北部灣海洋曲霉菌MDKFD-13產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物及其抗氧化活性

Secondary metabolites produced by marine Aspergillus sp.MDKFD-13 in Beibu Gulf and their antioxidant activities

Wang Zimin，Hou Hailing，Ou Mei，Luo Huashan， Su Yijie， Tan Ping，and Kong Fandong

（CollgeofChemistryandChemicalEngineering，GuangxiMinzu UniversityforNationalities，KeyLaboratoryofForestProducts

ChemistryandEngineeingofStateEthicAairsommissonGuangxiKeyLaboratoryColaborativeInovationCnteFoest Products Chemistry and Engineering，Nanning 530006）

AbstractObjectiveTo study the secondary metabolites produced by Aspergillus sp.MDKFD-13 from spiny snail inBeibu Gulf and itsantioxidant activity，andtoobtain activesecondary metabolites with noval structures. MethodsRice solid medium was used to ferment the strain，and ethyl acetate was used to extract the fermentation product; A variety of chromatographic methods，such as normal and reverse phase ODs （octadecylsilyl） column chromatographyandsemi-preparative liquid，were used for separation and purification; The structures ofthe isolated compounds were identified by mass spectrometry， nuclear magnetic resonance and physicochemical properties; The antioxidant activity of the compounds was tested bythe DPPH method.ResultsEleven compounds （1＼～11） were identified from Aspergilus sp.MDKFD-13.Compound1 was isolated from nature with theNMR data reported for the first time. The other 10 compounds were identified as 2-（ E， E-3， 5-heptadienyl）-3，6-dihydroxy-5-（3-methyl-2-butenyl） benzaldehyde （2），2-（ E -3-heptenyl）-5-isopentenyl-3，6-dihydroxybenzaldehyde （3）， isotetrahydroauroglaucin （4），2- （E，E-1，3-eptadienyl）-3，6-dydrox-5-（3-methyl--butenyl）benzaldehyde （5），methyllioleate （6），spretin， （20 （2R） -2-（4-hydroxyphenyl） ethyl 2-hydroxy-3-phenylpropanoate （8），4-hydroxyphenyl2-（4-hydroxyphenyl）acetate （9）， ethyl-（ S） -4-（2，3-dihydroxy-3-methylbenzoxy）benzoate （10），and diaportheins A （11）. Compounds 2＼～6 had antioxidant activity， and their IC₅₀ values were 15.4，16.5，20.2，11.5， and 11.1μmol/L ，respectively. Conclusion Eleven compounds were isolated from Aspergilus sp.MDKFD-13 from the spiny snail in the Beibu Gulf of Guangxi. Compound 1 was a new natural product， while compounds 2＼～6 showed significant antioxidant activity.

Key WordsMarine Aspergillus; New natural products; Structural identification; Antioxidant activity

地球表面的 70% 都是海洋，海洋是地球上生命的起源。生物資源相當(dāng)豐富，包括微生物資源、植物資源、動物資源等，其中約 80% 的生物資源還沒有被開發(fā)[]。海洋是一座寶庫蘊藏著很多新的化學(xué)分子和生物分子。天然產(chǎn)物是生物活性物質(zhì)的重要來源，是新藥開發(fā)的重要資源[3]。相對于其他環(huán)境來說，海洋中有著更多種的特殊環(huán)境，各種各樣的環(huán)境使得海洋生物產(chǎn)生了各種各樣的應(yīng)對機制，改變了自身行為、新陳代謝途徑、生理和生化等特征[2]。鑒于此，海洋微生物的代謝通路通常別具一格，其所生成的次生代謝產(chǎn)物不但種類繁多、架構(gòu)新穎，而且生物活性突出，在藥物研發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出了極為可觀的成藥潛力[4]。

隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們了解到自由基在特定環(huán)境下對機體有影響，補充抗氧化劑可改善這一情況[5]。抗氧化劑能延緩或阻止蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等底物氧化[6-7]。天然抗氧化劑因其安全無害而備受關(guān)注，對醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域具有重要意義[8]。研究發(fā)現(xiàn)，某些天然產(chǎn)物具有顯著抗氧化活性。DPPH法是評價抗氧化活性的快速方法。

本研究對廣西北部灣刺螺來源曲霉菌MDKFD-13的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，獲得了一系列苯的衍生物和一個萜類化合物，共11個天然產(chǎn)物（圖1），其中化合物1為新天然產(chǎn)物，對這些化合物的抗氧化活性進(jìn)行深入研究，化合物2、3、4、5和6具有強的抗氧化活性。

