海洋真菌Trichodermasp.MDCW-16次級代謝產物的研究

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

Study on secondary metabolites of marine fungus Trichoderma sp.MDCW-16

Xu Rui1， Xu Xinyan1， Xu Huil， Chen Minjun1，Yang Xuefang1，Li Peihai2， Kong Fandong1，and Wang Cong1 （1KeyLaboratoryofChemistryandEngeeringofForestProducts，StateEthnicAfairsCommission;GuangxiKeyLaboratoryof

ChemistryandEngineringofForestProducts/GuangxiColaborativeInnovationCenterforChemistryandEngineringofForestProucts，

GuangxiMinzuUniversityNanning3ooo;EngineeringResearchCenterofZbrafishodelsforHumanDiseasesandDrugreein of ShandongProvine，iologyIstitute，QiluUniversityofechnology（ShandongcademyofSiences），Jian50103）

Abstract Objective To extract the secondary metabolites produced by Trichoderma sp. MDCW-16 from Beibu Gulf and banana wiltcaused by Fusarium oxysporum and study their activities.MethodsThe isolation and purification of compounds were performed by means of column chromatography. And their structures were elucidated through the analysis ofUV，MS and NMR.The isolatedcompounds were evaluated fortheir proangiogenic activity in zebrafish.ResultsOne new pyranone compound and 9 known compounds were isolated and identified： 4-hydroxyphenylacetic acid methyl ester （2），acetoxyphenylethanol （3），4-hydroxybenzaldehyde （4），2-hydroxy3-phenylpropionate methylester （5）， 4-hydroxyphenethyl-2-（4-hydroxyphenyl）acetate （6）， penilactone D （7），

2-（4-hydroxyphenyl）-ethanol （8）， 6-（（2S，3S）-2，3-dihydroxybutan-2-yl）-3-methyl- 2H? -pyran-2-one （9），6-（（2R，3S）- 2，3-dihydroxybutan-2-yl）-3-methyl- ?2H. -pyran-2-one （10）. Compounds 5 and 8 promoted the growth of zebrafish intersegmental vessels at the concentrations of 10 and 20μmol/L ，respectively. Conclusion Compound 1 was proved to be a new pyranone compound. Compounds 5 and 8 had proangiogenic activity.

KeywordsMarine fungi; Trichoderma sp.MDCW-16; Secondary metabolites

海洋環境具有高壓、高鹽度以及低營養等特點，海洋真菌具有復雜的遺傳體系，這使它們能夠產生一些與陸地生物不同的活性天然產物。這些代謝產物往往具有獨特的生物活性，對于抑菌、抗病毒等方面具有顯著的效果[1-4]。混合培養是獲得新化合物的一種有效途徑。Sallan等[5]從殼青霉菌PenicilliumcrustosumPRB2（南極深海）和炭角菌Xylariasp.HDN13-249（紅樹林）的共同培養物中分離獲得4個烷基芳烴，這些化合物對一組菌株（Bacillussubtilis、Mycobacteriumphlei和Vibrioparahaemolyticus）具有一定的抗菌活性，MIC值范圍為 6.25～100μmol/L 。Yurchenk等[6]對一株煙曲霉菌AspergillusfumigatusKMM4631（太平洋軟珊瑚）與四株海洋真菌Amphichordasp.KMM4639、Penicillium hispanicum KMM 4689、Penicillium spKMM4672、AsteromycescruciatusKMM 4696分別嘗試共同培養，發現共培養代謝產物具有DPPH自由基清除活性和脲酶抑制活性，該活性強于KMM4631純培養的次級代謝產物的活性，共培養的代謝產物使HepG2細胞活力降低。Abdel-Wahab等[7將海洋真菌Aspergillusversicolor與Bacillussubtilis進行共培養，從中提取到2個新的蒽醌，1個新的黃喹諾酮22-epi-aflaquinoloneB和1個新的環狀五肽cotteslosinC。新化合物只在共培養提取物中發現，2株菌的純培養提取物中沒有檢測到。此外，對共培養的次級代謝產物進行活性測試，發現8- O -methylversicolorinB、 o -demethylsterigmatocystin、AGI-B4和stephacidinA表現出較強的細胞毒活性。VersicolorinB、averufin、diorcinolD、diorcinolsG和I對小鼠淋巴瘤細胞L51780Y的IC 50 值為 2.0～21.2μmol/L ，對5種革蘭陽性菌Enterococcusfaecium ATCC 700221、Staphylococcusaureus ATCC29213、EnterococcusfaecalisATCC51299、EnterococcusfaeciumATCC35667和EnterococcusfaecalisATCC29212具有中等抑制活性，MIC值為12.5＼～50μmol/L。

