東北紅豆杉不同器官和組織中紫杉醇含量的季節(jié)性變化規(guī)律

紫杉醇（Paclitaxel，簡(jiǎn)稱PT，商品名Taxol）是最初從短葉紅豆杉（Taxusbreuifolia）中提取的四環(huán)二萜類化合物，為紅豆杉屬植物的一種重要天然次級(jí)代謝物，因其低毒性、高效力和廣譜抗癌活性，成為目前已發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)秀的天然廣譜抗癌藥物，通過干擾微管蛋白解聚，阻止微管動(dòng)態(tài)重組，導(dǎo)致細(xì)胞無法順利完成有絲分裂，最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，這種機(jī)制使紫杉醇對(duì)快速分裂的癌細(xì)胞特別有效[1-4]。作為臨床治療乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤的重要藥物，其獨(dú)特作用機(jī)制不僅提升了化療效果，還推動(dòng)了天然產(chǎn)物研究和藥物創(chuàng)新開發(fā)。隨著市場(chǎng)需求增長(zhǎng)，野生紅豆杉遭受嚴(yán)重采伐，資源日趨匱乏。由于紫杉醇提取率低、成本高昂，這種依賴天然資源的生產(chǎn)方式難以持續(xù)。傳統(tǒng)提取方法主要依賴野生紅豆杉，不僅效率低下，還需大量砍伐以獲取足夠藥物成分，導(dǎo)致物種瀕危和生態(tài)破壞[5-8]。其次，化學(xué)合成和半合成方法雖減少了對(duì)野生資源的依賴，但存在成本高、工藝復(fù)雜且易造成環(huán)境污染等問題。從頭合成紫杉醇產(chǎn)率僅 2.7% ，難以滿足工業(yè)化需求。半合成方法雖可通過10-去乙酰巴卡丁III（10-DeacetylbaccatinIII，10-DAB）合成紫杉醇，但仍需紅豆杉枝葉作原料，加之紅豆杉生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，10-DAB含量?jī)H占干質(zhì)量的 0.1% ，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)[9-10]。可見，如何在保護(hù)生態(tài)的前提下實(shí)現(xiàn)紫杉醇的高效、規(guī)模化生產(chǎn)，是當(dāng)前亟待解決的科研難題。因此，研究東北紅豆杉中紫杉醇的分布和積累規(guī)律及其在不同器官組織中的季節(jié)性變化，對(duì)提高其可持續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。

植物次生代謝產(chǎn)物的季節(jié)性變化主要表現(xiàn)在周期性變化、峰值時(shí)間、振幅差異、環(huán)境因素影響和生長(zhǎng)階段相關(guān)性等方面。首先，次生代謝產(chǎn)物的含量隨季節(jié)更替的周期性波動(dòng)，如銀杏葉中的黃酮類化合物春季含量較低，夏季增加，秋季達(dá)到峰值，冬季則降低，這與其生長(zhǎng)周期和光合作用有關(guān)[11]。其次，不同植物次生代謝產(chǎn)物含量峰值時(shí)間各異，如紅景天苯乙醇昔類化合物夏季最高，冬季最低，可能是應(yīng)對(duì)夏季強(qiáng)光和高溫的結(jié)果[12]第三，次生代謝產(chǎn)物含量振幅的顯著差異[13-14]，如檸檬香茅中檸檬醛年變化幅度超過 30%^[15] 。第四，環(huán)境因素（如光照、溫度、降水量）直接影響次生代謝產(chǎn)物的含量，如迷迭香酚類物質(zhì)[16]和薄荷醇[17]在夏季光照充足時(shí)達(dá)到最高值。第五，植物生長(zhǎng)階段也顯著影響代謝產(chǎn)物含量，在開花期和結(jié)果期，某些代謝產(chǎn)物含量達(dá)到峰值，以支持植物的繁殖和防御功能，如羅勒在開花前其次生代謝物芳樟醇含量最高，而開花后逐漸降低[18]。第六，環(huán)境脅迫（如干旱、病蟲害）會(huì)刺激植物增加次生代謝產(chǎn)物的合成，例如干旱條件下葡萄藤會(huì)提高單寧和花青素含量[19-21]。這些變化規(guī)律的研究對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)管理具有重要指導(dǎo)意義。

