紫花含笑TPS基因家族鑒定及與萜烯類物質代謝關系分析

中圖分類號：S722 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2025）03-0029-10

DOI：10.12403/j.1001-1498.20240247

紫花含笑（MicheliacrassipesY.W.Law）系木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬（Michelia），通常呈小喬木或灌木狀，其花朵生于葉腋處，極香。花瓣呈紫紅色或深紫色，長橢圓形，花被片6枚，花期為4月—5月，果期則在8月—9月[1。紫花含笑作為含笑屬中唯一開紫色花的物種，極具觀賞價值，濃郁的花香常吸引游人駐足。目前，紫花含笑的研究主要集中在傳粉學[2]、育種學[3]、遺傳學[以及花色形成機理[5等方面。然而，其花香形成的分子機制研究仍然空白。

花香是由多種低分子量揮發性化合物的復雜混合物所決定的性狀，對植物吸引昆蟲進行授粉具有重要作用。紫花含笑的揮發性物質主要分布在花器官基本薄壁組織中的顆粒狀內含物和油細胞內。紫花含笑花的揮發性成分主要包括萜烯類、苯丙類/苯類和脂肪酸類3類有機化合物[8。其中，萜烯類化合物在紫花含笑花瓣揮發性物質中含量最高[9]。α-愈創木烯、 β -石竹烯和大根香葉烯B等萜類化合物是紫花含笑花香形成的重要揮發性物質[10]

萜烯合酶（terpenesynthase，TPS）是合成萜類化合物的關鍵酶，決定了萜類化合物的多樣性[11]。TPS直接催化底物香葉酰二磷酸（geranylgeranyldiphosphate，GPP，C10）、法呢基二磷酸（farnesyldiphosphate，FPP，C15）和香葉基香葉基焦磷酸（geranylgeranyldiphosphate，GGPP，C20）合成單萜、倍半萜和雙萜類化合物[12]。單萜和倍半萜是多種植物香氣形成的關鍵物質，TPS基因家族在調控植物香氣形成中發揮重要作用。在不同植物中，TPS基因家族的成員具有特定的功能。在香椿（ToonasinensisRoem.）中，TsTPS18能夠調控石竹烯的合成[13]。在西伯利亞'百合（LiliumSiberia'）中，LiTPS2能夠調控百合關鍵性花香成分芳樟醇、月桂烯和（E）-β-羅勒烯的和合成[14]。在小蒼蘭（Freesiahybrida）中，FhTPS1基因調控小蒼蘭關鍵性花香成分芳樟醇的合成[15]。在海皇牡丹（Paeonia × lemoinei‘High Noon'）中，

PsTPS14基因能夠調控芳樟醇的合成[16]。因此，研究紫花含笑TPS基因的表達模式及與萜烯類物質代謝關系，對揭示其花香形成的分子機理研究具有重要意義。

本研究采用生物信息學方法，結合TPS合成酶的Pfam結構域模型和紫花含笑轉錄本，首次對紫花含笑TPS基因家族進行鑒定，并對候選的TPS家族成員進行了蛋白理化性質、系統進化和保守基序分析等。以期揭示了紫花含笑TPS候選基因在花朵不同生長發育階段的基因表達模式并測定不同發育時期紫花含笑花朵萜烯類物質含量。旨在深人探討TPS基因家族成員在紫花含笑花香合成代謝中的關鍵作用，為未來相關研究提供重要的候選基因。

材料與方法

1.1 材料

實驗材料為保存于杭州富陽的1株8年生紫花含笑。于2023年3月一4月，分6個不同時期采集生長良好、無病蟲害、無機械損傷的紫花含笑花朵，即時期I（花芽較小，萼片為綠色），時期Ⅱ（花芽進一步膨大，萼片為黃褐色）、時期I（萼片未脫落、花被片成紫色）、時期IV（萼片尚未完全脫落、花被片露出）、時期V（萼片完全脫落、花苞尚未打開）、時期VI（花被片完全展開、花粉脫落）的花朵（圖1）。采集后的花朵用錫箔紙包裹后迅速置于液氮保存， 30min 后轉移至 -80°C 冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1TPS 家族成員的鑒定基于紫花含笑無參轉錄組數據[5，本研究利用HMMERv3軟件，依據TPS蛋白家族的N端和C端的隱馬爾可夫模型（N：PF01397；C：PF03936；http：//pfam.xfam.org/），篩選紫花含笑TPS基因家族候選基因（閾值為 1×e^-5 ）。使用Expasy 網頁在線工具protparam（https：//web.expasy.org/protparam）預測蛋白質的基礎理化性質。

