梨火疫病生防菌的篩選及抑菌機理初探

庫爾勒香梨是新疆的名優特色水果，香梨產業是新疆重要的支柱產業，具有重要的經濟價值和戰略價值。然而近年來梨火疫病在新疆多地大規模暴發，對新疆乃至全國薔薇科林果業帶來了巨大威脅和風險[]。梨火疫病病原菌解淀粉歐文氏菌（Erwiniaamylovora），可以隨風雨鳥蟲傳播[2，侵染花、葉片、嫩梢、果實、枝干，其中花、嫩枝、幼果易出現變黑、褐色、枯萎等癥狀。掉落的病枝、病果導致病原菌在土壤中存留，土壤中的病原菌可隨灌溉水進行傳播，從根系侵染[3-4]。因此，有必要從樹上和土壤著手進行梨火疫病防控技術研究。目前，對梨火疫病防治以化學農藥為主，但長期使用化學農藥極易使病原菌產生耐藥性[5]，并造成農藥殘留和環境污染。

生物防治具有高效、安全、低毒等特點[6-7]，目前已成為國內外學者研究的焦點。利用生防微生物進行梨火疫病的防治已有報道。Zeller等從不同火疫病寄主植物（蘋果、梨、山楂等）花和葉分離出39株內生細菌，其中發現最有效的菌株為E.h.89，該菌株對花的相對控制率接近 70% 。王俊等[9測試了香梨花上分離的1株解淀粉芽胞桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）對梨火疫病菌的拮抗效果，并利用自行研發的蜜蜂導向盒進行了蜜蜂傳播生防菌防病試驗。結果表明，蜜蜂導向盒 + 生防菌技術在香梨花期可以有效控制由梨火疫菌引起的花腐和枝枯。

為篩選出更多優良的梨火疫病生防菌資源，本試驗采集庫爾勒香梨園枝條，并從伽師縣西梅果園采集土壤樣品，結合實驗室前期篩選得到的2 株具有廣譜抑菌效果的菌株[10]，進行梨火疫病生防菌的篩選及盆栽防效測定，并以防效優良的菌株為代表，提取其脂肽粗提物和蛋白粗提物，對其抑菌機理進行初步研究，為梨火疫病的生物防控提供優良菌種資源與技術支撐。

1材料與方法

1.1材料

病原菌：梨火疫病菌解淀粉歐文氏菌（ E amylovora）Ea-1，由新疆農業科學院微生物應用研究所從庫爾勒發病香梨樹分離獲得并保存。

供試土壤樣品：采用隨機取樣法[11]，從新疆喀什伽師縣西梅園土壤（土壤層 5～20cm 采樣，獲得土壤樣品45份。

供試枝條樣品：從新疆庫爾勒香梨園采集健康香梨樹枝條，獲得枝條樣品37份。

其他供試菌株：JS6-1、JS3-4菌株為新疆特殊環境微生物重點實驗室前期從新疆喀什地區伽師縣鹽堿地土壤及哈密瓜果實篩選獲得并保存[10]

供試培養基：營養瓊脂（NutrientAgar，NA）培養基、營養肉湯（NutrientBroth，NB）培養基、LB（LBBroth）培養基等，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2方法

1.2.1生防菌的分離和初篩病原菌的活化：將病原菌Ea-1劃線接種于NA平板， 28^°C 條件下培養 12h ，挑取單菌落接種于 30mL 無菌NB液體培養基中， 28°C，180r/min 恒溫搖床中培養12h ，梯度稀釋至 10⁵CFU/mL ，取 100μL 涂布于NA平板。

王壤微生物的分離：稱取 5g 王壤樣品置于裝有 45mL 無菌水的三角瓶中， 35^°C.180r/min 恒溫振蕩培養 30min ，梯度稀釋至 10^-3?10^-4[11] 取 100μL 涂布至上述涂有病原菌Ea-1的NA平板， 28^°C 條件下培養 24～48h ，對產生抑菌圈的菌株采用三區劃線法進行純化與保藏。

枝條內生菌的分離：取適量梨樹枝條分別剪成 3～5cm 小段，于 75% 酒精浸泡 1min ，無菌水漂洗3次， 1% NaClO溶液中浸泡 3min ，無菌水漂洗3次，用無菌濾紙吸干水分，無菌剪刀剪成1～2mm 薄片，研磨，加入含有 30mL 無菌水的三角瓶中，制成植物組織懸浮液。 35^°C，180 r/min 恒溫振蕩培養 30min ，取 100μL 涂布至上述涂有病原菌Ea-1的NA平板， 條件下培養 24～48h ，對產生抑菌圈的菌株采用三區劃線法進行純化與保藏。

1.2.2 生防菌的復篩 利用平板對峙法對初篩獲得的生防菌及實驗室已有的JS6-1、JS3-4進行抑菌穩定性檢測，具體操作如下：挑取生防菌單菌落點接于涂布了 100μL 病原菌 （10⁵CFU/mL） 0的NA平板，每板點接4株生防菌，每個生防菌重復接種3塊平板， 培養 24～48h ，測量抑菌圈直徑和菌落直徑，以抑菌圈直徑（ σ_?D ）與菌落直徑（d）的比值 ?[D/d ）代表抑菌能力。

采用打孔抑菌圈法對初篩獲得的拮抗效果較好的生防菌進行復篩，測試發酵液的抑菌效果，具體操作如下：吸取 100μL Ea-1菌懸液（ 10⁵ CFU/mL ）涂布于NA培養基平板中，用打孔器（直徑 9mm ）在平板上均勻打孔，每孔加入 50μL 發酵液對Ea-1進行抑菌活性檢測， 28^°C 培養箱中培養 24～48h ，測量抑菌圈直徑。