東北紅豆杉（TaxuscuspidataSieb.etZucc.）隸屬于紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）的第三紀(jì)子遺物種，其自然分布區(qū)包括中國(guó)東北、日本北海道和九州、朝鮮新義州以及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)島嶼。在中國(guó)東北三省，溫帶大陸季風(fēng)氣候帶來的四季分明、冬寒夏潤(rùn)的特點(diǎn)，加之從山麓到中高海拔的多樣化地形，以及針闊混交的原始與次生林生態(tài)系統(tǒng)，為東北紅豆杉提供了理想的生長(zhǎng)環(huán)境。然而，作為東北地區(qū)唯一的極小種群物種，東北紅豆杉因生境破碎化和分布不連續(xù)性而被列為中國(guó)I級(jí)珍稀保護(hù)植物[22]。這一物種因其木材、工業(yè)價(jià)值及其特有的抗癌活性成分一紫杉醇而備受關(guān)注。目前，關(guān)于其不同器官和組織中紫杉醇含量的季節(jié)性變化規(guī)律研究仍顯不足。本研究致力于系統(tǒng)闡明東北紅豆杉不同器官組織中紫杉醇含量的季節(jié)性動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，旨在為優(yōu)化采集策略、提升紫杉醇產(chǎn)量及促進(jìn)該珍稀樹種的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。研究采用兩級(jí)采樣策略，包括春（4月15日）、夏（7月15日）、秋（10月15日）冬（1月15日）的基礎(chǔ)季節(jié)性采樣，以及生長(zhǎng)旺盛期（4月至10月）每月15日的加密采樣。通過對(duì)葉片、樹皮、根系、木質(zhì)部和果實(shí)等器官組織進(jìn)行采集，運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)開展定量分析，全面追蹤紫杉醇含量的季節(jié)性波動(dòng)和生長(zhǎng)期微觀變化，以揭示紫杉醇在植物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布特征及環(huán)境因子對(duì)其積累的影響機(jī)制，最終目標(biāo)是在醫(yī)藥需求與生態(tài)保護(hù)之間尋求平衡點(diǎn)，為該珍貴藥用植物資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇15棵生長(zhǎng)狀況良好的東北紅豆杉（樹齡20～30 a，株行距 1.0×1.5m ，樹高 1.6m ，冠幅1.3m 作為試驗(yàn)材料，采樣地點(diǎn)位于丹東市金溝科技生態(tài)園（東經(jīng) 124^°08^′～124^°30^′ ，北緯39^°59^′～40^°23^′） 。按春、夏、秋、冬季度（分別為4、7、10、1月15日）進(jìn)行基礎(chǔ)采樣，生長(zhǎng)旺盛期（4一10月）增加為每月15日采樣，同步記錄環(huán)境參數(shù)（表1）。系統(tǒng)采集各器官和組織：葉片（樹冠中層4個(gè)方位各取5片健康葉）、樹皮（胸徑處環(huán)狀取樣至形成層）、木質(zhì)部（ 5mm 生長(zhǎng)錐取樣，區(qū)分邊材和心材）、根系（樹冠投影外 0.5m 處取20cm×20cm×30cm 土柱，收集 2～5mm 吸收根）及成熟果實(shí)（每株隨機(jī)取10顆，分離果肉、種皮、胚乳）。多株混合樣用于分析。每次采樣保持位置和方法一致，取 50～100g 鮮質(zhì)量樣本，液氮速凍后 -80°C 保存。每季從15株中選取5株為核心監(jiān)測(cè)株（3組），每棵樹的每個(gè)器官和組織均作為獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)。

