護(hù)肝清脂方飲片湯劑與配方顆粒的化學(xué)成分、藥效一致性及機(jī)制研究

關(guān)鍵詞 護(hù)肝清脂方；非酒精性脂肪性肝病；飲片湯劑；配方顆粒；一致性研究；含量；藥效

中藥配方顆粒是以傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，采用現(xiàn)代工藝技術(shù)將中藥飲片加工制成的可供臨床直接配方使用的顆粒劑[1]。該劑型具有免煎易服、便于調(diào)劑、劑量準(zhǔn)確、患者依從性好等優(yōu)點(diǎn)，是對傳統(tǒng)中藥飲片行業(yè)的補(bǔ)充和創(chuàng)新，有助于推動(dòng)中醫(yī)藥行業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，故備受學(xué)界關(guān)注[2]。然而，中藥配方顆粒與飲片湯劑的療效差異是制約配方顆粒發(fā)展的關(guān)鍵因素[3]，因此開展一致性研究具有重要的臨床意義。

護(hù)肝清脂方（Hugan qingzhi formula，以下簡稱“HGQZ”）是源自名老中醫(yī)臧堃堂的經(jīng)驗(yàn)方，由澤瀉、山楂、荷葉、三七、蒲黃5 味中藥組成[4]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，對于非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholicfatty liver disease，NAFLD）等代謝性疾病，HGQZ飲片湯劑具有良好的抗脂質(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)血脂的作用，能顯著增強(qiáng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力[5―8]，但有關(guān)HGQZ 配方顆粒的研究尚少。為此，本研究根據(jù)2020 年版《中國藥典》（一部）[9]，對HGQZ飲片湯劑與配方顆粒中6 種特征成分（人參皂苷Rb1、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、荷葉堿、23-乙酰澤瀉醇B）的含量進(jìn)行比較；同時(shí)，以高脂飲食喂養(yǎng)構(gòu)建NAFLD小鼠模型，探究HGQZ飲片湯劑與配方顆粒的藥效是否具有一致性，并基于代謝組學(xué)分析其潛在作用機(jī)制，以期為HGQZ配方顆粒替代飲片湯劑提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SCIEX Triple QuadTM5500 型液相色譜- 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（liquidchromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）系統(tǒng)（美國AB SCIEX 公司）、安穩(wěn)+血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）、Tanon 5200 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)生物有限公司）、Mini-PROTEAN? Tetra 型電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）、K5800/C/H/T 型超微量分光光度計(jì)（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

澤瀉、山楂、荷葉、蒲黃、三七配方顆粒（批號分別為A2015213、A307L333、A304853、A305A093、A3040933，規(guī)格均為200 g/袋）均購自廣東一方制藥有限公司，其制備過程均遵循《廣東省中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》；澤瀉、山楂、荷葉、蒲黃、三七飲片（批號分別為231001、220601、220101、231001、220601）均購自廣州至信藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院藥學(xué)部副研究員鄉(xiāng)世健鑒定均為真品；人參皂苷Rb1、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、荷葉堿、23-乙酰澤瀉醇B對照品（批號分別為41753-43-9、104472-68-6、55033-90-4、482-36-0、26575-95-1、475-83-2，純度均為95%）均購自成都克洛瑪生物技術(shù)有限公司；胰島素（批號R22024030202）購自通化東寶藥業(yè)股份有限公司；葡萄糖（批號G116303）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、總膽固醇（totalcholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）試劑盒（批號分別為20240416、20240417、20240612、20240612）均購自南京建成生物工程研究所；甲醇、乙腈（批號分別為11176407147、JB127130）為分析純，均購自美國Supelco公司；兔源腺苷一磷酸活化的蛋白激酶（AMP-activatedprotein kinase，AMPK）抗體、兔源磷酸化AMPK（phosphorylatedAMPK，p-AMPK）抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 二抗（批號分別為A00994-6、BM4718、BA1054、BA1050）均購自武漢博士德生物工程有限公司；鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（批號62u0922）購自江蘇親科生物研究中心有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠36 只，7 周齡，體重（20±2）g，購自珠海百試通生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2020-0051。所有小鼠飼養(yǎng)于深圳華騰生物醫(yī)藥科技有限公司動(dòng)物房內(nèi)，溫度為（22±1）℃，相對濕度為40%～70%，每12 h 光照/黑暗循環(huán)。所有小鼠均自由攝食、飲水。本研究飼養(yǎng)環(huán)境符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)深圳華騰生物醫(yī)藥科技有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（編號B202312-1）。

