菊花腦CnNAC83基因克隆及其表達(dá)分析

【Abstract】Using stemand leaf tissues of Chrysanthemum nankingense，we clone the NAC transcription factor gene CnNAC83and perform bioinformaticsanalysis along with expressonprofiling underPEG-6Ooo-simulated drought stress. ThecodingsequenceofCnNAC83is786bpinlength，encoding261aminoacids，withaconservedNAMdomainatits N-terminus，anditssubcellularlocalizationispredictedtobethenucleus.Physicochemical propertyanalysisshowthathe isoelectricpointofCnNAC83is9.14，andagrandaverageofhydropathicity（GRAVY）score-0.725，indicatingitisahdro philicprotein.Phylogeneticanalysisshow that CnNAC83 ismostcloselyrelated toAaNAC83fromArtemisiaannua，while moredistantlyrelatedtoPgNAC83fromPunicagranatumandAtNAC83fromArabidopsis thaliana.RT-qPCRanalysis show thatdrought stresscan induceCnNAC83 expression.Theseresults indicate that CnNAC83 playsapositiveregulatoryrole in droughtresistanceinChrysanthemumnankingense，whichprovidesabasisforthestudyof thebiological functionof CnNAC83.

【KeyWords]Chrysanthemumnankingense;genecloning;NACtranscriptionfactor;droughtstress; expresionanalysis

[中圖分類號(hào)］Q781 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1674-3229（2025）02-0107-08

0 引言

在植物的生命周期中，保持基因按照特定時(shí)空順序進(jìn)行表達(dá)對(duì)于維持其發(fā)育進(jìn)程至關(guān)重要，而在這一過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子扮演著不可或缺的基礎(chǔ)角色。NAC（NAM，ATAF1/2和CUC2）轉(zhuǎn)錄因子是目前已知的最大植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族之一[]。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員的N端序列較為保守，通常由150＼～160個(gè)氨基酸殘基組成，分為5個(gè)保守的motif基序（A＼～E），其功能與DNA的識(shí)別和結(jié)合有關(guān)[2]。C端為該蛋白家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)段，其保守性較差，該區(qū)段富含一些出現(xiàn)頻率較高的氨基酸殘基如絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸等[3-4]。另外還有研究表明，C端區(qū)域通過(guò)調(diào)控NAC轉(zhuǎn)錄因子與靶蛋白相互作用發(fā)揮功能[2]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，特別是在非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在擬南芥中過(guò)表達(dá)葡萄藤VvNAC17能夠促進(jìn)ABA相關(guān)基因表達(dá)，提高擬南芥幼苗高強(qiáng)度干旱條件下的存活率[5]。NAC家族轉(zhuǎn)錄因子GhirNAC2通過(guò)調(diào)節(jié)ABA生物合成在棉花抵御干旱的過(guò)程中發(fā)揮積極作用[6]。

菊花腦（Chrysanthemumnankingense）又名菊花葉、路邊黃、野菊花等，是菊科草本植物。菊花腦富含次生代謝物，風(fēng)味獨(dú)特，藥食兼用，是江蘇啟東地區(qū)特色保健蔬菜[7。另外，二倍體菊花腦與商業(yè)上重要的多倍體觀賞菊花品種以及藥用菊花品種有著密切的親緣關(guān)系。因此，菊花腦可以作為模式植物運(yùn)用于研究菊花的遺傳性狀改良，特別是在非生物脅迫耐受性領(lǐng)域，常用于篩選潛在的有益基因[8-9]。然而，目前鮮有菊花腦分子水平上的研究。本研究利用逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription，RT-PCR）技術(shù)，以菊花腦莖葉組織cDNA為模板，克隆得到CnNAC83轉(zhuǎn)錄因子編碼序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)對(duì)菊花腦成苗進(jìn)行PEG-6000模擬干旱處理，解析CnNAC83基因?qū)Ω珊淡h(huán)境的響應(yīng)情況，以期為剖析CnNAC83在菊花腦抵御干旱脅迫的功能機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

所用試驗(yàn)材料為藥用植物有效成分生物合成

亳州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的菊花腦株系，種植于實(shí)驗(yàn)室植物光照培養(yǎng)箱，種植條件為長(zhǎng)日照，溫度條件為白天 24^°C ，夜晚 23^°C ，濕度條件為 55% 。