本文從北部灣海泥樣品中分離獲得一株真菌Trichodermasp.MDCW-16，通過與香蕉枯萎病菌共同培養，從發酵物中分離鑒定了1個新的吡喃酮類化合物1，以及9個已知化合物，其結構如圖1所示。此外，對分離得到的化合物進行斑馬魚促血管生成活性評價，化合物5和8具有一定的促血管生成活性，為開發防治心血管疾病的創新藥物提供先導化合物，豐富了海洋真菌次生代謝產物的研究。

1材料與方法

1.1實驗儀器與試劑

SJ-CJ-2F型潔凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司）、AgilentCary60UV-Vis（美國安捷倫科技有限公司）、日立PrimaideHPLC（北京日立科學儀器有限公司）、AvanceCore 400MHz 核磁共振儀（北京布魯克科技有限公司）、BXM-30R型高壓滅菌鍋（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）、SPX-500型生化培養箱（寧波江南儀器廠）、YMC*GELODS-A-HG反相硅膠（日本YMC Group）、Nacalai tesque COSMOSIL5C18-MS-II型（ 250mm×10mm ， 5μm） 半制備柱。提取分離所用乙酸乙酯和甲醇等溶劑均為工業用化學純，HPLC所用甲醇和乙腈均為色譜純。

1.2實驗菌株來源及鑒定

菌株MDCW-16分離自廣西北部灣的海泥樣品。該菌株的基因組DNA處理及測序工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。測序結果與NCBI數據庫進行對比，結合菌株的生長形態和ITS測序鑒定結果，將該菌株鑒定為Trichodermasp.MDCW-16。利用MEGA（Version7.0）繪制了該菌株的系統進化樹。

1.3菌株發酵

在PDA培養基上分別接種MDCW-16和香蕉枯萎病菌[8]，置于 28^°C 恒溫培養箱中培養 ^4d 。在超凈工作臺中將長有菌的培養基劃成小塊分別挑入大米固體培養基（大米 80g ，海水 120mL ）中共同培養，室溫30^°C 條件下靜置發酵 30d ，發酵規模為 1000mL 錐形瓶100瓶。

1.4次級代謝產物的提取分離

發酵完成后，菌株MDCW-16發酵物用乙酸乙酯萃取3次，經過過濾和減壓濃縮后得到77.65g粗浸膏。使用石油醚、 90% 甲醇-水各2L對粗浸膏進行萃取，在分液漏斗中混勻、靜置過夜。待兩層液體完全分開后，將上層液體從上口倒出，下層液體從旋塞放出。之后分別進行減壓濃縮，得到石油醚萃取物32.46g和 90% 甲醇-水萃取物 38.92g 。

