Pseudogymnoascussp.OUCMDZ-4032生物合成基因簇分析及遺傳體系的構建

Analysis of the biosynthetic gene cluster and establishment of the genetic system of Pseudogymnnosus sp. OUCMDZ-4032

An Chengze1.2.3，Du Rongtian1.2.3， Wang Weiyun1.2.3，and Wang Yi^1，2，3 （1SchoolofMedicineandPharmacyOceanUniversityofChinaQingdao266o3;2LaboratoryforMarineDrugsandBioproducts， Qingdao Marine Science and Technology Center， Qingdao 266237; 3 Key Laboratory of Marine Drugs， Ministry ofEducation，Qingdao 266003）

Abstract Objective To analyze the secondary metabolite biosynthetic gene clusters of the psychrophilic fungus Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032 fromAntarctica，and establish the genetic transformation systemof this strain，layinga foundation foractivatingthe silent geneclusters in strains.MethodsThe biosynthetic geneclusters were analyzed via the antiSMASH website.High-quality protoplasts were prepared through antibiotic resistance test and the optimization of mycelium growth medium and enzymatic hydrolysis time. Based on the principle of protoplasts sweling upon water absorption，the protoplasts were detected and the regeneration rate was calculated.

The transformation system was validated by introducing the hph and neo drug-resistant fragments.ResultsIt was predicted that there were 50 secondary metabolite biosynthetic gene clusters in the genome of OUCMDZ-4032，among which 36 were orphan gene clusters.The strain was inhibited under the resistance concentrations of 300μg/mL G418 and 100μg/mL hygromycin B. Using PDB or SDYS as the mycelium growth medium， mixed enzymatic hydrolysis for 2h ，the protoplasts reached a maximum value of 6.1×10⁶ protoplasts /mL ，with a regeneration rate of 47%±3% 主 Through PEG-mediated transformation，resistant plasmids were introduced into the protoplasts.Tenrandomlyselected transformants showed a 90% positive rate. Conclusion In the study， the secondary metabolite biosynthetic gene clusters of Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032 were analyzed，and a sophisticated genetic transformation system was established.This was conducive to studying the biosynthesis of the secondary metabolites of the strain and also provided a fundamental basis for the molecular biology research of psychrophilic microorganisms.

Key wordsAntarctic fungi; Biosynthetic gene clusters; Genetic transformation

南極長期暴露在惡劣的極端條件下，如低溫、強烈紫外線輻射、頻繁的凍融循環、周期性變化的光照時間、高度變化的光照強度、營養物質匱乏和高壓等[1-2]。因此極地微生物的次級代謝產物往往具有一些特殊的活性。極地微生物資源的開發與應用越來越受到國內外研究者的重視。Pseudogymnoascus屬假裸囊屬嗜冷真菌，常分布于南極土壤中[3-4]。跟據文獻報道已從該屬中分離得到50多個新化合物，包括聚酮、多肽、倍半萜等。這些化合物除具有抗真菌和抗癌等常見活性外，還具有抑制乙酰膽堿受體活性和促進血管生成[5-9]。

利用分子手段對Pseudogymnoascus屬真菌進行遺傳改造，研究基因的表達和調控，有助于闡釋其次級代謝產物的生物合成路徑。建立有效穩定的遺傳操作體系是其中必不可少的關鍵步驟。目前，常見的絲狀真菌遺傳轉化方式有：電轉化法、農桿菌介導轉化法[10]和原生質體介導轉化法[1]。電轉化法需要的電轉儀較貴，而且常用于酵母菌和大腸埃希菌中；農桿菌轉化則步驟較多、費時費力；而原生質體介導轉化法方便快捷，多用于絲狀真菌中。目前還沒有一種通用的原生質體介導轉化法適用于所有真菌中，所以需要對原生質體介導轉化法進行條件摸索。

本研究為了進一步挖掘該屬產生次級代謝產物的能力，對其全基因組進行測序，采用antiSMASH生物合成基因簇在線分析網站對其次級代謝潛力進行預測分析。同時，構建了Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032的遺傳體系，為研究次級代謝產物的生物合成路徑打下良好基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株、質粒與引物