高脂飼料（批號20230826）購自戴茨生物科技（無錫）有限公司；普通維持飼料（批號2024010101）購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1 HGQZ飲片湯劑與配方顆粒的特征成分含量比較

2.1.1 溶液的制備

（1）對照品溶液：精密稱取人參皂苷Rb1、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、荷葉堿、23-乙酰澤瀉醇B對照品各10 mg，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的混合對照品儲備液。（2）HGQZ飲片湯劑供試品溶液：取處方量藥材50 g（其中蒲黃7.5 g、三七2.5 g、荷葉10 g、山楂15 g、澤瀉15 g），加8 倍量水，加熱回流提取1 h×3 次，過濾，合并濾液。將濾液于60 ℃下減壓濃縮至50 mL，即得質(zhì)量濃度為1 g/mL（以生藥量計(jì)）的HGQZ飲片湯劑提取液。精密吸取上述提取液適量，用50% 甲醇稀釋100 倍后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得HGQZ 飲片湯劑供試品溶液。（3）HGQZ配方顆粒供試品溶液：根據(jù)配方顆粒包裝袋內(nèi)容可知，配方顆粒與飲片的換算比例分別為澤瀉1∶4、山楂1∶2、荷葉1∶5、三七1∶1.5、蒲黃1∶3.8，故按處方量稱取配方顆粒適量（相當(dāng)于飲片50 g），加水50 mL，渦旋振蕩均勻，于60 ℃水浴中加熱10 min后冷卻至室溫，即得質(zhì)量濃度為1 g/mL（以生藥量計(jì)）的HGQZ 配方顆粒提取液。精密吸取該提取液適量，用50% 甲醇稀釋100 倍后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得HGQZ配方顆粒供試品溶液。

2.1.2 色譜與質(zhì)譜條件

以Phenomenex Kinetex? C18（3.0 mm×100 mm，2.6μm）為色譜柱，以0.1% 甲酸溶液為流動(dòng)相A、乙腈為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～0.8 min，15%B；0.8～2.5 min，15%B→85%B；2.5～3.5 min，85%B；3.5～4.0 min，85%B→15%B；4.0～5.0 min，15%B）；柱溫為40 ℃；流速為0.4mL/min；進(jìn)樣量為1 μL。

采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行正離子檢測；噴霧電壓為5 500 V；離子化溫度為550 ℃；霧化氣壓力為50 psi；輔助氣壓力為55 psi；氣簾氣壓力為25psi；碰撞氣壓力為9 psi。HGQZ各特征成分的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜信息見表1。

2.1.3 方法學(xué)考察

（1）取“2.1.1”項(xiàng)下配制的混合對照品儲備液適量，用50% 甲醇逐級稀釋，制成各成分質(zhì)量濃度均為285.74、142.87、71.44、35.72、7.14、1.43、0.72 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以各對照品峰面積為縱坐標(biāo)（y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），使用最小加權(quán)二乘法進(jìn)行線性回歸。（2）按照2020 年版《中國藥典》（四部）的相關(guān)要求，進(jìn)行方法學(xué)考察[10]。

2.1.4 特征成分含量的測定及比較

按“2.1.1”項(xiàng)下HGQZ飲片湯劑、配方顆粒供試品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并代入回歸方程，計(jì)算樣品中各成分的含量并進(jìn)行比較。每樣品平行檢測3次。