1.2菊花腦總RNA提取與CnNAC83基因克隆

根據(jù)菊花腦基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息（http：//210.22.121.250：888O/asteraceae/homePage），使用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)CnNAC83的全長(zhǎng)克隆引物（見(jiàn)表1）。按照KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶（東洋紡生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)。其產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并使用凝膠回收試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）回收目的片段。利用BluntSimpleCloningKit（翌圣生物科技股份有限公司）將片段連接pESI-Blunt載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，相關(guān)操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。挑取陽(yáng)性克隆過(guò)夜培養(yǎng)后送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3生物信息學(xué)分析

使用NCBI-blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）查找CnNAC83同源蛋白序列，利用在線比對(duì)工具 Clustal Omega（https：//www.ebi.ac.uk/jdis-patcher/msa/clustalo）結(jié)合Jalview分析軟件對(duì)同源蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)。利用NCBI網(wǎng)站中ConservedDomainsSearch在線工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)CnNAC83蛋白保守結(jié)構(gòu)域。使用MEGA11軟件結(jié)合鄰接法（neigh-borjoining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）分析蛋白質(zhì)保守基序，利用Lamdba Predict Protein（https：//lambda.predictprotein.org/）預(yù)測(cè)CnNAC83亞細(xì)胞定位。使用ProtParam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行初步分析。采用SPOMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.

html）及 SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.ex-pasy.org/）在線分析工具進(jìn)行CnNAC83蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，利用TMHMM2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線工具對(duì)氨基酸序列進(jìn)行跨膜分析，利用SignalP（https：//ser-vices.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.O/）在線工具對(duì)蛋白信號(hào)肽進(jìn)行分析，磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析利用在線工具NetPhos3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1）。

1.4CnNAC83序列分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

參照徐健等的實(shí)驗(yàn)方法[10]，將所獲得的CnNAC83蛋白氨基酸序列導(dǎo)入NCBI網(wǎng)站blastp工具，獲取不同物種中CnNAC83同源蛋白。它們的識(shí)別號(hào)如下：黃花蒿（Artemisiaannua，PWA89607.1），萵苣（Lactuca sativa，XP_023741761.1），黃胡蘿卜（Daucuscarota subsp.Sativus，XP_017215356.1），紅馬銀花（Rhododendron vialii，XP_058194575.1），牽牛（Ipomoea nil，XP_019181155.1），石榴（Punica grana-tum，XP_031402761.1），銀白楊（Populusalba，XP_034906860.1），紫蘇（Perillafrutescensvar.hirtella，KAH6771146.1），木薯（Manihotesculenta，XP_021624455.1），克里曼丁紅橘（Citrusxclementina，XP_006438824.1），胡楊（Populustrichocarpa，XP_002304662.2），川桑（Morusnotabilis，XP_010090688.1），狹葉油茶（Camellia lanceoleosa，KAI7998706.1），雷公藤（Tripterygiumwilfordi，XP_038702863.1），大麻（Cannabissativa，XP_030497096.1），陸地棉（Gossypium hirsutum，NP_001313946.1），擬南芥（Arabidopsisthaliana，NP_196822.1）。

1.5PEG-6000模擬干旱脅迫處理菊花腦植株及CnNAC83表達(dá)模式分析

正常條件下培養(yǎng)菊花腦幼苗20天左右，轉(zhuǎn)至霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培，恢復(fù)培養(yǎng)7天。取3組菊花腦植株至含有 30% PEG-6000霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行干旱脅迫處理。8小時(shí)后分別取3個(gè)對(duì)照組和3個(gè)處理組菊花腦莖葉組織，按照RNA提取試劑盒（諾唯贊）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取菊花腦cDNA。使用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)CnNAC83反轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)參引物（見(jiàn)表1），采用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（諾唯贊）進(jìn)行qPCR分析，結(jié)果采用 2^-ΔΔCt 法處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1菊花腦CnNAC83基因克隆及測(cè)序

為了獲取CnNAC83轉(zhuǎn)錄因子編碼區(qū)序列，以菊花腦莖葉組織cDNA為模板，以CnNAC83-F和CnNAC83-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。接著將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。結(jié)果如圖1（a）所示，采用Marker作為產(chǎn)物大小的參照，在 750bp 和1000 bp之間有一條特異條帶。為了進(jìn)一步分析編碼CnNAC83蛋白的開(kāi)放閱讀框序列信息，對(duì)條帶進(jìn)行膠回收并測(cè)序。結(jié)果如圖1（b）所示，獲得一條長(zhǎng)為786bp的序列，編碼261個(gè)氨基酸。