特付到的 中時-小層怕提徹近節仕已諧層析，進行梯度洗脫（乙酸乙酯和石油醚），濃縮后經TLC檢測各餾分。如圖2所示，首先以乙酸乙酯-石油醚按照1：10、1：8、1：6、1：4、1：2、1：1和1：0的梯度進行減壓硅膠柱色譜洗脫，經TLC合并獲得10個餾分（Fr.1＼～Fr.10）。將其中 790mg 的Fr.3以1：1的二氯甲烷：甲醇進行凝膠色譜柱等度洗脫，經TLC合并獲得5個餾分。再將上述得到的Fr.3.3通過半制備HPLC（ ΔC₁₈ 半制備柱，甲醇-水 30：70 ， 4mL/min 分離得到化合物1 （t_R=14.1min ， 1mg ）。將質量為500mg 的Fr.5以1：1的二氯甲烷：甲醇 進行凝膠色譜柱等度洗脫，經TLC合并獲得2個餾分和化合物2（ Δt_R= 8.4min ， 23.7mg ）。再將Fr.5.1經半制備HPLC（ ΔC₁₈ 半制備柱，甲醇-水 40：60 ， 4mL/min） 分離得到化合物3 Δt_R=15.2min ， 2.6mg 。將上述得到的Fr.5.2經半制備HPLC（ ΔC₁₈ 半制備柱，甲醇-水30：70， 4mL/min） 分離得到化合物4 （t_R=9.5min ， 12.7mg 。將質量為1.856g的Fr.7以甲醇-水 10%100% 的梯度進行中壓反相硅膠柱色譜洗脫，經TLC合并獲得3個餾分。將上述得到的Fr.7.1經半制備HPLC（ 半制備柱，甲醇- .0.1% 三氟乙酸水溶液20：80， 4mL/min 分離得到化合物5 ?（t_R=10.4min ， 9.8mg 。將質量為 4.633g 的Fr.10以甲醇-水 （10%100% 的梯度進行中壓反相硅膠柱色譜洗脫，經TLC合并獲得3個餾分和2個化合物，化合物6 t_R=14.4min ， 6.9mg 和化合物7 t_R= 39.4min ， 3.6mg ）。再將Fr.10.1經半制備HPLC0 ΔC₁₈ 半制備柱，甲醇-水30：70， 4mL/min） 分離得到化合物8 （t_R）=6.5min ， 1.9mg ）。將上述得到的Fr.10.2經半制備HPLC（ ΔC₁₈ 半制備柱，甲醇-水35：65， 4mL/min） 分離得到化合物9 t_R=12.5min ， 4.4mg ）。將上述得到的Fr.10.3經半制備HPLC （C₁₈ 半制備柱，乙腈-水30：70，4mL/min） 分離得到化合物10 ， 6.8mg 。

1.5促血管生成活性測試

將轉基因Tg（fli-1：EGFP）系斑馬魚卵放于 28°C 培養箱中發育 20～24hpf ，收集魚卵去除養魚水后加入 1mg/mL 鏈霉蛋白酶E，脫除卵膜獲得斑馬魚胚胎。向24孔板中依次加入2mL的養魚水、 0.2μg/mL 血管生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（PTK787）和待測樣品以及10個斑馬魚胚胎作為實驗組，以只加入養魚水和斑馬魚胚胎的體系為正常對照組，以加入養魚水、 0.1% 的DMSO和斑馬魚胚胎的體系作為溶劑對照組，以加入養魚水、PTK787和斑馬魚胚胎的體系作為模型組，以加入養魚水、 阿魏酸（ferulicacid）、PTK787和斑馬魚胚胎的體系作為陽性藥組，每組實驗3個平行。實驗體系于 28°C 培養 24h 后，使用OLYMPUS熒光顯微鏡觀察斑馬魚節間血管的生長情況，拍照統計分析確定各樣品的促進血管生成活性[9]。

2結果與討論

2.1 菌種鑒定

菌株MDCW-16的ITS序列PCR擴增序列長度為581bp，這與NCBI數據庫中的菌株Trichodermakoningiopsis（MK791712.1）的ITS序列在基因組中完全一致，親緣關系在系統進化樹上是同一分支。進一步觀察其形態特征，菌落呈白色圓形，菌絲密集并向四周擴展，菌落中央產生綠色孢子，與木霉菌的形態特征一致[10]。因此，初步鑒定MDCW-16為木霉菌，并將其命名為Trichodermasp.MDCW-16（圖3）。