1材料與方法

1.1實驗儀器與試劑

實驗儀器：AgilentInfinityLabLC/MSD質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）、Epoch酶標(biāo)儀（美國Biotek公司）、Primaide分析高效液相色譜（日本Hitachi公司）、5PFP（ （250mm×10mm ， 5μm ，日本Nacalaitesque公司）制備型高效液相色譜柱、反相硅膠YMCGELODS-A-HG（日本YMC公司）、CR-080R型春霖超聲波清洗機（深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司）、AL104型分析天平（瑞士MettlerToledo公司）、HCB-1300V潔凈工作臺（青島海爾特種電器有限公司）、 5C₁₈ -MS-II（ 250mm×4.6mm ， 5μm ，日本Nacalai tesque公司）分析高效液相色譜柱、LRH-500A型生化培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）、SCI-VS混勻儀（美國Scilogex公司）、SeriesIII制備型高效液相色譜（美國LabAlliance公司）、AVANCE400MHz 核磁共振儀（德國Brucker公司）、200＼～300目正相硅膠（青島海洋化工集團公司）、YXQ-LS-75SII型高壓滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、5PFP中 250mm×4.6mm ， 5μm ，日本Nacalai tesque公司）分析高效液相色譜柱、Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、 5C₁₈ -MS-II（ ?C₁₈ ， 250mm×10mm 5μm ，日本Nacalaitesque公司）制備型高效液相色譜柱。乙酸乙酯、甲醇以及二氯甲烷被用于提取分離，它們均為工業(yè)領(lǐng)域的化學(xué)純產(chǎn)品。

1.2實驗菌株

菌株Aspergillussp.MDKFD-13，分離自廣西北部灣刺螺樣品。對菌株的生長形態(tài)展開對比分析；

菌株基因組DNA的相關(guān)實驗流程，包括提取、擴增、純化以及測序環(huán)節(jié)，均交由上海生工生物工程股份有限公司負(fù)責(zé)實施，以確保實驗的專業(yè)性與精準(zhǔn)度。隨后，運用NCBI數(shù)據(jù)庫，將ITS測序所獲得的鑒定結(jié)果進(jìn)行比對，以此明確菌株的分類地位及相關(guān)特性；此菌株鑒定為Aspergillussp.（GenBankaccession numberPQ795835），并利用MEGA（Version7.0）繪制菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。

1.3菌株發(fā)酵和提取

實驗使用培養(yǎng)基包括：

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200g ，葡萄糖 20g ，瓊脂20g ，無菌海水 1L ， pH6.0～6.5 。

真菌2號培養(yǎng)基：麥芽糖 20g ，味精 10g KH₂PO₄0.5g ， MgSO₄?7H₂O 0.3g ，葡萄糖 10g ，酵母浸膏 3g ，玉米漿 1g ，甘露醇 20g ，無菌海水1L，pH6.5 。

從斜面保存的試管中挑取菌株，將其接種至裝有PDA平板培養(yǎng)基的培養(yǎng)血內(nèi)，隨后放置于 28°C 的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培育，待菌種生長狀態(tài)穩(wěn)定，接種于5瓶500mL 錐形瓶中，每瓶裝有真菌2號培養(yǎng)基 150mL 。將其置于 的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，以 180r/min 的轉(zhuǎn)速持續(xù)培養(yǎng) 48h ，以此獲得發(fā)酵種子液。無菌吸管吸取種子液接入1L錐形瓶中（3mL/瓶），每瓶裝有滅菌大米 80g ，海水 120mL ；室溫培養(yǎng) 30d ，發(fā)酵規(guī)模為80瓶。

發(fā)酵完成后，用乙酸乙酯對發(fā)酵物浸提3次，過濾和減壓濃縮后得到40.69g粗提物。

1.4代謝產(chǎn)物分離

首先對乙酸乙酯提取的浸膏采用石油醚、 90% 甲醇-水體系萃取去油，得到 90% 甲醇-水層萃取物30.84g ，石油醚層萃取物 9.85g （Fr.10）。對 90% 甲醇-水層萃取物進(jìn)行減壓硅膠柱分離，采用石油醚：乙酸乙酯（1：0、10：1、8：1、6：1、4：1、2：1、1：1、1：2、0：1，V/V）梯度洗脫，每個梯度分3次收集，每次 800mL ，得到Fr1.1＼～Fr.9.3共27個組分。薄層層析（TLC）及HPLC-UV的25min 指紋圖譜分析合樣得到6個組分（Fr.11＼～Fr.16）。