1.2.2 TPS家族保守基序鑒定使用在線工具MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）預測紫花含笑TPS家族蛋白序列的保守基序（Motif）。

1.2.3 TPS家族系統進化樹構建結合擬南芥（Arabidopsis thaliana Heynh.）31個TPS蛋白序列、山蒼子（LitseacubebaPers.）51個TPS蛋白序列、火炬松（PinustaedaL.）5個TPS蛋白序列，水稻（OryzasativaL.）20個TPS蛋白序列和紫花含笑10個候選TPS蛋白序列，使用MEGA11軟件[17]采用最大似然法對紫花含笑TPS家族進行系統發育分析。使用在線工具iTOL（https：//itol.embl.de）繪制系統進化樹，Bootstrap重復次數設置為1000次。

1.2.4GC-MS檢測不同發育時期紫花含笑花朵揮發性物質稱取 1～39 樣品置于 15mL 頂空瓶中，加入 50μL 癸酸乙酯溶液（ 10μg?mL^-1 ）作為內標，頂空螺紋密封。樣品在 35^°C 烘箱中平衡5min后，將氣相色譜-質譜聯用儀（Agilent6890N-5975B）萃取頭插入頂空瓶，在樣品上空吸附 43min ，最后在GC-MS進樣口于 220^°C 下解吸 5min 。色譜柱采用DB-5MS（ 60m× 0.25mmID×0.25μm ）。使用氣相色譜-質譜聯用技術進行分析，樣品首先在 50^°C 下進行 2min 的恒溫處理，然后以 3^°C?min^-1 的速度升溫至80^°C ，并保持 2min 。隨后以 5^°C?min^-1 的速度升溫至180^°C ，保持1min；之后以 10^°C?min^-1 的速度升溫至 230°C 并保持 5min ，最后以 20^°C?min^-1 的速度升溫至 250°C 并保持 4min 。在此過程中，進樣口溫度設置為 220^°C ，脈沖不分流，載氣為高純度氮氣（ 99.999% ），柱流速為 1.5mL?min^-1 。離子源溫度設定為 230°C ，色譜-質譜接口溫度設定為 250‰ ，離子化方式為EI，電子能量為 70eV 。掃描范圍設置為 50～500m?z^-1 。結果檢索NIST20（ National Institute of StandardsandTechnology20）標準譜圖庫定性分析。處理后的數據使用CAS號查詢化學物質的中文名稱，獲得化合物定性結果[18]。使用內標法對待測物質進行定量。參考張騰旬的方法進行計算[19]。計算公式如下

式中， ω₁ 為目標組分質量分數 I（|J9^?g^-1） M₂ 為內標物質質量/ug、 M_☉ 為樣品質量/g、 S₁ 為待測物質峰面積、 S₂ 為內標物質峰面積。

通過在線數據庫 perflavory （http：//www.perflavory.com）、 chemicalbook（https：//www.chemicalbook.com）、femaflavor（https：//www.femaflavor org/flavor-library）查找時期IV、V含量前 1% 化合 物的香氣類型。

1.2.5qRT-PCR分析根據前期觀察發現紫花含笑在發育時期IV和V花香濃郁，并結合花香物質聚類結果提取紫花含笑在發育時期I、I、IV和V花朵的總RNA（RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒DP441，天根，北京）。利用Nanodrop2000/2000C超微量分光光度計檢測RNA的濃度和質量，并通過瓊脂糖凝膠電泳分離總RNA，根據rRNA的18S和28S判斷RNA完整性。使用完整性好且無蛋白和DNA污染的RNA樣本用于后續實驗。利用PrimeScriptTMRTMasterMix（RR036A，Takara寶日醫生物技術，北京）合成cDNA第一條鏈，用于熒光定量PCR反應。使用SPDE軟件[20]批量設計定量引物（表1），引物設計在TPS基因的非保守區域，擴增片段長度在 100～200 bp之間。使用QuantStudio7Flex實時熒光定量PCR儀（ThermoFisherScientific，美國）進行定量PCR試驗。以紫花含笑actin基因為內參基因。反應體系和擴增程序按照定量試劑盒TBGreenPremixExTaqTMI（TliRNaseHPlus）（RR820A，Takara寶日醫生物技術，北京）說明書進行。每個樣品3次生物學重復，4次技術重復。使用 2^-ΔΔCτ 方法[21]計算TPS基因的相對表達量。使用R軟件進行單因素方差分析。

1.2.6TPS表達水平與萜烯類物質相關性分析使用R軟件中的cor函數對qRT-PCR分析獲得的TPS基因相對表達量和GC-MS檢測獲得的萜烯類物質質量分數進行Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 TPS基因家族成員鑒定