2.2CnNAC83結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

將CnNAC83蛋白質(zhì)的氨基酸序列與NCBI中其他7種NAC家族蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖2所示，CnNAC83與黃花蒿AaNAC83蛋白（PWA89607.1）

和牽牛InNAC83-like蛋白（XP019181155.1）相似性較高，分別為 68.15% 和 57.14% 。保守性分析表明第15～142位氨基酸為NAM結(jié)構(gòu)域。

2.3CnNAC83進(jìn)化樹(shù)分析及motif預(yù)測(cè)

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到其他物種中CnNAC83同源蛋白。使用MEGA11軟件對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，結(jié)果如圖3（a）所示，CnNAC83與黃花蒿AaNAC83親緣關(guān)系最近，與石榴PgNAC83、陸地棉GhNAC83-like、擬南芥AtNAC83親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。利用MEME在線分析工具預(yù)測(cè)上述同源蛋白的10個(gè)保守基序（基序1＼～10）的序列特征，結(jié)果如圖3（b）所示，所有NAC83同源蛋白序列均含有基序1＼～7，CnNAC83與AaNAC83還含有基序9。進(jìn)一步利用LamdbaPredictProtein分析工具對(duì)CnNAC83亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3（c）所示，CnNAC83亞細(xì)胞定位信號(hào)集中于細(xì)胞核。

2.4CnNAC83蛋白理化性質(zhì)分析

對(duì)CnNAC83蛋白的氨基酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。發(fā)現(xiàn)含量最高的氨基酸是賴氨酸（Lys），所占比例為 10% ；最低的是半胱氨酸（Cys），所占比例為 1.1% 。CnNAC83的氨基酸序列中，帶正電荷的氨基酸殘基（Arg、Lys）含有40個(gè)，占總氨基酸數(shù)約 15.3% ，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Asp、Glu）含有33個(gè)，占總數(shù)的 12.6% 。

利用ExPASyProtParam在線軟件對(duì)CnNAC83蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。該蛋白由C、H、N、O、S五大元素組成，分子式為 C₁₃₀₆H₂₀₄₈N₃₆₆O₂₉₅S₉ 共含4124個(gè)原子，相對(duì)分子質(zhì)量為 29.49kD ，理論等電點(diǎn)（pI）為9.14。根據(jù)分析結(jié)果，CnNAC83的失穩(wěn)指數(shù)（II）是39.06，說(shuō)明該蛋白穩(wěn)定性高。該蛋白的脂肪族指數(shù)為65.25，親疏水性系數(shù)（GRAVY）分別為-0.725，表明CnNAC83是親水性蛋白，并具有一定的脂溶性。

2.5CnNAC38轉(zhuǎn)錄因子ORF的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線分析軟件對(duì)CnNAC38轉(zhuǎn)錄因子的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。采用ProScale在線網(wǎng)站對(duì)CnNAC83蛋白序列展開(kāi)親疏水性預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白大部分氨基酸親疏水性賦分均在0以下，表明CnNAC83為親水性蛋白。通過(guò)SignalP進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CnNAC83蛋白無(wú)信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白，說(shuō)明該蛋白不需要分泌到細(xì)胞外，僅在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮自己的功能。TMHMM預(yù)測(cè)表明CnNAC83蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白。采用NetPhos-3.1在線分析工具對(duì)CnNAC83蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示CnNAC83蛋白有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中包括絲氨酸磷酸化位點(diǎn)21個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)4個(gè)。

2.6CnNAC83蛋白二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)SOMPA對(duì)CnNAC83進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5（a）所示，該蛋白含 8.8% 的 α 螺旋，75.38% 的無(wú)規(guī)則卷曲， 15.71% 的延伸鏈。利用

SWISS-MODEL對(duì)CnNAC83蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5（b）所示，CnNAC83與模板蛋白的序列一致度為 91.97% ，GMQE值為0.67，這些指標(biāo)表明CnNAC83蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果良好。

2.7CnNAC83在干旱逆境脅迫中的表達(dá)分析

為了分析 CnNAC83 基因在菊花腦應(yīng)答干旱脅迫過(guò)程中的功能，本研究利用 30% PEG-6000對(duì)菊花腦植株進(jìn)行模擬干旱處理并采用RT-qPCR技術(shù)分析CnNAC83基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)處理后的菊花腦植株葉片失水萎蔫，CnNAC83基因響應(yīng)干旱誘導(dǎo)，其表達(dá)水平上升3.5倍左右。上述結(jié)果表明CnNAC83基因在菊花腦應(yīng)答干旱脅迫的過(guò)程可能具有重要調(diào)控功能。