取組分Fr.10（ 9.85g） ，使其通過反相ODS色譜柱，隨后按照 40% 、 60% 、 70% 、 80% 、 90% 和100% 。甲醇-水的濃度順序進(jìn)行梯度洗脫操作。針對每一個洗脫梯度，均進(jìn)行3次收集，每次收集的洗脫液體積設(shè)定為 300mL 。得到Fr.10.1.1＼～Fr.10.6.3共18個組分。Fr.10.4.3（ 34mg 經(jīng) 80% 甲醇-水HPLC半制備液相得到Fr. 10.4.3.1～ Fr.10.4.3.4共4個組分。經(jīng)鑒定Fr.10.4.3.3為化合物1（ （2.9mg ， t_R=16.2min） 。

取組分Fr.12 （2.14g） ，使其通過反相ODS色譜柱，隨后按照 30% 、 50% 、 70% 、 80% 、 90% 和 100% 甲醇-水的濃度順序進(jìn)行梯度洗脫操作。針對每一個洗脫梯度，均進(jìn)行3次收集，每次收集的洗脫液體積設(shè)定為 150mL 。得到Fr.12.1.1＼～Fr.12.6.3共18個組分。Fr.12.5.20 36.4mg） 經(jīng) 90% 甲醇-水HPLC半制備液相得到化合物2 9.8mg t_R=22.3min 、化合物3（6.9mg， t_R=26.6min 和化合物4（ 5.9mg ， t_R=28.1min ）。Fr.12.5.3（ 177.5mg ）經(jīng) 85% 甲醇-水HPLC大制備液相得到化合物6（ 7.7mg t_R=29.4min） ，以及Fr.12.5.3.10（ 12.4mg ，經(jīng) 80% 甲醇-水HPLC半制備液相得到化合物5（4.8mg， t_R=36.2min） 。

取組分Fr.14（ 1.7g） ，使其通過反相ODS色譜柱，隨后按照 20% 、 30% 、 40% 、 50% 、 60% 、70% 、 80% 、 90% 和 100% 甲醇-水的濃度順序進(jìn)行梯度洗脫操作。針對每一個洗脫梯度，均進(jìn)行3次收集，每次收集的洗脫液體積設(shè)定為 80mL 。得到Fr.14.1.1＼～Fr.14.9.3共27個組分。Fr.14.5.3（ 18.3mg 經(jīng) 55% 甲醇-水HPLC半制備液相得到得到Fr.14.5.3.1＼～Fr.14.5.3.3共3個組分。經(jīng)鑒定Fr.14.5.3.3為化合物7 11.4mg t_R=26.2min ）。Fr.14.5.1（ 19.8mg 經(jīng) 50% 甲醇-水HPLC半制備液相得到得到化合物8（ 14.3mg t_R=

31.3min） 。Fr.14.4.3（ 177.5mg 經(jīng) 45% 甲醇-水HPLC半制備液相得到化合物9（ 5.9mg t_R=31.1min ）、化合物10（3 mg， t_R=35.4min 和化合物11（12.9mg， t_R=36.2min） 。

1.5DPPH法抗氧化活性測試

1.5.1 初篩

配制DPPH溶液：準(zhǔn)確稱取 29.57mg DPPH，加入5mL 甲醇，得到1.5mmol/L的DPPH溶液，避光保存。

配制陽性藥vitaminC（VC）溶液：準(zhǔn)確稱取36.20mgVC ，加入 10mL 甲醇，得到2mmol/L的VC溶液，避光保存。

將樣品用甲醇溶解為20mmol/L。

（1）取DPPH溶液，稀釋10倍；VC溶液稀釋100 倍，樣品溶液稀釋1000倍。

（2）選用96孔板，設(shè)置3個平行。VC對照：VCaql60μL+ 甲醇 40μL ；VC+DPPH： VCaq160 μL+DPPHaq40μL ；樣品對照：樣品aq 160μL⁺ 甲醇 40μL 樣品 + DPPH：樣品a 1160μL+DPPHaq40μL ；陰性對照：甲醇 160μL+DPPHaq40μL ；空白： 200μL 甲醇；避光反應(yīng) 30min ，選用 517nm 測定其吸光度。

（③）清除率計算：

計算前數(shù)據(jù)須先扣除空白，取平均值。

1.5.2化合物抗氧化活性 IC₅₀ 的測定

選用96孔板，將化合物和VC配置成50、40、30、20、10、5、2.5、1.25和 10.625μmol/L 。加藥結(jié)束后，避光反應(yīng) 30min ，選用 517nm 測定其吸光度，計算其清除率后使用IBM SPSS Statistics 27計算其 IC₅₀ 。

