置于10mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，制成 1000mg^-L^-1 標準儲備溶液。

混合標準溶液：準確移取二氟拉松-17-丙酸酯、二氟拉松-21-丙酸酯標準儲備液適量，用乙腈配制得到質量濃度為 10mg?L^-1 的混合標準儲備溶液。

標準工作曲線：使用空白基質提取液稀釋混合標準溶液，配制濃度為 2.0，5.0，10.0，20.0，50.0μgL^-1 和 100.0μg?L^-1 的系列標準溶液。

1.4 前處理方法

（1）固體保健食品。樣品粉碎過80目篩，備用。稱取 0.5g 樣品于 50mL 離心管中，加入 10mL 乙腈，渦旋振蕩 1min 。超聲提取 20min ， 10 000r?min^-1 離心 5min 。上清液經 0.22μm 濾膜過濾，濾液作為供試品用UPLC-MS/MS測定。

（2）油基保健食品。稱取 0.2g 樣品于 50mL 離心管中，加入 2mL 正己烷，渦旋分散均勻后，加入5mL 的 70% 乙腈，渦旋振蕩 3min ， 10 000r?min^-1 離心 5min ，吸取下層溶液至 10mL 具塞比色管中，上層正己烷層用 5mL 的 70% 乙腈溶液重復提取一次，合并兩次溶液，加 70% 乙腈溶液定容至刻度，混勻，經 0.22μm 濾膜過濾后，濾液作為供試品用UPLC-MS/MS測定。

1.5 測定條件

1.5.1 色譜條件

Waters BEH- ?C₁₈ 色譜柱（ 100mm×2.1mm ，3.0μm ）；流動相A為 0.1% 甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流速為 0.3mL?min^-1 ；色譜柱柱溫： 40% ：進樣量： 5μL ；洗脫方式：梯度洗脫。洗脫程序： 0～ 4.0min ， 70%20%A ； 4.0～7.0min ， 20% 0%A ： 7.0～9.0min ， 0%A ： 9.0～9.5*min ， 0%70% A； 9.5～13.0min ， 70%A 。

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源；監測模式：正離子多反應監測模式（MultipleReactionMonitoring，MRM），監測離子對及相關參數見表1。電噴霧電壓：5500V ；氣簾氣壓： ；霧化氣壓力： 50psi 輔助氣壓力： 50psi ；離子源溫度： 500°C 。

2 結果與分析

2.1測定條件及參數的確定

用乙腈配制 1mg?L^-1 的混合標準溶液，使用直接注射的方式注入離子源，對母離子形態進行初步掃描。結果發現，兩種二氟拉松丙酸酯在正和負離子模式下均有響應，而正離子模式的響應比負離子更強，其中加氫模式的響應大于加銨和加鈉，因此最終選擇 [M+H]⁺ 為母離子，同時在流動相中加入甲酸，以促進離子化。兩種二氟拉松丙酸酯的提取離子流圖見圖1。

2.2不同溶劑回收率考察

使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及不同比例的乙腈溶液對不同的基質樣品進行提取，考察不同溶劑對回收率的影響。油基基質因為油的干擾，提取難度較大，回收率相對固體樣品也較低，因此需要使用乙腈水作為溶劑提取，以此來提高提取溶液的極性，從而減少脂溶性雜質的提取。由表2可知，對于固體片劑樣品，乙腈的回收率明顯比甲醇和乙酸乙酯高，說明兩種二氟拉松丙酸酯的極性和乙腈最接近。對于油基膠囊樣品來說，純甲醇和純乙腈的提取效果明顯較低，進一步使用不同比例的乙晴溶液進行提取，發現 70% 的乙腈溶液對目標物的回收率最高，因此最終使用該比例對油基樣品進行提取。

2.3提取方式的選擇

實驗進一步對比了超聲提取、渦旋振蕩提取和水平振搖提取3種提取方式對目標物質回收率的影響。由表3可知，對于固體片劑，超聲提取的回收率最高，渦旋振蕩與之相當；油基膠囊由于體系中分為液液兩相，超聲方式難以使其充分混合，故渦旋振蕩的提取效率更佳。最終選擇超聲提取方式提取固體片劑樣品，渦旋振蕩的方式提取油基膠囊樣品。

2.4線性方程和檢出限、定量限

使用空白基質曲線配制不同濃度的二氟拉松丙酸酯混合標準，采用UPLC-MS/MS進行測定，對應的濃度和測得的定量離子峰面積用于擬合曲線方程；按照儀器3倍和10倍信噪比測得檢出限與定量限，得到的相關結果見表4。可以看出，各目標物質在 2.0～ 100.0μgL^-1 線性關系良好，相關系數 R² 均 ?0.9987 。固體片劑檢出限為 15μg?kg^-1 ，定量限為 40μg?kg^-1 。油基膠囊檢出限為 30μg?kg^-1 ，定量限為 100μg?kg^-1 。

2.5 回收率

為驗證測定方法的準確性，對片劑和魚油膠囊進行加標回收實驗。以其樣品類型對應的定量限的1倍、2倍和10倍進行添加，結果見表5。可以看出，兩種二氟拉松丙酸酯的平均回收率在 72.3% ＼～92.3% ，相對標準偏差在 4.43%～8.09% ，說明該方法回收率和重復性均能達到檢測要求。

表3不同提取方式的回收率結果 單位： %

3結論

實驗分別用乙腈和 70% 的乙晴水溶液對保健品片劑和油基膠囊進行提取，以甲酸水溶液和乙腈作為流動相體系，二氟拉松-17-丙酸酯和二氟拉松-21-丙酸酯峰型良好，且響應較強；選擇不同的碎片離子進行定量分析，降低了色譜的分析要求；方法的回收率、靈敏度和精密度高，可準確測定不同類型保健品中的二氟拉松丙酸酯。

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