2.2 HGQZ飲片湯劑與配方顆粒的藥效比較

2.2.1 分組、造模與給藥

將小鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC組）、模型組（HFD組）、HGQZ飲片湯劑低劑量組（HGQZ-YP-L組）、HGQZ飲片湯劑高劑量組（HGQZ-YP-H組）、HGQZ 配方顆粒低劑量組（HGQZ-KL-L 組）、HGQZ 配方顆粒高劑量組（HGQZ-KL-H組），每組6 只。根據(jù)本課題組前期研究，本實(shí)驗(yàn)將HGQZ飲片湯劑/配方顆粒的低、高劑量設(shè)置為13、26 g/kg（以生藥量計(jì)）。除NC組小鼠給予普通維持飼料外，其余各組小鼠均給予高脂飼料20 周以建立NAFLD模型[11]。造模同時(shí)，各藥物組小鼠灌胃相應(yīng)劑量藥液，其余各組小鼠灌胃等體積水，每天1 次，共20 周。實(shí)驗(yàn)期間，每周記錄各組小鼠的體重。

2.2.2 小鼠空腹血糖的檢測和葡萄糖、胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

于給藥的第18 周末，各組小鼠禁食12 h 后進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)，具體操作如下：各組小鼠灌胃10% 葡萄糖溶液（每40 g 體重灌胃200 μL），并于灌胃后0、15、30、60、90、120 min 時(shí)采集尾靜脈血；使用血糖儀檢測上述時(shí)間點(diǎn)的血糖值[其中，0 min 時(shí)的血糖值即為空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）值]，繪制血糖濃度-時(shí)間曲線并計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC）以反映葡萄糖耐量（兩者成正比）。于給藥的第19 周末，各組小鼠禁食12 h 后進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)，具體操作如下：各組小鼠腹腔注射0.15 IU/mL 胰島素溶液（以生理鹽水為溶劑，每40 g 體重注射200 μL），并于注射后0、15、30、60、90、120 min 時(shí)采集尾靜脈血；使用血糖儀檢測上述時(shí)間點(diǎn)的血糖值，繪制血糖濃度-時(shí)間曲線并計(jì)算AUC以反映胰島素耐量（兩者成正比）。末次給藥后，使用血糖儀檢測各組小鼠的FBG水平。

2.2.3 樣本采集及器官指數(shù)的計(jì)算

末次給藥后，各組小鼠禁食、不禁水16 h 后稱重，隨后以戊巴比妥鈉麻醉后經(jīng)眼球取血。血樣于室溫下靜置30 min 后，于4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，分離上層血清并于－80 ℃下凍存，備用。取血后，各組小鼠以頸椎脫臼法處死，分離肝臟、白色脂肪、棕色脂肪并稱重，并計(jì)算器官或脂肪指數(shù)——肝指數(shù)、白色脂肪指數(shù)和棕色脂肪指數(shù)。器官或脂肪指數(shù)＝器官或脂肪質(zhì)量/體重。隨后，取肝組織樣品適量，經(jīng)液氮速凍后于－80 ℃凍存，剩余組織樣品則以4% 多聚甲醇溶液固定，備用。

2.2.4 小鼠脂質(zhì)與肝功能指標(biāo)的檢測

取“2.2.3”項(xiàng)下各組小鼠肝組織樣品適量，勻漿后，檢測其TC、TG 水平；取“2.2.3”項(xiàng)下各組小鼠的血清樣品適量，檢測其AST、ALT 水平。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

2.2.5 小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)和脂質(zhì)堆積情況觀察

取“2.2.3”項(xiàng)下各組小鼠經(jīng)4% 多聚甲醛溶液固定24 h 的肝組織，取一部分經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片，再進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，以甘油封片后，使用顯微鏡觀察其肝組織病理損傷狀況；取另一部分肝組織用OCT包埋劑包埋后行冷凍切片，再進(jìn)行油紅O染色，使用顯微鏡觀察其脂質(zhì)堆積情況（脂質(zhì)經(jīng)染色后呈紅色）。