2 結(jié)果與討論

2.1化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：為黃色油狀物。根據(jù)ESIMS在235處給出的 [M+H]⁺ 分子離子峰，結(jié)合其 ¹H 及 ¹³C NMR數(shù)據(jù)，推斷其分子式為 C₁₄H₁₈O₃ 。它的 ¹H 及 ¹³C NMR譜圖結(jié)合HSQC數(shù)據(jù)給出1個酯炭基 （δ_c=166.6） 、1個對位取代的苯環(huán) $＼mathscr { ＼left（ ＼delta _ { ＼mathrm { { c / H } } } = 1 2 2 . 9 ＼right. }$ ，131.7/7.98，114.4/6.92，162.7）、2個雙鍵碳包括1個季碳 （δ_c=139.0） 和1個次甲基 （δ_c=119.2/5.48） 、2個含氧亞甲基 （δ_C/H=65.1/4.56 60.8/4.34） 和3個甲基信號 （δ_C/H=26.0/1.80 ， 18.4/1.75 ，14.5/1.37）。這些數(shù)據(jù)與已知化合物乙基-（S）-4-（2，3-二羥基-3-甲基丁氧基）苯甲酸酯（10）[18]的核磁數(shù)據(jù)非常相似，區(qū)別僅是化合物10中的二羥基異戊烯基取代基在化合物2中被異戊烯基取代了。這被H，-1'/H-2'的COSY相關(guān)、 H₃ -4'和 H₃ -5'與C-3'和C-2'的HMBC相關(guān)及 H₂ -1'與C-4的HMBC相關(guān)進(jìn)一步確證（圖3）。通過仔細(xì)分析HMBC及COSY信號（圖3），化合物1的其他部分被確定為與10一致。因此，化合物1被確定為乙基-4-[（3-甲基-2-丁烯-1-基）氧基]苯甲酸酯。化合物1作為合成產(chǎn)物已經(jīng)被報道，但未見其核磁數(shù)據(jù)報道。因此，化合物1為新天然產(chǎn)物，其核磁數(shù)據(jù)（表1）為首次報道。

化合物2：黃綠色粉末狀物，分子式為 C₁₉H₂₄O₃ ，HRESIMS m/z301.3[M+H]⁺ 。 ¹H NMR 400MHz CD₃OD ）δ： 10.21 （1H， s，H-14），6.94 （1H，s， H-4）， 5.96 （2H，overlap，H-10，11）， 5.54 （2H，overlap， H-9，12），5.26 （1H，m，H-16），3.23 （2H， d， J=7.4Hz 0 H-15），2.98 （2H，m，H-7），2.29 （2H，q， J=7.0Hz P

H-8），1.74（3H，s，H-19），1.69（6H，overlap，H-13， 18）； ¹³C NMR （ 100MHz ， CD₃OD ）δ：197.6 （C-14）， 155.4 （C-6），148.1 （C-3），134.1 （C-9），132.8 （C-17）， 132.7 （C-5）， 131.2 （C-2）， 129.3 （C-11）， 129.1 （C-10）， 128.1 （C-12）， 126.5 （C-16）， 122.9 （C-1）， 118.8 （C-4）， 35.3 （C-8）， 27.9 （C-15）， 25.9 （C-7）， 24.6 （C-19）， 18.1 （C-18），17.8（C-13）。經(jīng)過對比分析發(fā)現(xiàn)，上述所獲 取的數(shù)據(jù)和已有文獻(xiàn)報道中關(guān)于2-（E，E-3，5-庚二烯 基）-3，6-二羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基）的相關(guān)數(shù)據(jù)大體相 符。基于這一結(jié)果，可將化合物2鑒定為2-（E，E-3，5- 庚二烯基）-3，6-二羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基）苯甲醛[10]。