基于無參組裝的紫花含笑轉錄數據，鑒定到10個TPS候選基因家族成員。TPS基因家族成員編碼蛋白分子質量為57810.20＼～113803.45Da，編碼氨基酸殘基數為511＼～987，等電點為8.64～10.33 ，全部為堿性蛋白，不穩定指數為 ，全部大于40，脂肪族指數為 ，親水性為0.078～0.399（表2）。

2.2 TPS家族保守基序分析

在紫花含笑TPS候選萜烯合成酶中預測到

2.3 TPS家族的系統進化樹

TPS家族可以分為7個亞家族：TPS-a、TPS-b、 TPS-c、 TPS-d、 TPS-e/f、 TPS-g 和TPS- ?h^[22] 。TPS-a、TPS-b 和 TPS-g 亞家族存在于被子植物中，TPS-d亞家族存在于裸子植物中，而TPS-h亞家族則存在于石松類植物中[23]。基于系統進化分析發現，10個TPS家族成員分別聚類到已知功能的TPS-a、TPS-b和TPS-e/f亞家族（圖3）。 C12342.4、C12342.3、C31944.0、C25854.0和C25854.1位于TPS-a亞家族成員所在的分支，說明這5個基因可能參與紫花含笑倍半萜類物質的合成。其中C12342.4、C12342.3、C31944.0進化關系較為相近，C25854.0與C25854.1進化關系上也較為相近。然而，前者和后者的進化關系相對較遠，說明他們在合成萜烯類物質的功能上可能差異較大。C41348.3、C41348.6、C40582.0位于TPS-b亞家族成員所在的分支，說明這3個基因可能參與紫花含笑單萜類物質的合成。其中，C41348.3、C41348.6與C40582.0進化關系較遠。C31983.0和C34060.1位于TPS-e/f亞家族成員所在的分支，說明這兩個基因可能與單萜、倍半萜、二萜和激素的合成有關。

2.4 不同時期紫花含笑花器官TPS基因家族的表達水平分析

花香在時期IV和V最為濃郁，TPS基因在這段時期的表達變化與萜烯類物質含量上升和花香形成密切相關。本研究檢測到4個TPS基因在花香最濃郁的時期V表達量上升。其中，C41348.6、C41348.3在時期V的表達量顯著高于其它3個時期；C40582.0和C31983.0在時期V的表達量均高于其它3個時期，但差異不顯著。因此推斷萜烯類物質含量在時期V上升與C41348.6、C41348.3有關，而可能與C40582.0、C31983.0有關。C12342.4和C25854.0表達量在時期IV達到最低，隨后在時期V上升，但在時期IV、V的表達量總體低于時期I、I。這兩個基因的回升也暗示了它們在花香形成過程中可能存在潛在作用。C12342.3、C25854.0、C25854.1、C31944.0表達量在時期IV、V下降。推測這些基因主要負責紫花含笑開花前期的萜烯類物質的合成（圖4）。

2.5 不同時期紫花含笑花器官中萜烯類物質含量測定分析

本實驗共檢測到156種揮發性物質（詳細數據未列出），其中萜烯類物質最多（66種），含量變化 60.743%～87.386% ；其次為酯類物質（37種），含量變化 2.319%～26.414% ；雜環類物質15種，含量變化 0.299%～16.252% ；醛酮類有11種，含量變化 0.666%～2.233% ；烷烴有9種，含量變化 0～0.336% ；炔烴和烯烴（不包含萜烯）6種，含量變化 0.084%～0.716% ；芳香烴類5種，含量變化 0.641%～1.517% ；醇類物質5種，含量變化 0～2.462% ；羧酸類2種，含量變化 0～0.171% （表3）。在紫花含笑花朵不同發育時期，萜烯類物質的含量均最高，而雜環類物質含量的波動較大，表現較高的不穩定性。酯類物質的含量變化也較大，在時期IV和V有所增加（圖5）。在時期IV，檢測到10種甜果香型香氣物質，包括 β 欖香烯、羅勒烯、 a. 石竹烯、A-羅勒烯、 β 石竹烯、α-蒎烯、（1S，4S，4aR）-1，6-二甲基-4-異丙基-1，2，3，4，4a，7-六氫萘、「-杜松烯、（E）-α-香檸檬烯、β -華澄茄油烯。其中，A-羅勒烯、α-石竹烯、羅勒烯、卡地那二烯在時期IV含量顯著增加。在時期V，檢測到8種甜果香型香氣物質，包括 β 欖香烯、 a. 蒎烯、α-石竹烯、δ-欖香烯、 β -華澄茄油烯、羅勒烯、（E）-α-香檸檬烯、右旋萜二烯為甜香型，其中 β -欖香烯、α-石竹烯、δ-欖香烯含量在時期V顯著增加。因此，推測A-羅勒烯、α-石竹烯、羅勒烯、卡地那二烯是含笑花香在時期IV形成的關鍵物質， β -欖香烯、α-石竹烯、δ-欖香烯是含笑花香在時期V形成的關鍵物質。