Pseudogymnoascussp.OUCMDZ-4032從南極洲土壤樣品中分離得到。保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），保藏編號：CGMCCNo21946。菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）上常規培養， 16^°C 條件下生長。

本實驗采用的耐藥基因為pUC-19T-neo質粒攜帶的新霉素磷酸轉移酶（neo）和pUC-19T-hph質粒攜帶的潮霉素B磷酸轉移酶 （hph） 基因。兩個質粒分別在通用型克隆載體pUC19Vector的EcoRV酶切位點上連接neo和hph基因，保存在本實驗室 .80^°C 冰箱。

引物合成委托北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司，序列如表1所示。

1.1.2培養基

PDA培養基：馬鈴薯 200g ，葡萄糖 20g ，瓊脂20g ，無菌海水1L， pH6.0～6.5 。

PDB培養基：馬鈴薯 200g ，葡萄糖 20g ，無菌海水1L， pH6.0～6.5 。

SDYS培養基：蛋白陳 10g ，酵母浸膏 10g ，NaC1 1g ， KH₂PO₄0.3g ， MgSO₄^?7H，O0.1g ，自來水1L。

CM培養基：6g酵母浸粉，6g酪蛋白水解物，10g 蔗糖，自來水1L。

1.1.3 試劑與溶液配置

TF1：50 mmol/L馬來酸， 0.6mol/L（NH₄）₂SO₄ pH 7.5。STC：1mol/L山梨醇， 10mmol/L Tris， 50mmolL CaCl₂ ，pH7.5。PEG 6000轉化液： 40% PEG 6000，50 mmol/LTris， 50mmol/LCaCl₂?2H₂O

真菌基因組提取試劑盒OMEGAFungalDNAKit購于OMEGA。真菌裂解液MightyPrepreagentforDNA（CodeNo.9182）和高保真PCR酶PrimeSTARHS（Premix）購于TaKaRa。

1.2方法

1.2.1 生物信息學分析

（1）菌株鑒定通過ITS基因序列分析鑒定菌株OUCMDZ-4032。用無菌牙簽挑取新鮮菌絲樣品于100μL 的MightyPrep reagent forDNA中， 95°C 金屬浴加熱 10min ，提取其基因組DNA作為模板DNA。將提取的DNA樣品通過真菌菌種鑒定引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。然后將PCR產物提交測序，測序結果與NCBI核酸數據庫進行比對。

（2）基因組測序及次級代謝產物合成基因簇預測分析將菌株接種于真菌2號培養基， ！180r/min 培養5d，取 10mL 菌液， 5000r/min 離心5min ，收集菌體沉淀，將沉淀立即液氮速凍，.80^°C 保存。三天之內將菌絲體委托至北京擎科生物科技股份有限公司青島分公司進行真菌基因組框架圖測序。利用antiSMASH（https：//fungismash.secondarymetabolites.org）軟件對菌株中的次級代謝產物生物合成基因簇進行分析。

1.2.2 遺傳體系的構建

（1）菌株抗生素耐藥實驗 確定菌株對潮霉素B、遺傳霉素和草銨麟的敏感性。將新鮮菌絲體劃線接種于梯度的潮霉素B（0、10、25、50、100、150和 200μg/mL ）、遺傳霉素（0、5、10、15、20、50、100、150、200、250和 300μg/mL 和草銨麟（0、300、500、800、1000、1200、1500和 2000μg/mL 的PDA培養基上。 16°C 下倒置培養，定期觀察菌落生長情況，每次做3個平行。

（2）菌絲的培養取新鮮菌株平板，在培養基表面加入 8～10mL 無菌水，用無菌棉簽或涂抹器輕輕刮拭孢子，使其懸浮在無菌水中。通過無紡布茶葉袋過濾，將孢子溶液收集在 50mL 離心管中。用無菌水將孢子懸浮液調整為 10⁷～10⁸ 個孢子 ΔmL 。分別取5mL 孢子懸液加入到 150mL 的PDB、CM、SDYS3種培養基中， 16^°C 、 180r/min 搖床培養，每隔3h鏡檢一次，直到菌絲體長度為孢子的2到3倍為宜。