化合物3：黃色針狀晶體，分子式為 C₁₉H₂₆O₃ HRESIMS m/z303.3[M+H]⁺ 。 ¹H NMR 400MHz CDOD） δ： 10.23 （1H， t， J=1.3Hz ，H-14），6.94 （1H， s， H-4），5.41 （2H，overlap，H-9，10），5.28 （1H，m，H-16）， 3.24 （2H， d， J=7，6Hz ，H-15），2.98 （2H， t， J=7.5Hz， H-7），2.25 （2H， q， J=7.3Hz ，H-8），1.92 （2H，q， J=6.8 Hz，H-11），1.74（3H，brs，H-19），1.70（3H，brs，H-18）， 1.32 （2H，m，H-12），0.84 （3H，t， J=7.4Hz H-13）； ¹³C NMR 100MHz ，CDOD） δ： 197.8 （C-14），155.4 （C6），148.2 （C-3），134.0 （C-17），132.7 （C-10）， 130.3 （C-2）， 129.5 （C-9）， 129.0 （C-5）， 126.4 （C-4）， 123.0 （C-16）， 118.9 （C-1）， 35.7 （C-11）， 35.3 （C-8）， 28.0 （C-15）， 25.9 （C-19）， 24.7 （C-7）， 23.6 （C-12），17.8 （C-18）， 14.0 （C-13）。以上 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的2-（E-3-庚烯基）-5-異戊烯基-3，6二 羥基苯甲醛基本一致，因此化合物3鑒定為2-（E-3-庚 烯基）-5-異戊烯基-3，6-二羥基苯甲醛[11]。

化合物4：白色粉末狀物，分子式為C，H26O3 HRESIMS m/z303.3[M+H]⁺ 。 ¹H NMR 400MHz 0 CDOD） δ： 10.25 （1H， s，H-14）， 6.94（1H， s，H-4）， 5.41 （2H， overlap，H-11，16）， 5.28（1H，m，H-12），3.24 （2H， d， J=7，5Hz H-15），2.91（2H，t， J=7.7Hz H-7），2.01 （2H， m，H-10），1.75（3H，s，H-19），1.70（3H，s，H-18），1.62 （3H， dd， J=3.5 ，1.3Hz，H-13），1.54（2H，m，H-8），1.44 （2H， m， H-9）; ¹³C NMR 100MHz ，CD ³ OD） δ： 197.6 （C-14），155.6 （C-6）， 148.1 （C-3）， 134.1 （C-17），132.4 （C-11），130.4 （C-5），128.9 （C-2）， 126.5 （C-4）， 126.0 （C12），122.9 （C-16）， 118.8 （C-1）， 33.4 （C-10）， 32.5 （C

8），30.5 （C-9），27.9 （C-15），25.9 （C-19），24.3 （C-7），18.1（C-13），17.8（C-18）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的isotetrahydroauroglaucin基本一致，因此化合物4鑒定為isotetrahydroauroglaucin[12]。

化合物5：淡黃色粉末狀物，分子式為 C₁₉H₂₄O₃; （2 HRESIMS m/z301.1[M+H]⁺ 。 ¹H NMR（ 400MHz CDOD） δ： 10.08 （1H， s，H-14），6.94 （1H， s，H-4）， 6.72 （1H， d， J=15.2 Hz，H-7），6.42 （1H， dd， J=15.4 ，10.4Hz， H-8）， 5.86 （1H， dt， J=14.6 ， 7.0Hz H-10），5.29（1H，m H-16），5.28（2H，m，H-12），3.27（2H，d， J=7，5Hz ，H-15）， 2.14 （2H，q，J=7.0 Hz，H-11），1.75 （3H， s，H-19），1.71 （3H，s，H-18），1.44（1H，dd，J=15.0，10.7，H-9），0.95 （3H， t，J=7.4 Hz， H-13）； ¹³C NMR （ 100MHz ， CD₃OD δ： 198.0 （C-14），155.3 （C-6），148.5 （C-3），140.0 （C8），137.7 （C-10），134.4 （C-17），132.2 （C-9）， 130.1（C5），126.9 （C-4）， 125.9 （C-2）， 122.7 （C-7）， 122.4 （C-16）， 118.6 （C-1）， 36.0（C-11）， 28.1 （C-15）， 25.9 （C-19）， 23.5 （C-12），17.8（C-18），14.1（C-13）。綜合比對各項數(shù)據(jù) 可知，其與文獻(xiàn)中所記載的2-（ E_i E-1，3-庚二烯基）- 3，6-二羥基-5-（3-甲基-2-丁烯基）苯甲醛的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出 高度的吻合性。鑒于此，有充分的依據(jù)將化合物5判 定為2-（E，E-1，3-庚二烯基）-3，6-二羥基-5-（3-甲基-2-丁 烯基）苯甲醛[13]。