1. 2 紫杉醇含量測(cè)定

紫杉醇含量測(cè)定采用高效液相色譜（HPLC）法。將東北紅豆杉樣品各器官和組織烘干打粉，過100目篩，稱取 1g 粉末（精確到 0.1mg 置帶塞試管中，加入 15mL75% 甲醇，浸泡 |0.5h 后超聲提取（ （500W，40Hz ） 40min ，離心（5000r/min，5min）^[23] 。濾渣重復(fù)提取兩次，合并3次濾液于 50mL 容量瓶中， 75% 甲醇定容， 0.45μm 濾膜過濾，制得供試品溶液。稱取 10mg 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品 99% 于 100mL 容量瓶中，加 60mL 甲醇超聲溶解 15min ，用甲醇定容至刻度線，得到濃度為 0.099mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。色譜條件為： 4.6mm×250mm×5μm 色譜柱（Inert-silODS-HLC18）;流動(dòng)相為乙腈一水 （42：58） ；流速 1.0mL/min ；柱溫 40°C ；檢測(cè)波長(zhǎng) 226nm ；進(jìn)樣量 10μL 。使用不少于5個(gè)濃度梯度的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 （R²gt;0.99） 。每天10：00采用便攜式光合熒光測(cè)量系統(tǒng)（LI-6800，LI-COR公司，美國(guó)）測(cè)定東北紅豆杉凈光合速率；采用可溶性糖試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國(guó)]檢測(cè)可溶性糖含量[24]。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法評(píng)估方法準(zhǔn)確性。

1.3紫杉醇生物合成途徑關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子 的表達(dá)分析

選擇紫杉醇生物合成途徑中兩個(gè)關(guān)鍵限速酶：紫杉烷合酶（taxadienesynthase，TS）和 3^′–N– 去苯甲酰紫杉醇N-苯甲酰轉(zhuǎn)移酶（ 3^′. -N-debenzoylt-axol N-benzoyltransferase，DBTNBT）[25]。 TcTS 基因負(fù)責(zé)催化初始環(huán)化反應(yīng)，催化該途徑的第一個(gè)提交步驟，將香葉基焦磷酸（geranylgeranyldiphosphate，GGPP）環(huán)化為紫杉二烯，這一步驟構(gòu)建了紫杉醇的基本碳骨架，是整個(gè)合成途徑的重要調(diào)控點(diǎn)；而TcDBTNBT則催化途徑末端的關(guān)鍵步驟，通過將乙酰基轉(zhuǎn)移到10-去乙酰基紫杉醇II（10-deacetylbaccatin II，10-DAB）的C-10位置，最終形成具有生物活性的紫杉醇分子，這兩個(gè)酶的表達(dá)水平和活性直接影響紫杉醇的產(chǎn)量，因此它們的時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)特征對(duì)理解紫杉醇的生物合成調(diào)控具有重要意義。此外，東北紅豆杉中的轉(zhuǎn)錄因子MYB3和MYC2是調(diào)控紫杉醇生物合成的關(guān)鍵調(diào)控因子。其中，MYB3屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，主要參與次生代謝產(chǎn)物的生物合成調(diào)控，能夠通過與啟動(dòng)子區(qū)域特定序列的結(jié)合來調(diào)控下游基因的表達(dá)[26]；MYC2則是一個(gè)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子[27]，作為茉莉酸信號(hào)通路的核心調(diào)控因子，在植物防御反應(yīng)和次生代謝產(chǎn)物合成中發(fā)揮重要作用。這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能通過協(xié)同作用來調(diào)控紫杉醇合成相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響紫杉醇的積累。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，系統(tǒng)追蹤限速酶基因和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的季節(jié)性變化模式，深入揭示紫杉醇生物合成的分子調(diào)控機(jī)制[28-29]。采用 TR-Izol@試劑提取總RNA，使用NanoDropTM2000分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格樣品經(jīng)DNaseI處理去除基因組DNA污染后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)特異性引物及內(nèi)參基因引物（表2）。以TS為例，PCR反應(yīng)體系 （25μL ” 10× Buffer 2.5μL ，正反向引物各0.8μL ， dNTPs 1μL ，DNA 模板 0. 5μL ，LA-Taq酶 0.8μL ，加 至 25μL ;PCR擴(kuò)增程序： 95^°C 預(yù)變性 6min ；35個(gè)循環(huán)（ 95^°C 變性60s，55^°C 退火 45s，72^°C 延伸80s）; 72°C 延伸10min 。qRT-PCR反應(yīng)體系 （20μL）：2×SYBR Green PCR Master Mix10μL ，正反向引物各0.4μL ，cDNA 模板 2， 0μL ， ddH₂O 7. 2μL qRT-PCR反應(yīng)程序： 95^°C 預(yù)變性 3min ；40個(gè)循環(huán) （95^°C20s，60^°C45s）^[30-32] 。采用 2^-ΔΔct 方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1. 4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用MicrosoftOfficeExcel2019和Statistica11軟件完成。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)（Shapiro-Wilk檢驗(yàn)）和方差齊性檢驗(yàn)（Levene檢驗(yàn)），在滿足這兩個(gè)前提條件后進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA）。當(dāng)方差分析結(jié)果顯示存在顯著性差異時(shí)（ （Plt;0.05） ，采用Tukey'sHSD法進(jìn)行多重比較。所有試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，按“1.1\"中設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，數(shù)據(jù)以“平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤”（Mean ± SE）表示[33]