2.3 HGQZ飲片湯劑與配方顆粒潛在作用機(jī)制分析

2.3.1 小鼠血清代謝組學(xué)研究

取HFD 組、HGQZ-YP-H 組、HGQZ-KL-H 組（參考“2.2”項(xiàng)下藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果）小鼠血清樣品適量，置于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈-甲醇混合溶液（1∶1，V/V），渦旋30 s，于－20 ℃下靜置1 h 后，再于4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min，取上清液，真空濃縮至干。殘?jiān)?0%乙腈100 μL復(fù)溶，渦旋30 s，于4 ℃下以12 000r/min 離心15 min，取上清液5 μL 進(jìn)行LC-MS/MS 分析（檢測儀器和條件均由美國AB SCIEX公司提供）。使用Analyst 1.6.3 軟件進(jìn)行色譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，Multiquant3.0.3 軟件用于代謝物分析。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metabo‐Analyst 6.0 平臺（https：//www.metaboanalyst.ca），采用正交偏最小二乘法- 判別分析（orthogonal partial leastsquares discriminant analysis，OPLS-DA），以R2Y（表示模型解釋率，數(shù)值越接近于1 表示差異性越大）和Q 2（表示模型預(yù)測能力，數(shù)值越接近于1 表示模型的可靠性越高）作為指標(biāo)進(jìn)行組間比較；繪制火山圖，以表達(dá)量差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.5、P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選血清差異代謝物，并通過韋恩圖篩選共同差異代謝物。以上述差異代謝物通過京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes，KEGG；https：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行通路富集分析。

2.3.2 小鼠肝組織中AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測

取NC組、HFD組、HGQZ-YP-H組、HGQZ-KL-H組小鼠肝組織適量，勻漿，于4 ℃下以12 000 r/min 離心15min；取上清液，用BCA 法測定蛋白濃度后加熱變性。取變性蛋白適量，經(jīng)10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，以5% 牛血清白蛋白于室溫下封閉1.5 h；加入AMPK、p-AMPK、GAPDH一抗（稀釋度分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶5 000），于4 ℃下孵育過夜；用TBST 洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋度為1∶5 000），于室溫下孵育1 h；用TBST洗膜后，滴加顯色液后顯影、成像。使用Image J 軟件分析各蛋白的條帶灰度值，以AMPK、p-AMPK 與內(nèi)參蛋白（GAPDH）的條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量，并以p-AMPK與AMPK蛋白的相對表達(dá)量比值表示AMPK蛋白的磷酸化水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 8 軟件繪制圖表。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)（方差齊性時(shí)）或Tamhane’s T2 檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)）。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 HGQZ飲片湯劑與配方顆粒的特征成分含量比較結(jié)果

3.1.1 方法學(xué)考察結(jié)果

人參皂苷Rb1、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、荷葉堿、23-乙酰澤瀉醇B檢測質(zhì)量濃度的線性范圍均為0.72～285.74 μg/mL（相關(guān)系數(shù)均大于0.99）。結(jié)果見表2。該方法的專屬性、精密度、加樣回收率、穩(wěn)定性均符合2020 年版《中國藥典》（四部）的相關(guān)規(guī)定（具體結(jié)果略）。

3.1.2 含量測定結(jié)果

HGQZ飲片湯劑和配方顆粒中6 種特征成分的含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明兩者特征成分的含量相當(dāng)。結(jié)果見表3。