化合物6：淡黃色晶體，分子式為C，H28O， HRESIMS m/z305.1[M+H]⁺ 。 ¹H NMR （400MHz CDOD） δ：10.27 （1H， s，H-14），6.94 （1H， s，H-4）， 5.29（1H，brt， J=7.3Hz ，H-16），3.25（2H，d， J=7，5Hz H-15）， 2.92 （2H， dd， J=9.1 ， 6.9Hz， H-7），1.75 （3H， s， H-19），1.70 （3H，s，H-18），1.54（2H，m，H-8），1.33（4H， overlap，H-9，10，11，12），0.90 （3H，t，J=6.8Hz，H-13）; ¹³C NMR （ 100MHz ，CDOD） δ： 197.6 （C-14）， 155.5 （C-6）， 148.1 （C-3）， 134.1 （C-17）， 130.5 （C-5）， 128.8 （C2），126.5 （C-4）， 122.9 （C-16）， 118.8 （C-1）， 33.1 （C-11）， 30.6 （C-10）， 30.3 （C-9）， 30.0 （C-8）， 27.9 （C-15）， 25.9 （C-19），24.5 （C-7）， 23.7 （C-12）， 17.8 （C-18）， 14.4 （C13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的methyllinoleate基本一 致，因此化合物6鑒定為methyllinoleate[14]。

化合物7：黃色粉末狀物，分子式為C16H0O，

HRESIMS m/z 293.1 [M+H]⁺ 。 ¹H NMR （400MHz， （20 CD₃OD ）δ：6.22（1H，d， J=2.3Hz， ，H-5），6.20 （1H，d， J=2.2Hz ，H-7），4.14 （1H，m，H-2），3.92 （1H，m，H-6）， 2.91 （2H，m，H-4），1.82-1.61 （4H， overlap，H-3'，4'），1.34 （2H， m，H-5），1.18 （3H，d， J=6.4Hz ，H-7）； ¹³C NMR 1 （100MHz， CDOD） δ： 171.5 （C-1）， 166.3 （C-6）， 165.6 （C-8），143.6 （C-4a），107.9 （C-5）， 102.2 （C-7），101.6 （C8a）， 77.8 （C-3）， 68.4 （C-2'）， 68.3 （C-6）， 34.4 （C-4）， 32.7 （C-3），31.5（C-5），20.0（C-7），19.3（C-4'）。以上數(shù)據(jù) 與文獻(xiàn)報道的asperentin基本一致，因此化合物7鑒定 為asperentin[15]。

化合物8：白色粉末狀物，分子式為 C₁₇H₁₈O₄， HRESIMSm/z 310.1 [M+Na]+。 ¹H NMR 400MHz 0 CDOD） δ： 7.27＼～7.15 （3H，overlap，H-6， 7， 8）， 7.13 （2H， d， J=6.6Hz ，H-5，9），7.03 （2H， d， J=8.5 ，H-4'， 8）， 6.72 （2H， d， J=8.5 ，H-5'，7），4.32 （1H，dd， J=7.5 ， 5.1Hz， （2 H-2），4.22 （2H，t， J=6.9 ，H-1），2.97（1，d， J=13.8 ，7.5 Hz， H-3），2.86 （1H， dd， J=13.8 ， 7.5Hz ，H-3）， 2.79 （2H， t， J=6.9 ，H-2'）； ¹³C NMR （ 100MHz ， CD₃OD 8：175.3 （C-1），157.1 （C-6），138.4 （C-4），130.5（C-5， 9），129.9 （C-3'）， 129.3 （C-6， 8）， 127.6 （C-7）， 131.0 （C-4'， 8'）， 116.3 （C-5'， 7）， 73.0 （C-2）， 67.0 （C-1）， 41.6 （C-3）， 35.1 （C-2'）。以上數(shù)據(jù)及比旋光度 [α]₂₅^D=+216.5 1 （c 0.875 CHC1）與文獻(xiàn)報道的（2R）-2-（4-羥基苯基）乙基-2-羥 基-3-苯丙酸酯基本一致，因此化合物8鑒定為（2R）-2- （4-羥基苯基）乙基-2-羥基-3-苯丙酸酯[6]。

化合物9：無色油狀物，分子式為C，H1O4， HRESIMS m/z273.3[M+Na]⁺ 。 ¹H NMR （400MHz. CDOD） δ： 7.02 （2H， d， J=8.5Hz ，H-2，6），6.79 （2H， d， J=8.5Hz ，H-13，17），6.71 （2H，d， J=8.5Hz ，H-14，16）， 6.68 （2H， d， J=8.5Hz ，H-3，5），4.21（2H，t， J=6.9Hz. H-8）， 3，48 （2H， s， H-11）， 2.79 （2H， t， J=6.8Hz ，H-7）； ¹³C NMR （ 100MHz CD₃OD ） δ： 174.1 （C-10），157.5 （C15）， 157.0 （C-4）， 130.9 （C-2， 6）， 131.3 （C-13，17）， 130.0 （C1），126.4 （C-12）， 116.3 （C-3， 5）， 116.2 （C-14， 16）， 66.9 （C8），41.3 （C-11），35.2（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的2-（4- 羥基苯基）乙酸4-羥基苯乙酯基本一致，因此化合物9 鑒定為2-（4-羥基苯基）乙酸4-羥基苯乙酯[1]。