2.2化合物結構鑒定

化合物1：淡黃色油狀物；高分辨質譜HR-ESI-MS在m/z235.0945給出準離子峰 [M+Na]⁺ ，提示分子式為 C₁₁H₁₆O₄ ；該化合物與化合物10的核磁數據相似，為同系列化合物，初步判斷為吡喃酮類化合物。¹³C NMR及HSQC譜表明分中子存在2個雙鍵季碳 （δ_C 164.0，124.7），1個酯炭基 （δ_c165.9） ，2個雙鍵次甲基（20 ，1個 ?sp³ 雜化的含氧季碳（204號 （δ_c81.9） ，1個sp雜化的含氧次甲基 （δ_C/H72.6/3.94） ，以及4個甲基 （δ_C/H17.3/1.15 ，16.5/2.06，14.6/1.42，51.4/3.17），其中包括1個含氧甲基。這些數據與6-（2，3-dihydroxybutan-2-yl）-3-methyl- .2H. -pyran-2-one的核磁數據非常相似[1]，區別僅是化合物1中多了一個甲氧基信號 （δ_C/H51.4/3.17） 。COSY譜圖中給出H-9/H-8和H-4/H-5的相關；HMBC譜圖中給出H-11與C-4、C-3及C-2，H-10與C-6、C-7及C-8，H-9與C-8及C-7，H-8與C-10、C-9、C-7及C-6，H-5與C-7、C-6及C-3，H-4與C-11及C-6的相關信號（圖4）。這些數據證明了化合物1的骨架與6-（2，3-dihydroxybutan-2-yl）-3-methyl-2H. -pyran-2-one一致。此外，HMBC譜圖中還給出甲氧基氫7-OMe與C-7相關信號，證明了化合物1多出來的甲氧基位于C-7位。因此，化合物1的結構被確定為6-（2-methoxybutan-3-hydroxy-2-yl）-3-methyl- 2H. -pyran-2-one。因化合物1比旋光度和ECD結果皆為零，推測化合物1可能是由兩個對映體組合而成的混合物。但化合物1的量過低，無法通過HPLC制備進行手性拆分，無法進一步確定其絕對構型。

化合物2：紅棕色油狀物；ESI-MSm/z189.1[M+Na]⁺ ，分子式 C₉H₁₀O₃ ; ¹H NMR （400MHz ，CDCl₃. ） δ_H7.10 （2H， d， J=8.0Hz ，H-2，H-6），6.75 （2H，d， J=7.9Hz ，H-3，H-5）， 3.69 （3H， s，H-10），3.55 （2H， s，H-7）; ¹³C NMR 100MHz ， CDCl₃. ） δ_c173.2 （C， C-8），155.2 （C，C-4），130.5 （CH，C-2），130.5（CH，C-6），125.7（C， C-1），115.7 （CH，C-3），115.7 （CH，C-5），52.3（ CH₃， C-10），40.4（CH，C-7）。該化合物的數據與文獻[12]報道的一致，故化合物2鑒定為4-羥基苯乙酸甲酯。

化合物3：淡黃色粉末；ESI-MSm/z203.1[M+Na]⁺ ，分子式 C₁₀H₁₂O₃ ; ¹H NMR （400MHz 0CDCl₃ 三 δ_H7.08 （2H， d， J=8.5Hz ，H-2，H-6），6.77 （2H，d， J=8.4Hz ，H-3，H-5），4.22（2H，t， J=7.1 Hz，H-8）， 2.85（2H，t， J=7.1Hz， H-7），2.03 （3H，s，H-2）; ¹³C NMR（100MHz， CDCl₃^? ）： δ171.3 （C，C-1），154.5 （C，C-4），130.2（CH，C-2），130.2 （CH，C-6），130.0 （C， C-1），115.5 （H，C-3）， 115.5 （CH， C-5）， 65.3 （ CH₂ C-8），34.4（ CH₂， C-7），21.1 （ CH₃ ，C-2'）。該化合物的數據與文獻[13]報道的一致，故化合物3鑒定為對乙酰氧基苯乙醇。