3.2 HGQZ飲片湯劑與配方顆粒的藥效比較結(jié)果

3.2.1 小鼠FBG和葡萄糖、胰島素耐量比較

與NC組比較，HFD 組小鼠的FBG 水平、葡萄糖耐量AUC、胰島素耐量AUC 均顯著升高（P＜0.05）。與HFD 組比較，各藥物組小鼠的FBG 水平、葡萄糖耐量AUC（HGQZ-YP-L 組除外）、胰島素耐量AUC（HGQZYP-L 組除外）均顯著降低（P＜0.05）。與同質(zhì)量濃度HGQZ飲片湯劑組比較，HGQZ配方顆粒組小鼠上述指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4、圖1。

3.2.2 小鼠體重、肝指數(shù)、脂肪指數(shù)比較

與NC組比較，HFD組小鼠的體重、肝指數(shù)、白色脂肪指數(shù)均顯著升高，棕色脂肪指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。與HFD 組比較，各藥物組小鼠的體重（僅HGQZ-KL-H組）、肝指數(shù)、白色脂肪指數(shù)（HGQZ-KL-L 組除外）均顯著降低，棕色脂肪指數(shù)（HGQZ-YP-L組、HGQZ-KL-L組除外）均顯著升高（P＜0.05）。與同質(zhì)量濃度HGQZ 飲片湯劑組比較，HGQZ配方顆粒組小鼠上述指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表5。

3.2.3 小鼠脂質(zhì)與肝功能指標(biāo)比較

與NC組比較，HFD組小鼠肝組織中TC、TG水平以及血清中AST、ALT 水平均顯著升高（P＜0.05）。與HFD組比較，各藥物組上述指標(biāo)（HGQZ-YP-L 組TG水平除外）均顯著降低（P＜0.05）。與同質(zhì)量濃度HGQZ飲片湯劑組比較，HGQZ配方顆粒組小鼠上述指標(biāo)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表6。

3.2.4 小鼠肝組織病理改變及脂質(zhì)堆積情況比較

NC組小鼠肝組織細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整且處于正常狀態(tài)。與NC組比較，HFD組小鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)肥大特征，且可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤和脂肪空泡。與HFD 組比較，各藥物組小鼠的肝臟病理改變均有所緩解，炎癥細(xì)胞浸潤和脂肪空泡均有所減少。結(jié)果見圖2。

3.3 HGQZ飲片湯劑與配方顆粒潛在作用機(jī)制比較

3.3.1 小鼠血清代謝組學(xué)分析結(jié)果

OPLS-DA結(jié)果（圖3）顯示，HFD 組與HGQZ-YP-H組的R 2Y和Q 2分別為0.927、0.517，HFD組與HGQZ-KLH組的R 2Y 和Q 2分別為0.952、0.440，提示各組樣本可明顯區(qū)分，模型未見過度擬合。火山圖結(jié)果（圖4）顯示，HFD 組與HGQZ-YP-H 組之間有234 個(gè)血清差異代謝物，其中59 個(gè)上調(diào)、175 個(gè)下調(diào)；HFD組與HGQZ-KL-H組之間有136 個(gè)血清差異代謝物，其中52 個(gè)上調(diào)、84 個(gè)下調(diào)。

韋恩圖分析顯示（圖略），HFD 組與HGQZ-YP-H組、HFD 組與HGQZ-KL-H 組的共同差異代謝物共65種。這65 種差異代謝物的KEGG通路富集分析結(jié)果（圖5）顯示，其涉及的主要代謝通路包括嘌呤代謝（purinemetabolism）、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)等。

根據(jù)既往研究，TCA循環(huán)可影響能量代謝利用，與肥胖相關(guān)代謝性疾病密切相關(guān)[12―13]。進(jìn)一步分析TCA循環(huán)通路中相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)HGQZ干預(yù)后可顯著上調(diào)小鼠血清中檸檬酸水平，具體表現(xiàn)為HFD組檸檬酸的平均響應(yīng)強(qiáng)度為5.20×107，顯著低于HGQZ-YPH組的9.77×107和HGQZ-KL-H組的9.37×107（P＜0.05）。