（3）原生質體的制備將上述菌液倒入 50mL 無菌離心管中， 6500r/min 離心 10min ，收集菌絲體。每 0.2g 菌絲體用 20mL TF1溶液洗滌， 6500r/min 離心 10min ，丟棄上清，重復操作1次，加入 2mL 混合酶液 0.5% Yatalase、 0.5% Lysing Enzymes fromTrichodermaharzianum）。將酶混合物置于恒溫搖床中， 30° 、 ，每隔 30min 顯微鏡下觀察酶解情況。將酶解完全的混合物 5000r/min 離心10min ，收集原生質體。原生質體用STC溶液洗滌離心2次，再用STC重懸至 10⁸ 個/mL。將原生質體每100μL 分裝于含有 1% DMSO（細胞培養級）的無菌EP管中，保存于 -80°C 的冰箱中。

（4）原生質體的檢測與再生取上述制備的原生質體兩份，一份直接用血球計數板檢測，另一份加入 900μL 無菌水冰浴 30min ，同樣進行顯微鏡檢查。將制備好的原生質體稀釋至 10² 個 /mL ，每 500μL 分別均勻涂布在高滲透壓PDA固體板和普通平板上，16°C 培養 15d 。 500μL 的原生質體數計為c，在高滲平板上長出的菌落數計為a，在普通平板上長出的菌落數計為b，原生質體再生率為d，每次做三個平行。計算公式： d=（a-b）÷c×100%. 0

（5）PEG介導的轉化與驗證使用HindII限制性內切酶分別對pUC-19T-neo和pUC-19T-hph質粒進行單酶切線性化處理，取 100μL 原生質體加入 1μg 線性化的質粒和 25μL 40% PEG6000緩沖液，冰浴15min 。然后加入 1mL 40% PEG緩沖液， 16^°C 靜置15min 。取上述混合物 300μL 涂布于適宜濃度的抗性板上。利用抗性驗證引物對10d后長出的單菌落進行PCR驗證，篩選抗性導入突變株。

2結果與分析

2.1Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032的菌株鑒定

Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032在PDA平板上生長 15d 。菌落形態如圖1所示，菌落呈明顯的白色，周圍有大量白色的分生孢子（圖1a），背面呈淡黃色（圖1b）。經ITSrDNA序列測定和BLAST比對，菌株OUCMDZ-4032（GenBank登錄號：OK668314.1）隸屬于Pseudogymnoascus，與Pseudogymnoascussp.strainCGMCC3.20877（GenBank登錄號：ON365916.1）有 99% 同源性，并在發育樹中與其聚為一簇（圖2）。結合OUCMDZ-4032形態學特征和ITSrDNA測序結果比對，初步鑒定菌株OUCMDZ-4032為Pseudogymnoascus假裸囊屬嗜冷真菌。