化合物4：淡黃色粉末；ESI-MS m/z 267.0 [2M+Na]⁺ ，分子式 C，H₆O₂ ： ¹H NMR （400MHz PCD₃OD） 二 δ_H9.76 （1H， s，H-7）， 7.77 （2H， d， J=8.7Hz 0H-2，H-6），6.91 （2H， d， J=8.6Hz H-3，H-5）; ¹³C NMR（ 100MHz CD₃OD ）： δ192.6 （CH，C-7），165.0 （C，C-4），133.2 （CH，C-2）， 133.2 （CH，C-6），130.1 （C，C-1），116.7（CH，C-3），116.7（CH，C-5）。該化合物的數據與文獻[14]報道的一致，故化合物4鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物5：黃色油狀物；ESI-MS m/z 181.1 [M+H]⁺ ，分子式 C₁₀H₁₂O₃ ： ¹H NMR （ （400MHz ， CD₃OD） 三 8_H7.23 （5H， m，H-2'，H-3'，H-4'，H-5'，H-6'）， 4.35 （1H， m，H-2）， 3.69 （3H， s，1-OMe），3.06 （1H， m， H-3a），2.91 （1H，dd， J=13.8 ， 7.5Hz ，H-3b）; ¹³C NMR C 100MHz 0 CD₃OD ） δ_C 175.5 （C， C-1）， 139.0 （C， C-1）， 130.6（CH，C-3），130.5（CH，C-5'），129.3（CH，-2'）， 129.3 （CH， C-6），127.6 （CH，C-4）， 73.1 （CH， C-2）， 52.3 0 CH₃. 1-OMe），41.6（ CH₂. ，C-3）。該化合物的數據與文 獻[15-16]報道的一致，故化合物5鑒定為2-羥基-3-苯 基丙酸甲酯。

化合物6：紅棕色油狀物；ESI-MSm/z567.2 （204號 [2M+Na]⁺ ，分子式 C₁₆H₁₆O₄ ： ¹H NMR （400MHz 0 CD₃OD ） δ_H7.02 （2H， d， J=8.4Hz ，H-2，H-6），6.96 （2H， d， J=8.4Hz ，H-13，H-17），6.71（2H，d， J=8.4Hz ，H-3， H-5）， 6.68 （2H， d， J=8.4Hz ，H-14， H-16）， 4.20 （2H，t， J=6.8Hz ，H-8），3.48 （2H， s，H-11）， 2.78 （2H， t， J=6.8 Hz， H-7）; ¹³C NMR （ 100MHz ，CDOD）： δ174.1 （C， C-10）， 157.5 （C，C-15），157.0 （C，C-4），131.4（CH， C-13）， 131.4 （CH， C-17）， 130.9 （CH， C-2）， 130.9 （CH， C-6），130.0 （C， C-1）， 126.3 （C， C-12）， 116.3 （CH， C-3）， 116.3 （CH， C-5）， 116.2 （CH， C-14），116.2 （CH，C-16）， 66.9 （CH， C-8）， 41.3 （CH，C-11），35.2（ CH₂ C-7）。該 化合物的數據與文獻[17報道的一致，故化合物6鑒 定為4-羥基苯乙基-2-（4-羥基苯基）-乙酸酯。

化合物7：黃色油狀物；ESI-MSm/z247.1 [M+Na]⁺ ，分子式 C₁₂H₁₆O₄ ； ¹H NMR （400MHz CD₃OD） ： δ_H 7.09 （2H， d， J=8.4Hz ，H-4，H-8），6.71 （2H， d， J=8.4Hz ，H-5，H-7）， 4.74 （1H，m，H-9），3.71 （1H， m， H-10），3.53 （2H， s，H-2），1.17 （3H， d， J=6.5Hz ，H-11）， 1.09 （3H， d， J=6.4Hz ，H-12）; ¹³C NMR （100MHz 0 CD₃OD） ： 8173.7 （C，C-1）， 157.5 （C， C-6），131.4 （CH， C-4），130.9 （CH， C-8）， 126.4 （C， C-3）， 116.2 （CH， C-5）， 116.2 （CH， C-7）， 75.9 （CH， C-9）， 70.2 （CH， C-10）， 41.4 0 CH₂， C-2），18.6（ CH₃ ，C-12），15.3（ CH₃ ，C-11）。該化 合物的數據與文獻[18]報道的一致，故化合物7鑒定 為戊內酯D。

化合物8：無色油狀物；ESI-MSm/z275.2[M+H]⁺ ，分子式 C₈H₁₀O₂ ： ¹H NMR 400MHz ，CD₃OD） ： 8_H7.03 （2H， d， J=8.4Hz， H-3，H-5）， 6.70 （2H，d， J=8.4Hz ，H-2，H-6），3.68（2H，t， ，H-8），2.71（2H，t， J=7.3Hz ，H-7）; ¹³C NMR （ 100MHz ， CD₃OD ） δ_C 156.6 （C，C-4），130.8 （CH，C-3），130.8 （CH，C-5），130.7（CH，C-2），130.7 （CH， C-6），115.9 （C，C-1），64.4 （ CH₂ （2號C-8），39.2 （ CH₂ ，C-7）。該化合物的數據與文獻[19]報道的一致，故化合物8鑒定為2-（4-羥基苯基）-乙醇。