3 結(jié)論與討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，這些轉(zhuǎn)錄因子在逆境響應(yīng)和植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著各種重要作用[]。與脅迫相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)在土豆、水稻、大豆和棉花中得到了很好的研究[12-15]。本研究從菊花腦中克隆獲得CnNAC83基因，其編碼蛋白的N端具有NAC轉(zhuǎn)錄因子成員典型且特有的NAM結(jié)構(gòu)域，MEME分析表明其N段含有5個(gè)保守motif序列，C端保守性較低，此外在線工具預(yù)測(cè)表明其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，這些指標(biāo)符合NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的特征，故將其命名其為CnNAC83。

對(duì)CnNAC83氨基酸序列特性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，CnNAC83與其他植物中的同源蛋白具有較高的相似性，說(shuō)明CnNAC83蛋白在不同物種中較為保守，表明其功能的重要性，同時(shí)也證明本研究基因克隆的準(zhǔn)確性。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，CnNAC83蛋白與黃花蒿的親緣關(guān)系最近，表明二者可能來(lái)自同一個(gè)祖先。與陸地棉、擬南芥、胡楊、銀白楊等都有較高的同源性，表明它們可能具備相似的功能。

由蛋白激酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)磷酸化過(guò)程在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制中扮演著核心角色，是生物體內(nèi)一種極為普遍且至關(guān)重要的蛋白質(zhì)后期修飾方式[6]。其功能調(diào)節(jié)主要體現(xiàn)在3大方面：首先，磷酸化蛋白質(zhì)在植物體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用；其次，磷酸化能夠影響蛋白質(zhì)間的相互作用模式；最后，通過(guò)磷酸化修飾，可以調(diào)整受體蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)。簡(jiǎn)而言之，蛋白質(zhì)磷酸化不僅參與信號(hào)傳遞，還調(diào)節(jié)蛋白互作并改變受體活性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)菊花腦CnNAC83蛋白磷酸化位點(diǎn)總計(jì)31個(gè)，其中絲氨酸磷酸化位點(diǎn)21個(gè)，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)6個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)4個(gè)。推測(cè)CnNAC83轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)翻譯后水平的修飾作用來(lái)調(diào)節(jié)其自身的活性狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)利用 30% PEG-6000處理菊花腦能夠顯著提升CnNAC83基因表達(dá)，說(shuō)明干旱條件能夠誘導(dǎo)CnNAC83基因的表達(dá)。實(shí)際上，許多研究表明NAC轉(zhuǎn)錄因子普遍參與植物干旱脅迫的應(yīng)答過(guò)程，是調(diào)節(jié)植物干旱適應(yīng)性的關(guān)鍵因子[18]。例如，Yang等人發(fā)現(xiàn)與野生型相比，過(guò)表達(dá)GmNAC8基因的轉(zhuǎn)基因大豆表現(xiàn)出更高耐旱水平，而GmNAC8敲除株系則表現(xiàn)出較低的抗旱性[19]。在煙草植株中，通過(guò)引入花生ANAC3基因進(jìn)行異源過(guò)表達(dá)，能夠上調(diào)與干旱防御相關(guān)基因的表達(dá)水平，其中包括超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD），吡咯啉-5-羧酸合成酶（Pyrroline-5-carboxyl-atesynthetase，P5SC），晚期胚性豐富蛋白（Late em-bryogenicabundantproteins，LEA）基因，從而有效增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱環(huán)境的適應(yīng)能力[20]。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)CnNAC83基因參與菊花腦抵御抗旱的正向調(diào)控過(guò)程。

本研究從菊花腦莖葉組織中克隆得到1個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員基因，命名為 CnNAC83 ，該基因的開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)度為 786bp ，共編碼261個(gè)氨基酸。CnNAC83蛋白N端有一個(gè)保守的NAM保守結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核。進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)CnNAC83與黃花蒿AaNAC83親緣關(guān)系最近，而與石榴 PgNAC83 、陸地棉GhNAC83-like、擬南芥AtNAC83親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。對(duì)菊花腦植株進(jìn)行30% PEG-6000模擬干旱處理，結(jié)果表明該基因的表達(dá)水平受到干旱誘導(dǎo)。本研究結(jié)果為理解菊花腦適應(yīng)干旱脅迫的基因調(diào)控機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。

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責(zé)任編輯呂榮榮