2.2Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032次級代謝

產物合成基因簇預測分析

為了挖掘Pseudogymnoascus屬真菌產生次級代謝產物的潛力，對其基因組中的生物合成基因簇進行分析。經antiSMASH軟件預測，Pseudogymnoascussp.OUCMDZ-4032基因組中含有50個次級代謝產物合成基因簇（表2），分別為7個核糖體合成和翻譯后修飾多肽（ribosomally synthesized and post-translationallymodifiedpeptides，RiPP）類基因簇、18個聚酮合成酶（polyketidesynthases，PKS）類基因簇、6個萜烯（terpene）類化合物合成基因簇、13個非核糖體肽合酶（non ribosomal peptide synthase，NRPS）基因簇、5個非核糖體肽合酶和聚酮合成酶（NRPS/PKS）雜合基因簇、1個聚酮合成酶和萜類（PKS/terpene）雜合基因簇。在分析的基因簇中，相似度達到 100% 的基因簇包括編號為9、13、14、26、34和37的基因簇，它們分別對應克拉維酸（clavaricacid）、膽堿（choline）、cichorine、YWA1、克拉維酸和UNII-YC2Q1O94PT的生物合成基因簇。其中相似度較高 （60%～90%） 的基因簇，有編號為4和17的基因簇，分別為巴西烷型倍半萜類（trichobrasilenol）、地曲霉素（geodin）的生物合成基因簇。而相似度較低（小于 50% 的基因簇，包含編號為6、19、20、29、30和33的基因簇，它們分別參與shearinine D、tricholignan A、ustilaginoidin N、secalonicacids、F9775A、squalestatinS1的生物合成。其余36個基因簇則未找到與之相匹配的生物合成基因簇，占Pseudogymnoascus sp OUCMDZ-4032的總基因簇的 72% ，這預示著該菌株可能產生結構新穎、功能獨特的新化合物，這也論證了接下來構建其高效穩定的遺傳體系，利用分子手段激活其孤兒基因簇的必要性。

2.3Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032遺傳體系 的構建

2.3.1 抗生素及濃度的選擇

為了找到菌株在遺傳轉化中合適的抗性篩選標記，因此探究了該菌株對真菌常用抗生素的敏感性。結果如表3所示，在G418抗性濃度篩選試驗中發現， 0～250μg/mL 的抑菌效果不理想，7d后菌落生長正常，在 300μg/mL 濃度下，15d后菌落仍未生長。在潮霉素B抗性濃度篩選試驗中發現， 100μg/mL 潮霉素B對菌株有抑制作用。

在草銨麟抗性濃度篩選實驗中發現， 2000μg/mL 草銨麟仍不能抑制菌株的生長，且在酸性條件下不產生孢子。因此本實驗選擇neo（G418抗性基因）和hph（潮霉素B抗性基因）作為抗性基因，濃度分別為300μg/mL G418和 100μg/mL 潮霉素B。

2.3.2 孢子萌發培養基的選擇

原生質體是從菌絲中釋放出來的，因此菌絲的質量直接影響原生質體的制備。將孢子懸浮液加入到 150mL 的PDB、CM和SDYS培養基中，在 16^°C F180r/min 下培養，每3h進行一次顯微鏡檢查。孢子在CM培養基中培養24h后，顯微鏡下發現孢子長出的菌絲相互纏繞，不利于原生質體的酶解和釋放，而在PDB和SDYS培養基中培養24h后，菌絲長度分布均勻，不纏繞，有利于后續實驗的進行。

2.3.3不同酶解時間對原生質體制備的影響

本實驗選取常見的混合酶組合（ 0.5% Yatalase、0.5% LysingEnzymesfrom Trichodermaharzianum溶于TF1中）進行酶解實驗。每半小時取酶解產物進行顯微鏡檢查。如圖3所示，酶解0.5＼～2h時原生質體逐漸釋放，在2h時達到最大值 6.1×10⁶ 個 /mL ，之后則酶解時間過長導致一部分原生質體破碎。

2.3.4原生質體的檢測與再生

原生質體不受細胞壁的保護，最外層是細胞膜，因此吸收水分，在低滲透壓下破裂。如圖4所示，圖4a為采集到的密度高、質量好的原生質體，圖4b為無菌水稀釋10倍后的原生質體，可以看到原生質體已經吸水漲破，細胞變形。將制備好的原生質體稀釋至 10² 個 /mL ，每 500μL 均勻涂布在高滲PDA固體板和普通板上， 16°C 培養 15d ，再生率如表4所示為 47%±3% 。

2.3.5 轉化子鑒定

將線性化的pUC-19T-neo和pUC-19T-hph質粒通過PEG介導轉入最適條件下的Pseudogymnoascus sp.