化合物9：黃色油狀物；ESI-MS m/z 221.0 [M+Na]⁺ ，分子式 C₁₀H₁₄O₄ ; ¹H NMR （400MHz CD₃OD） 二 δ_H 7.34 （1H， dd， J=6.8 1.3Hz ，H-4），6.45 （1H，d， J=6.8Hz ，H-5），3.91 （1H，q， J=6.5 Hz，H-8），2.05（3H， d， J=1.0Hz ，H-11），1.47（3H，s，H-10），1.10（3H，d，J=6.5Hz ，H-9）; ¹³C NMR （ 100MHz ， CD₃OD） ： δ_C 167.8（C， C-6），165.6 （C， C-2），142.2 （CH，C-4），123.6 （C，C-3），103.5 （CH，C-5）， 76.3 （C， C-7）， 72.5 （CH，C-8），22.8 CH₃ ，C-10），17.6 （ CH₃ C-9），16.4 （ CH₃， C-11）。該化合物的數據與文獻[11]報道的一致，故化合物9鑒定為6-（2S，3S）-2，3-二羥基-2-丁基）-3-甲基-2H-吡喃-2-酮。

化合物10：黃色油狀物；ESI-MSm/z221.1 [M+Na]⁺ ，分子式 C₁₀H₁₄O₄ ； ¹H NMR （ 400MHz ， CD₃OD 三 8_H7.33 （1H， dd， J=6.8 ， 1.3Hz ，H-4），6.45 （1H， d，J=6.8Hz，H-5），3.96 （1H，q， J=6.3Hz H-8），2.03 （3H，d，J=1.0 Hz，H-11），1.36 （3H，s，H-10），1.17 （3H，d， J=6.4Hz H-9） ¹³C NMR （ 100MHz ， CD₃OD） ） δ_C 168.2 （C，C-6），165.8 （C，C-2），142.2 （CH，C-4），123.5 （， C-3），103.5 （CH，C-5）， 76.7 （C， C-7）， 72.3 （CH，C-8）， 22.9 （ CH₃， C-10），17.0 （ CH₃ C-9），16.4 （ CH₃ C-11）。 該化合物的數據與文獻[11]報道的一致，故化合物10 鑒定為6-（（2R，3S）-2，3-二羥基-2-丁基）-3-甲基-2H-吡 喃-2-酮。

2.3促血管生成活性測試結果

測試9個化合物（化合物2＼～10）對斑馬魚節間血管的生長促進作用。如圖5所示，空白對照組斑馬魚節間血管生長正常，而模型組節間血管的生長明顯被抑制。與模型組相比，化合物5和8處理的斑馬魚節間血管長度在濃度為10和 時顯著增加（ P lt;0.05） ，說明化合物5和8在10、 濃度時具有促血管生成活性。

3結論

通過與香蕉枯萎病菌共培養模式對真菌Trichodermasp.MDCW-16進行發酵，從共培養的發酵物中分離得到1個新的吡喃酮類化合物和9個已知化合物。基于斑馬魚模型對化合物2＼～10進行促血管生成活性篩選，發現化合物5和8在10和 濃度時具有促血管生成活性。

對北部灣海洋來源菌株與致病菌共培養條件下進行次級代謝產物的研究報道較少。對Trichodermasp.MDCW-16的次級代謝產物進行更深入的研究，尋找到新的化合物，為心血管疾病創新藥物的開發提供先導化合物。

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注：A為斑馬魚節間血管熒光顯微圖像；B為節間血管長度；與空白對照組（Control）相比， ^##Plt;0.01 為差異極顯著；與模型組（Model）相比， ?_P lt;0.05 為差異顯著， ^\"Plt;0.01 為差異極顯著；Compd為化合物。

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