2 結(jié)果與分析

2.1東北紅豆杉不同組織中紫杉醇含量的月度變化趨勢(shì)

由于生長(zhǎng)周期、代謝活動(dòng)以及溫度、光照、土壤養(yǎng)分等環(huán)境因素的影響，東北紅豆杉不同組織中紫杉醇含量的月度變化趨勢(shì)表現(xiàn)出顯著差異（圖1），其中樹皮的紫杉醇含量全年最高，9月達(dá)到峰值，約 1.4mg/g ，并在10月后略有下降；葉片和根系次之，同樣在9月達(dá)到峰值，分別約為0.8mg/g 和 0.7mg/g ，隨后略有波動(dòng)；果實(shí)的紫杉醇含量呈現(xiàn)出獨(dú)特的變化趨勢(shì)，在9月果實(shí)成熟期顯著上升至約 1.0mg/g ，但在10月迅速下降，呈現(xiàn)成熟期的特征性變化；邊材和心材含量最低，全年穩(wěn)定在 0.05～0.3mg/g ，變化幅度較小。整體來看，環(huán)境因素和季節(jié)變化對(duì)紫杉醇的生物合成和分布有顯著影響，其中9月是東北紅豆杉各組織紫杉醇含量積累的關(guān)鍵時(shí)期。

2.2東北紅豆杉葉片組織中紫杉醇含量與生理指標(biāo)月度變化關(guān)系

以葉片為例，通過對(duì)東北紅豆杉全年生理指標(biāo)的分析，凈光合速率和紫杉醇含量呈現(xiàn)顯著的此消彼長(zhǎng)關(guān)系（圖2）：凈光合速率從1月的低谷期（4.9）隨著溫度回升和光照增加逐步上升，經(jīng)過春季穩(wěn)步增長(zhǎng)（3月：8.8，4月：13.6，5月：17.7），于7月達(dá)到年度最高值（22.6），隨后伴隨著秋季溫度降低和光照減弱而逐漸下降，最終在12月降至全年最低值（3.8）；紫杉醇含量則呈現(xiàn)雙峰曲線特征，在4月（0.7）和9月（0.8）出現(xiàn)高峰，而在光合作用最旺盛的7月達(dá)年度低谷（0.4）；可溶性糖含量與紫杉醇含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，可溶性糖含量的變化幅度遠(yuǎn)大于紫杉醇含量，其中可溶性糖含量最高值出現(xiàn)在12月份 （41.8mg/g） ，是最低值8月份 （7.1mg/g） 的5.9倍，兩個(gè)極值相差34.7mg/g ；而紫杉醇含量的最高值出現(xiàn)在9月份（0.8mg/g） ，是最低值1月份 （0.4mg/g） 的1.8倍，兩個(gè)極值相差 0.4mg/g 。兩者在全年的變化趨勢(shì)并不完全同步，可溶性糖含量呈現(xiàn)明顯的“U\"型變化（冬季高、夏季低），而紫杉醇含量則在9月達(dá)到峰值后逐漸下降，顯示出不同的季節(jié)性變化特征。

2.3東北紅豆杉不同組織紫杉醇合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)月度變化趨勢(shì)