2.6 TPS相對表達量與萜烯類物質含量的相關性 分析

相關性分析結果表明（圖6），C31983.0的表達量在時期V上升且與甜果香型物質 β 欖香烯、δ-欖香烯、α-石竹烯正相關，C41348.6和C41348.3的表達量在時期V顯著性上升且與單萜1，2-二[（E）-丙-1-烯基]環丁烷相關。因此，推測C31983.0可能參與調控紫花含笑甜果香型花香物質形成。C41348.6和C41348.3基因可能與成分

1，2-二[（E）-內-1-烯基]環丁烷合成有關。

3 討論

3.1 紫花含笑TPS基因家族鑒定分析

基于無參轉錄組的測序數據鑒定到10個紫花含笑TPS候選基因，發現TPS家族含有6個Motif，TPS-a亞家族成員含有6個保守基序。TPS-e/f亞家族成員缺少保守基序Motif1、Motif3和Motif5，TPS-b亞家族成員C41348.3缺少Motif3，而其他TPS-b的亞家族成員均含有6個Motif。在參與系統進化樹構建的幾個物種中，紫花含笑TPS基因家族成員與樟科植物山蒼子具有較高的同源性。這表明紫花含笑TPS基因在雙子葉植物中分化較早且可能伴隨樟科和木蘭科植物的分化而分化。由于缺少紫花含笑參考基因組，對于很多轉錄本，通過無參轉錄組組裝的方法無法獲得全長轉錄本，這給挖掘TPS基因家族成員方面帶來了一定的限制。

3.2 GC-MS檢測紫花含笑萜烯類物質

萜烯類化合物代表了自然界發現的最大的自然產物家族，用處廣泛可作為香料、藥品、燃料[24]本研究測得揮發性物質中萜烯類物質含量最高這一點與袁婕俐的研究相同[。但是由于該實驗樣品為紫花含笑的整個花器官且樣品品種和樣品生境不同因此主要的萜烯類揮發性物質與袁婕俐的研究結果存在差異。甜果香型物質A-羅勒烯、α-石竹烯、羅勒烯、卡地那二烯含量在時期IV增加，這些物質有可能與時期IV的特征性果香味形成有關。甜果香型物質 β? -欖香烯、α-石竹烯、δ-欖香烯在時期V含量增加，這些物質有可能與時期V的特征性果香味形成有關。在YongYubing研究[1測得多種花香成分中鑒定到的兩種關鍵香氣貢獻成分α-蒎烯、 β -石竹烯與本實驗相同，本實驗中甜果香型物質 β -欖香烯在時期IV、時期V含量較高，而在YongYubing的研究中未見報道。

3.3 qRT-PCR和萜烯類物質的相關性分析

C31983.0在時期V表達量上升且與3種甜果香型物質正相關，C31983.0可能參與調控紫花含笑甜果香型物質形成。TPS產物具有多樣性，不同反應條件下能夠催化產生不同萜類化合物[25]。然而C31983.0具體參與哪種物質合成仍需進一步深入研究。參與單萜合成的C41348.6和C41348.3僅在時期V特異性高表達且僅與單萜1，2-二[（E）丙-1-烯基]環丁烷弱相關，而時期IV單萜類物質含量上升，因此相關候選基因的功能和揮發物質香氣類型有待進一步深入研究。

GC-MS檢測顯示，紫花含笑的花朵揮發性成分中含有66種萜烯類物質，然而基于紫花含笑的無參轉錄組測序數據，本實驗只鑒定到了10個紫花含笑TPS基因家族成員。隨著三代基因組測序技術的普及和基因組組裝成本的下降，未來有望以更低的成本完成紫花含笑基因組測序和組裝。借助高質量的參考基因組，未來可能發現更多萜烯合成酶基因，以深入探究TPS基因的功能