3.3.2 小鼠肝組織中AMPK 信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

與NC 組（0.56±0.07）比較，HFD 組小鼠肝組織中AMPK 蛋白的磷酸化水平（0.26±0.16）顯著降低（P＜0.05）。與HFD組比較，HGQZ-YP-H組、HGQZ-KL-H組小鼠肝組織中AMPK 蛋白的磷酸化水平（0.73±0.18、0.75±0.21）均顯著升高（P＜0.05）。與HGQZ-YP-H 比較，HGQZ-KL-H組小鼠肝組織中AMPK蛋白磷酸化水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖6。

4 討論

本課題組在HGQZ飲片湯劑和配方顆粒特征成分的含量比較中，首先比較了水-甲醇、水-乙腈、0.1% 甲酸溶液-甲醇、0.1% 甲酸溶液-乙腈4 種流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果顯示，當(dāng)以0.1% 甲酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，各特征成分的色譜峰峰形和分離度均較好，故選擇0.1% 甲酸溶液-乙腈作為最終的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫程序優(yōu)化。同時(shí)，本課題組還比較了不同色譜柱[WatersACQUITY HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、PhenomenexKinetex? C18（3.0 mm×100 mm，2.6 μm）]的分離效果，最終優(yōu)選了Phenomenex Kinetex? C18。

根據(jù)本課題組前期HGQZ 相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[14―15]，本研究測定并比較了HGQZ飲片湯劑和配方顆粒中人參皂苷Rb1、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、金絲桃苷、荷葉堿、23-乙酰澤瀉醇B的含量，結(jié)果顯示，這6 個(gè)特征成分的含量無明顯差異，表明配方顆粒在制備過程中保留了飲片的主要活性成分，為進(jìn)一步開展藥效一致性研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

HGQZ飲片湯劑和配方顆粒的藥效比較結(jié)果顯示，對于高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的NAFLD 模型小鼠，HGQZ飲片湯劑和配方顆粒均可改善其肥胖癥狀、肝組織病理損傷及脂質(zhì)堆積情況，并可回調(diào)其FBG水平、脂質(zhì)和肝功能指標(biāo)水平，以及葡萄糖、胰島素耐量；且與同質(zhì)量濃度HGQZ飲片湯劑組比較，HGQZ配方顆粒組上述指標(biāo)均無顯著差異，表明二者的改善作用相當(dāng)，即配方顆粒的功效與原方具有一致性。

為進(jìn)一步探究HGQZ飲片湯劑和配方顆粒是否通過相同的作用機(jī)制發(fā)揮藥效，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行血清代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明，HGQZ 飲片湯劑和配方顆粒干預(yù)對NAFLD模型小鼠血清代謝物具有相似的影響（65 種共同差異代謝物）。KEGG富集通路分析顯示，TCA循環(huán)代謝在NAFLD模型小鼠體內(nèi)發(fā)生了顯著變化，且代謝物檸檬酸在小鼠血清中亦發(fā)生了顯著變化。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究，檸檬酸可通過介導(dǎo)AMPK信號通路調(diào)節(jié)代謝來平衡TCA循環(huán)中間產(chǎn)物，調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝以改善TCA 循環(huán)，從而發(fā)揮對NAFLD 的改善作用[16―17]。基于此，本研究對各組小鼠AMPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，HGQZ飲片湯劑和配方顆粒均可顯著上調(diào)AMPK蛋白的磷酸化水平，提示二者抗NAFLD作用的發(fā)揮均與激活A(yù)MPK信號通路有關(guān)。

綜上所述，HGQZ飲片湯劑和配方顆粒的特征成分含量相當(dāng)，對NAFLD模型小鼠的改善作用相似，且其抗NAFLD 作用的發(fā)揮均與激活A(yù)MPK 能量代謝通路有關(guān)。后續(xù)本課題組將進(jìn)一步進(jìn)行臨床驗(yàn)證，以明確兩種劑型在人體內(nèi)的代謝及療效差異，助力中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。