TcTS和TcDBTNBT兩個(gè)關(guān)鍵基因在各組織中表現(xiàn)出顯著的時(shí)空特異性表達(dá)特征（圖3）。從組織分布看，基因表達(dá)水平由高到低依次為：樹皮 gt; 果實(shí) gt; 葉片 gt; 邊材/心材。樹皮中兩基因均在9月達(dá)到峰值，分別是同期心材的3.3倍和2.9倍，與紫杉醇的組織富集特性一致。果實(shí)在成熟期（9一10月）表達(dá)活性較高，9月份TcTS表達(dá)量達(dá)到樹皮的 90% ，這可能與防御功能和種子保護(hù)有關(guān)。葉片表達(dá)水平在生長(zhǎng)季節(jié)（4一9月）呈上升趨勢(shì)， TcTS 表達(dá)量增幅達(dá) 30.9% ，與光合代謝活性變化相關(guān)。心材和邊材表達(dá)水平全年較低且波動(dòng)小，即使在高峰期（9一10月），邊材的TcTS表達(dá)量也僅為樹皮峰值的 42.5% ，僅在秋季出現(xiàn)小幅上升。時(shí)間維度上，基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯季節(jié)性：冬季 （12-1 月）普遍較低，春季逐漸上升，秋季9月達(dá)年度峰值。以樹皮為例， TcTS 表達(dá)量從冬季低點(diǎn)（1月：6.2）到春季（4月：6.6，增幅 4.8% ），最終在秋季達(dá)到峰值（9月：7.8，較春季增幅 18.4% ）。

2.4東北紅豆杉不同組織紫杉醇合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)月度變化趨勢(shì)

本研究分析了轉(zhuǎn)錄因子MYB3和MYC2在東北紅豆杉不同組織中的表達(dá)情況，以及它們與紫杉醇生物合成的促進(jìn)和抑制關(guān)系（圖4）。MYB3作為紫杉醇合成的正向調(diào)控因子，在樹皮、葉片和根系中的表達(dá)量隨月份波動(dòng)，在生長(zhǎng)旺盛期（5一9月）表達(dá)量逐漸升高，9月達(dá)到高峰。在休眠期（1月和12月），由于低溫脅迫和光照減少，MYB3的表達(dá)水平顯著降低（分別為0.5和0.5）。樹皮中MYB3的表達(dá)量最高（9月達(dá)4.6），顯著高于其他組織：比根系高1.1倍，比邊材高2.6倍，比心材高2.8倍，凸顯了樹皮在紫杉醇合成中的重要性。相比之下，作為負(fù)調(diào)控因子的MYC2在葉片中于生長(zhǎng)旺盛期（7月）達(dá)到峰值（0.9），此時(shí)植物需要大量能量支持營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，通過MYC2的高表達(dá)抑制紫杉醇等次生代謝產(chǎn)物的合成。心材的MYC2表達(dá)量（1.2）比葉片高1.4倍，比樹皮高2倍，比根系高1.4倍，反映了植物器官間的代謝平衡。在冬季休眠期（1月和12月），MYC2的表達(dá)降至全年最低水平（分別為0.3和0.3），這與MYB3的表達(dá)模式一致，反映了植物在嚴(yán)寒條件下整體代謝活動(dòng)的顯著降低。這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)波動(dòng)表明，植物通過調(diào)節(jié)MYB3和MYC2的表達(dá)水平來平衡生長(zhǎng)發(fā)育與次生代謝，其拮抗調(diào)控作用直接影響了不同組織中紫杉醇的積累。

3討論

研究東北紅豆杉紫杉醇含量的季節(jié)性變化規(guī)律，有助于揭示其生物合成的時(shí)空分布特征和積累機(jī)制，為確定最佳采收時(shí)間和部位提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)對(duì)種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、品種選育和可持續(xù)利用具有重要指導(dǎo)意義，有利于瀕危物種保護(hù)和藥用需求滿足。