4結論

本研究基于紫花含笑無參轉錄組測序數據，采用生物信息學方法鑒定到10個TPS基因并預測TPS蛋白質性質。對10個基因構建系統進化樹發現紫花含笑TPS基因家族分化為了3個基因亞家族，TPS-e/f基因亞家族成員缺少Motif1、Motif3、Motif5，TPS-b基因亞家族成員C41348.3缺少Motif3，其余TPS基因含有6個Motif。通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用技術和風味查詢發現A-羅勒烯、α-石竹烯、羅勒烯、卡地那二烯這幾種甜果香型物質可能與紫花含笑花在時期IV的果香形成有關。 β -欖香烯、α-石竹烯、δ-欖香烯這幾種甜果香型物質可能與紫花含笑花在時期V的果香形成有關。

結合qRT-PCR分析不同時期TPS基因表達水平和萜烯類代謝含量變化關系發現C31983.0的表達量在時期V上升且與甜果香型物質 β. 欖香烯、δ-欖香烯、α-石竹烯正相關，該基因可能參與調控紫花含笑甜果香型物質 β -欖香烯、δ-欖香烯、α-石竹烯的形成。C41348.6和C41348.3在時期V特異性高表達且與單萜1，2-二[（E）-丙-1-烯基]環丁烷相關，C41348.6和C41348.3基因可能與成分1，2-二[（E）-丙-1-烯基]環丁烷合成有關。通過挖掘紫花含笑TPS基因家族成員信息，為探索紫花含笑花香成分合成關鍵基因及功能驗證奠定了理論基礎。

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JI Hao-nan12，XIAO Yu-guang2，NIU Xiao-yun1， ZHANG Zhi-long2，LIU Jun2，JIANG Jing-min2， DIAO Shu2

（1.CollgeofLandscapendTourism，HebeiAgriculturalUniversityaoing0，HeBeiCina;2.esearchite of SubtropicalForestry，ChineseAcademyofForestry，HangZhou31140o，ZheJiang，China;3.GuangxiGaofengState Owned ForestFarm，NanNing530010，GuangXi，China）

Abstract：[Objective]Terpenesare the substances with the highest number and content of volatile components in Michelia crassipes.This study aims to systematically identify TPS gene family members in M. crassipes，andelucidate their functional roles interpenoid metabolismand floral aroma formation.[Methods]Basedonthe transcriptome sequencing dataof M.crassipes，theTPS genesfamilyof M.crassipes wasidentifiedby bioinformatics methods.Thedata obtained by qRT-PCR， headspacesolid-phase microextractionand gas chromatography-mass spectrometry were used to analyze the relationship between TPS genes expression level and terpene metabolic content in different stages.[Results] A total of 10 TPS memberswere identified fromthetranscriptomedataofM.crassipes.Themolecularweightof theprotein encodedby the TPS genes family members ranged from57810.20 to 113803.45 Da，and the number of aminoacids encoded ranged from511to987.The resultsof phylogeneticanalysis showed that theTPS gene familyof M.crassipes was divided into three gene subfamilies.The TPS-e/f gene subfamily members lackedMotif1，Motif 3and Motif5，andtheTPS-a gene subfamilymemberscontained 6Motifs.TheTPS-b gene subfamily member C41348.3 lacked Motif 3 and the remaining members contained 6 Motifs.TPS genes C41348.6 and C41348.3 were significantly highly expressed in stage V，while C31983.0 and C40582.0also exhibited high expressionatthisstage.In terms of terpenecontent，A-ocimene，α-Caryophyllene， β -Ocimene，and cadinadiene were notably increased at stage IV.The content of δ-elemene，α- Caryophyllene， β -Ocimene increased in stage V.The correlation between gene expressionand terpene content wasanalyzed.The TPS-b gene subfamily members C41348.3and C41348.6 were correlated with thesynthesis of the 1，2-bis[（E）-prop-1-enyl] cyclobutane.C31983.0 in the TPS-e/f gene subfamilyof M.crassipes was positively correlated with three types of sweet fruit aroma compounds.[Conclusion] The compounds A-ocimene，α-Caryophylene，δ-elemene，and cadinadiene，may contribute to the fruity floral aroma characteristic ofM. crassipes atstage IV，while β -elemene，α-caryophyllene，andδ-elemeneare likely involved in aroma formation at stage V.TPS genes C41348.6and C41348.3 may participate in the biosynthesisof1，2-bis[（E）-prop-1-enyl] cyclobutane，whereas C31983.0appears to regulate the formation of sweet fruity aroma-related compounds such as β -elemene，α-caryophyllene，and δ-elemene. Overall， theTPSgene family playsacrucial rolein terpene biosynthesis.Thisstudy providesanin-depth characterizationof TPS gene familymembers inM.crasspes，offering a theoretical foundation for future research on the key genes involved in terpenoid biosynthesis inits petals.

Keywords：Michelia crassipes;TPS genes family;Bioinformatics;Expressionanalysis; Volatile terpenoids

（責任編輯：張研）