注：（a）G418篩選平板上轉化子；（b）潮霉素B篩選平板上轉化子； （c）M為Molecular-sizemarker；+為陽性對照pUC-19T-neo；1＼～5為 G418篩選平板上轉化子；-為陰性對照WT；（d）M為Molecular-size marker; + 為陽性對照pUC-19T-hph；1＼～5為潮霉素B篩選平板上轉化 子；-為陰性對照WT。

OUCMDZ-4032原生質體中， 16°C 生長15d，抗性平板上長出的單菌落，如圖5a＼～5b所示。分別隨機挑取五個單菌落，在抗性平板上連續傳代三次，使用驗證引物進行PCR驗證，結果如圖5c＼～5d所示，在G418抗性篩選實驗中，陰性對照無條帶，轉化子1、3、4和5的條帶大小與陽性質粒pUC-19T-neo的條帶大小一致都為2718bp，同時測序結果與pUC-19T-neo質粒相應序列完全一致，再次證明G418抗性已導入原生質體中；在潮霉素B抗性篩選實驗中，陰性對照無條帶，轉化子1、2、3、4和5的條帶大小與陽性質粒pUC-19T-hph的條帶大小一致都為 2048bp ，同時測序結果與pUC-19T-hph質粒相應序列完全一致，抗性片段已導入原生質體中。以上結果表明，G418和潮霉素B抗性基因已成功整合到Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032基因組中，轉化實驗成功。

3討論

細菌和真菌的次級代謝產物是活性先導化合物的重要且豐富來源。在過去的幾十年中，基因組挖掘已經成為一種廣泛使用的方法，用于發現結構新穎的天然產物。antiSMASH是目前最廣泛使用的檢測和表征生物合成基因簇（BGCs）的工具[12-13]。它將提交的基因組信息與數據庫中已報道基因簇進行序列比對，從而預測出菌株潛在的產生次級代謝產物的能力。Pseudogymnoascussp.OUCMDZ-4032基因組中預測存在50個次級代謝產物合成基因簇，而其中 72% 為孤兒基因簇，具有產生新化合物的潛力。這也說明了構建該菌株的遺傳轉化體系，進一步研究該菌株的相關基因功能，分析相關沉默基因簇的激活狀況的必要性。

在功能基因組學時代，對靶基因進行分子操作的需求已經大大增加[14-15]。真菌遺傳轉化系統可以實現對菌株的遺傳改造[1]。在絲狀真菌的遺傳轉化操作中，最常見的是PEG介導轉化法、電穿孔和農桿菌介導轉化法。本研究構建和優化了PEG介導的Pseudogymnoascus遺傳轉化體系。

在真菌的遺傳轉化系統中，常用藥物抗性標記或營養缺陷型標記進行篩選轉化菌株[17]。Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032菌株對G418、潮霉素B和草銨麟抗性敏感性實驗中，成功篩選出適合遺傳轉化的抗性濃度。當草銨膦濃度即使增大到 2000μg/mL 時，對實驗菌株的生長仍沒有抑制作用。推測原因時發現Pseudogymnoascus sp.OUCMDZ-4032基因組中存在一個與草銨麟抗性基因（Bar基因）同源性 40% 的基因，可能正是同源基因發揮抗性功能，導致菌株即使在很高抗性濃度條件下也能正常生長。

原生質體的制備是構建絲狀真菌遺傳轉化體系的重要條件。高質量的原生質體能夠提高轉化效率。本實驗通過觀察菌絲體在不同培養基中的生長狀態，選擇SDYS和PDB培養基培養孢子 24h ，混合酶體系水解菌絲體 ^2h ，可產生大量原生質體。制備的原生質體形態良好，吸水漲破，符合標準，同時再生率達到 47%±3% 。在PEG介導的遺傳轉化中，將具有neo和hph抗性基因的線性質粒導入PseudogymnoascusspOUCMDZ-4032原生質體中，共篩選出10個轉化子，只有一個假陽性，陽性率達 90% 0

綜上所述，本文成功分析了Pseudogymnoascussp.OUCMDZ-4032菌株的生物合成基因簇，該菌株具有產生新化合物的巨大潛力，構建了

Pseudogymnoascussp.的遺傳轉化體系，有利于研究Pseudogymnoascussp.次級代謝產物的生物合成，也為嗜冷微生物的分子生物學研究提供了基礎提示。

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