東北紅豆杉不同組織中紫杉醇含量的月度變化趨勢(shì)差異主要源于其生理功能：樹皮作為主要合成儲(chǔ)存場(chǎng)所，具有發(fā)達(dá)的韌皮部，且在秋季進(jìn)入休眠前次生代謝活躍，紫杉醇含量9月達(dá)到峰值（1.4mg/g） ；葉片和根系次之 （0，8mg/g 和0.7mg/g） ，是因?yàn)槿~片具有較強(qiáng)的代謝能力和次生代謝物合成能力，而根系則需要防御地下病原微生物；果實(shí)的紫杉醇含量變化最為獨(dú)特，在發(fā)育初期含量較低，隨著果實(shí)的發(fā)育逐漸增加，到9月果實(shí)成熟期急劇上升至 1.0mg/g ，這與種子發(fā)育后期次生代謝物的快速積累有關(guān)，可能是為了保護(hù)種子和調(diào)控種子休眠，而10月后含量迅速下降可能與種子傳播和后熟過程中的代謝轉(zhuǎn)化有關(guān)；邊材和心材含量最低 （0.05～0.3mg/g） 且波動(dòng)小，這與其主要承擔(dān)機(jī)械支撐和運(yùn)輸功能，代謝活性相對(duì)較弱有關(guān)，該結(jié)果與Ginkgobiloba[34]一致，同時(shí)這種組織特異性分布也體現(xiàn)了紫杉醇在植物防御和適應(yīng)性進(jìn)化中的重要作用，為不同組織的合理利用提供了科學(xué)依據(jù)。此外，東北紅豆杉葉片中紫杉醇含量與生理指標(biāo)的月度變化反映了生長(zhǎng)代謝和次生代謝間的季節(jié)性調(diào)控：夏季光合旺盛時(shí)期，碳水化合物優(yōu)先用于基本生長(zhǎng)，如新組織的形成、細(xì)胞分裂和擴(kuò)張等；春秋季不利生長(zhǎng)時(shí)期，則轉(zhuǎn)向合成紫杉醇等次生代謝物以增強(qiáng)抵御能力；冬季則積累可溶性糖提高抗寒性。這種動(dòng)態(tài)平衡反映了植物對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性響應(yīng)，為其栽培和藥用成分定向調(diào)控提供了理論依據(jù)。東北紅豆杉紫杉醇含量則在9月達(dá)到峰值后逐漸下降，這種變化可能與植物的次生代謝和防御機(jī)制有關(guān)，秋季環(huán)境壓力增加促進(jìn)了紫杉醇的合成，該結(jié)果與Melittismelissophyllum一致[35]。這種不同的季節(jié)性變化特征反映了植物在不同時(shí)期對(duì)環(huán)境適應(yīng)的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)其人工栽培和提高活性成分含量具有重要的理論價(jià)值[36]。

東北紅豆杉紫杉醇含量的季節(jié)性變化受基因和轉(zhuǎn)錄因子雙重調(diào)控：關(guān)鍵限速酶基因（TcTS和TcDBTNBT）呈現(xiàn)出顯著的季節(jié)性表達(dá)模式，從冬季低谷（12一1月）開始，經(jīng)春季逐漸上升，9月達(dá)到年度峰值（TcTS較春季增加 18.4% ，這與紫杉醇含量的季節(jié)性變化高度吻合。在轉(zhuǎn)錄因子層面，正向調(diào)控因子的MYB3在生長(zhǎng)旺盛期 （5- 9月）表達(dá)量逐漸升高至峰值（4.6），此時(shí)促進(jìn)紫杉醇的合成積累，而在休眠期（1月和12月）顯著降低（分別為0.5和0.5）；負(fù)向調(diào)控因子MYC2在生長(zhǎng)旺盛期（7月）達(dá)到最高表達(dá)水平（0.9），通過抑制次生代謝來確保植物將更多資源分配用于基礎(chǔ)生長(zhǎng)，在休眠期則降至全年最低（0.3和0.3）。這種轉(zhuǎn)錄因子的動(dòng)態(tài)拮抗調(diào)控確保了東北紅豆杉在不同生長(zhǎng)階段能夠根據(jù)環(huán)境條件和自身需求靈活調(diào)節(jié)代謝方向：在生長(zhǎng)旺盛期，通過MYC2的高表達(dá)抑制紫杉醇等次生代謝產(chǎn)物的合成，將資源優(yōu)先分配給營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)；而在環(huán)境壓力增加的季節(jié)，則通過提高M(jìn)YB3的表達(dá)來促進(jìn)防御物質(zhì)的積累。這種多層次的調(diào)控機(jī)制反映了東北紅豆杉在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的精密適應(yīng)策略，通過基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子活性的季節(jié)性調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)和防御需求的動(dòng)態(tài)平衡與 Yu 等37研究一致。