化合物10：白色粉末狀物，分子式為 C₁₄H₂₀O₅ HRESIMS m/z 291.1 [M+Na]⁺ 。 ¹H NMR （ 400MHz CD₃OD δ：7.96 （2H，d， J=8.9Hz ，H-2，6），7.03 （2H， d， J=9.0Hz ，H-3，5），4.36-4.28（3H，overlap，H-1'a， 1\"）， 3.99 （1H， dd J=10.0 8.1Hz ，H-1'b），3.75（1H， dd， J=8.1 ， 2.6Hz ，H-2），1.37（3H，t， J=7.1Hz ，H-2\"），1.27 （3H，s，H-4'），1.24 （3H， s，H-5'）； ¹³C NMR （ 100MHz CDOD） δ： 168.0 （C-7）， 164.6 （C-4）， 132.5 （C-2，6）， 123.8 （C-1）， 115.4（C-3， 5）， 77.5 （C-2）， 72.7 （C-3）， 70.8 （C-1），61.9 （C-1\"）， 26.9 （C-4'），24.8 （C-5），14.7 （C2\"）。通過細(xì)致對比分析可以發(fā)現(xiàn)，上述所涉及的數(shù) 據(jù)和文獻(xiàn)中報道的4-（2，3-二羥基-3-甲基丁氧基）苯甲 酸乙酯的數(shù)據(jù)近乎一致。基于這樣的對比，能夠合 理地將化合物10鑒定為4-（2，3-二羥基-3-甲基丁氧基） 苯甲酸乙酯[18]。

化合物11：灰白色粉末狀物，分子式為C2H0O HRESIMS 。 ¹H NMR （ （400MHz P CD₃OD ） δ ： 5.97 （1H， t， J=2.0Hz ，H-14），5.85 （1H，dd， J=17.5 0 10.6Hz ，H-15），5.04 （1H，dd， J=17.5 ， 1.1Hz 0 H-16a）， 4.69 （1H， dd， J=10.6 ，1.1Hz，H-16b）， 4.62（1H， d， J=2.2Hz ，H-7），3.90 （2H，overlap，H-11，20a），3.33 （1H， d， J=6.8 ，H-20b），1.92（1H，m，H-12a），1.78（1H， t，J=12.4，H-1a），1.69（2H，overlap，H-1b，3a），1.56 （2H，m，H-2），1.38（3H，s，H-19），1.18（3H，s，H-18）， 1.15 （3H， s，H-17），1.07 （1H，m，H-3b）； ¹³C NMR（100 MHz， CDOD） δ： 148.6 （C-15）， 137.7 （C-8）， 133.4 （C14）， 111.4 （C-16）， 107.9 （C-6）， 82.1 （C-5）， 79.1 （C-9）， 73.2 （C-7），69.0 （C-20）， 67.6 （C-11）， 51.1 （C-10）， 41.2 （C-12）， 39.4 （C-13）， 39.1 （C-3）， 39.1 （C-4）， 28.9 （C-18）， 25.8 （C-17）， 25.3 （C-1）， 25.0 （C-19），19.3 （C-2）。以上 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的diaportheinsA基本一致，因此化 合物11鑒定為diaportheinsA[19]。

2.2抗氧化活性測試結(jié)果

用DPPH法測試了化合物1＼～11在 時的清除率，結(jié)果表明：化合物2＼～6的清除率分別為 85% 、66% 、 46% 、 25% 和 94% ；VC的清除率為 97% 。

對化合物2＼～6和VC進(jìn)行了清除DPPH自由基的IC₅₀ 的測定，得到其 IC₅₀ 如表2。

3結(jié)論

本實驗對1株北部灣刺螺來源曲霉菌MDKFD-13進(jìn)行研究，大米培養(yǎng)基發(fā)酵后分離得到1個新天然產(chǎn)物（化合物1）和10個已知化合物，共11個化合物（1＼～11）。在前人的研究中化合物6、9具有良好的細(xì)胞毒活性[15.18]，化合物4具有一定的抗炎活性[14]，化合物7對萵苣和水稻幼苗根系生長具有抑制作用[17]，化合物8具有廣泛的抗菌性[19]。通過閱讀文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)化合物3及其類似結(jié)構(gòu)的化合物大部分具有抗氧化活性，在黃玉玲等[13]的研究中化合物3清除DPPH自由基的IC 50 為 ，在她的研究中VC清除DPPH自由基的 IC₅₀ 為 21μmol/L 。由于我們分離到的化合物大部分跟化合物3有類似結(jié)構(gòu)，因此我們測定了化合物1＼～11在 時清除DPPH自由基的抑制率，選取抑制率較高的化合物2＼～6測定其清除DPPH自由基的 IC₅₀ ，其中化合物5和6的IC 50 優(yōu)于陽性藥（VC），具有較好的抗氧化活性。

參考文獻(xiàn)

[1] SubramaniR，SipkemaD.Marinerareactinomycetes：A promising source of structurally diverse and unique novel natural products[J].MarDrugs，2019，17（5）：249.

[2] WuY，ZhangH，AnF，et al.Research progressonsecondary metabolitesofAspergillusversicolorfromdifferent habitats[J].NatProdRes，2023，35（2）：342-352.

[3] CaiSY，HeJL，BaiKK，et al.Secondary metabolitesof deepsea fungi and their biological activities：Research advances[J]. JIntPharmRes，2020，47（12）：1033-1406.

[4] YinQ，LiuX，ZhangZ，etal.Chemistryand bioactivitiesof alkaloidsisolated from marine fungi （covering 2016-2022） [J].Fitoterapia，2022，164（11）：105377.

[5] 張尊聽，賀云，劉謙光，等.分光光度法測定太白山20種中 草藥的抗氧化活性[J].分析試驗室，2002，21（2）：50-53.

[6] Halliwell B.Antioxidant characterization：Methodology andmechanism[J].BiochemPharmacol，1995，49：1341-1348.

[7] 王會，郭立，謝文磊.抗氧化劑抗氧化活性的測定方法（一） [J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（3）：92-98.

[8] 趙艷紅，李建科，李國秀.天然抗氧化物體外活性評價方 法的優(yōu)選與優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2008，29（6）：64-69.

[9] Lauer，WalterM，Moe，etal.TheRearrangementof Phenyl AllylEthers.VIII.Ethyl p-（γ，γ-Dimethylallyloxy）- benzoate1[J].JAm ChemSoc，1943，65（2）：289-293.

[10]劉培培，王文良，顧謙群，等.耐鹽真菌Aspergillus variecolorB-17產(chǎn)生的烴基苯甲醛衍生物及其細(xì)胞毒活 性[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報，2008，38（4）：585-589.

[11] 黃玉玲，馬麗英，榮先國，等.海洋真菌Aspergillus sp.中的 苯甲醛衍生物研究[J].中草藥，2012，43（5）：837-840.

[12] Zhou W Y，Chen HL，Liu Y H， et al. Structurally various secondarymetabolitesfromFusariumsp.SCsIOo6196 andtheirbiologicalevaluation[J].ChemNatCompd，2023 59（6）：612-615.

[13]孫坤來，王又，付鵬，等.滸苔共生真菌HT-2次生代謝產(chǎn)物 的研究[J].中國海洋藥物，2013，32（1）：37-45.

[14]王發(fā)左，黃智，史雪鳳，等．南海沉積環(huán)境來源真菌 Eurotiumsp.SCSIOF452的次生代謝產(chǎn)物研究[J].中國海 洋藥物，2013，32（1）： 7-12.

[15]Kimura Y， Shimomura N，Tanigawa F，et al.Plant growth activitiesofaspyran，asperentin，and itsanaloguesproduced bythefungusAspergillussp[J].ZNaturforsch CJBiosci， 2012，67（11-12）：587-593.

[16]ThuyNTT，HienHTM，HaNC，etal.Chemical constituents from the heterotrophic marine microalgae Aurantiochytrium sp.SC145 and their antimicrobial activities[J].NatProdRes，2024，38（5）：789-795.

[17] Wang YN， Tian L，Hua HM， et al. Two new compounds fromthe broth of themarine fungus Penicillium griseofulvum Y19-07[J].JAsianNatProdRes，2009， 11（11）： 912-917.

[18]ChenGG，ZhuQF，LongXM，et al.Antibacterial activities ofthe chemical constituents of Schizophyllum commune MST7-3 collected from coalarea[J].NatProd Res，2022， 36（18）：4651-4660.

[19]Dettrakul S，KittakoopP，Isaka M， et al.Antimycobacterial pimarane diterpenes from the fungusDiaporthesp.[J]. BioorgMedChemLett，2023，13（7）：1253-1255.