基于丹東地區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)和調(diào)控機(jī)制研究，東北紅豆杉紫杉醇含量呈現(xiàn)明顯季節(jié)性規(guī)律：生長(zhǎng)旺盛期環(huán)境優(yōu)越（氣溫 15^°C～31^°C 、相對(duì)濕度68%～82% 、光照度 32～45klx. 、土壤溫度 15～ 23^°C ），MYC2高表達(dá)抑制次生代謝；9月環(huán)境壓力增加（氣溫降至 26^°C ，光照度減弱至 $3 2 ＼ ＼mathrm { k l { x } } ＼overrightharpoon { }$ ）時(shí)，MYB3達(dá)峰值（4.6）且關(guān)鍵酶基因表達(dá)顯著提升（較春季增 18.4%） ；休眠期環(huán)境惡劣（氣溫-13°C 、光照度 14～15klx 、土壤溫度一 5°C ）導(dǎo)致代謝減緩，MYB3和MYC2降至最低（O.5和0.3）。這反映了東北紅豆杉通過基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控平衡生長(zhǎng)與防御的環(huán)境適應(yīng)策略。

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Seasonal Variation Patterns of Paclitaxel Content in Different Organs and Tissues of Taxus cuspidata

WANG Dandan，CHEN Jiaxin，ZHANG Yanwen and LI Qiuhong （School of Science，Eastern Liaoning University，Dandong Liaoning118oo3，China）

AbstractTo systematically investigate the seasonal variation patterns of paclitaxel content in different organs and tissues of T .cuspidata and its environmental response mechanisms，this study conducted seasonal sampling and HPLC quantitative analysis of leaves，bark，roots，wood tissues，and fruits， and examined the expression levels of key enzyme genes and transcription factors involved in paclitaxel biosynthesis.Results showed significant differences in paclitaxel content among different tissues （bark gt; fruit gt; leaves gt; roots gt; sapwood gt; heartwood），with bark maintaining the highest content throughout the year and reaching a peak of 1.391mg/g in September;leaves and roots followed，with September peaks of 0.776mg/g and 0.711mg/g ，respectively; fruit content increased to 0.974mg/g during September maturation before rapidly declining; sapwood and heartwood maintained the lowest contents （0.05-0.30mg/g） .Key enzyme genes TcTS and TcDBTNBT showed highest expression in bark，peaking in September at 3.27-fold and 2.94-fold higher than heartwood levels，respectively， while fruits also exhibited high expresson activity during maturation （September-October）.Regarding transcriptional regulation，the positive regulator MYB3 showed gradually increasing expression during the vigorous growth period （May-September），with strongest expression in bark （4. 622 in September）；the negative regulator MYC2 peaked in leaves during the growth period （O.86l），with highest expression in heartwood at approximately twice that of bark，reflecting metabolic balance among organs.Both regulators decreased to their annual lowest levels during winter dormancy，leading to reduced paclitaxel content.In conclusion，T.cuspidata achieves a balance between growth and defense through gene expression and transcriptional regulation during environmental adaptation，providing scientific basis for optimizing collction strategies，improving paclitaxel yield，and promoting sustainable utilization of this rare species.

Key wordsTaxus cuspidata ; Paclitaxel content; Seasonal variation pattern; Transcription factor; Physiological indicators

Received 2025-01-26 Returned 2025-03-18

Foundation item National Natural Science Foundation of China （No.32272757，No.31972363）；Liaoning Provincial Science and Technology Fund Project （No. 2023JH2/101700200）；Liaoning Provincial Department of Education Project（No.JYTMS20230698）.

First authorWANG Dandan，female， master，associate professor. Research area： molecular biology. E-mail ： wangdandansq@ sina. com

（責(zé)任編輯：郭柏壽 Responsibleeditor：GUOBaishou）