1.2.3生防菌的分類鑒定將生防菌接種于NA培養基上， 35°C 培養 12～24h 。挑取單菌落接種至NB液體培養基，培養 12～24h ，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，采用細菌 基因通用引物27F（ 5^′ -AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG- ?3^′ ）和 1492R （ 5^′ -CGGTTACCTTGTTAC-GACTTC- 3^′ ）進行PCR擴增。PCR反應體系（2 （50μL）^[12] ：模板DNA 2μL，2×PCR 緩沖液25μL，27F 和1492R （10μmol/L） 各 1μL，ddH₂O 補足 50μL 。PCR反應條件： 95^°C5min;95^°C 個循環； 72°C 5min 。PCR擴增產物經 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。所得序列提交至NCBI數據庫進行BLAST比對，并申請基因登錄號，采用MEGA7.0軟件進行系統發育分析[3]

1.2.4室內防效測定生防菌葉面噴施防效測定：挑取病原菌Ea ^-1 單菌落接種于 30mL NB液體培養基， 28°C.180Γr/min 振蕩培養 12～ 24h 。挑取生防菌單菌落接種于 30mL NB液體培養基， 35^°C 、 180r/min 振蕩培養 ^12h 作為種子液，按 1% 接種量接種至NB液體培養基，35^°C.180r/min 振蕩培養 12h 。將病原菌和生防菌菌液濃度均調整為 2×10⁸CFU/mL 。采用盆栽杜梨實生苗進行治療性和預防性試驗，每個處理設3次重復。

治療性防效測定：每盆苗接種病原菌菌液0 2×10⁸ CFU/ mL ），3d后接種生防菌發酵液0 2×10⁸ CFU/ mL ），用手持式壓力噴霧器將菌液噴霧至葉片與枝條完全濕潤。

預防性防效測定：每盆苗接種生防菌發酵液（2×10⁸ CFU/mL），3d后接種病原菌菌液 （2x） 10⁸CFU/mL） ，用手持式壓力噴霧器將菌液噴霧至葉片與枝條完全濕潤。

CK：僅噴施病原菌菌液 （2×10⁸CFU/mL） ，用手持式壓力噴霧器將菌液噴霧至葉片與枝條完全濕潤。

接種病原菌后采用棚布遮蓋保濕 3d 。統計每盆杜梨苗枝條數，待枝條出現發病癥狀，逐一進行統計。病斑長度 ?1/3 枝條長度，計為1級；1/3 枝條長度 lt; 病斑長度 ?2/3 枝條長度，計為3級;病斑長度 gt;2/3 枝條長度，計為5級[13]。按如下公式計算病情指數和防效值：

病情指數 =[Σ （每處理各級病枝數 x 該病級數）/該處理總枝數 ×5 （最高病級） 1×100%

防效 ：=[CK 病情指數一處理病情指數]/CK病情指數 ×100%

生防菌灌根防效測定：挑取病原菌Ea-1單菌落接種于 30mL NB液體培養基， 28^°C 、180r/min 振蕩培養 12～24h 。挑取生防菌單菌落接種于 30mL NB液體培養基， 35^°C.180r/min 振蕩培養 ^12h 作為種子液，按 1% 接種量接種至NB液體培養基， 35°C，180r/min 振蕩培養 ^12h 后采用盆栽杜梨實生苗進行治療性和預防性試驗，每個處理3次重復。

治療性：每盆苗灌根病原菌菌液 （2）×10⁸ CFU/mL）50mL，3 d后灌根生防菌發酵液（ 2× 10⁸CFU/mL）50mL 。

預防性：每盆苗灌根生防菌發酵液 （2×10⁸ CFU/mL）50mL，3c 1后灌根病原菌菌液 （2×10⁸ CFU/mL）50mL 。

CK：僅以 50mL 病原菌菌液（ 2×10⁸ CFU/mL 灌根。

試驗于溫室內進行，接種病原菌后采用棚布遮蓋保濕 3d 。統計每盆杜梨苗枝條數，待枝條出現發病癥狀，逐一進行統計。病斑長度 ?1/3 枝條長度，計為1級；1/3枝條長度 lt; 病斑長度 ? 2/3枝條長度，計為3級；病斑長度 gt;2/3 枝條長度，計為5級[13]。病情指數和防效計算公式同上。

1.2.5貝萊斯芽胞桿菌JS6-1抑菌機理初探結合平板對峙試驗、打孔抑菌試驗及盆栽防效測定結果，以拮抗效果穩定且防效最佳的貝萊斯芽胞桿菌JS6-1為代表進行后續試驗。

JS6-1發酵液與發酵上清液抑菌效果對比：采用打孔抑菌圈法，JS6-1菌株種子液按照 1% 的接種量接種至 100mL LB培養基中，置于 35°C 180r/min ，搖床培養 24h，8000r/min 離心15min。吸取 100μL Ea-1菌懸液 （10⁵CFU/mL） 涂布于NA培養基平板中，用打孔器（直徑 9mm ）在平板上均勻打孔，分別吸取 50μL 無菌發酵上清液和發酵液對Ea-1進行抑菌活性檢測，重復3次， 28^°C 培養箱中培養 24h ，測量抑菌圈直徑。

貝萊斯芽胞桿菌JS6-1脂肽粗提物抑菌效果測定：JS6-1菌株種子液按照 1% 的接種量接種至 100mL LB培養基中，于 35°C.180r/min 條件下培養 48h，8000r/min 離心 20min 。取上清液，用 1mol/L 的鹽酸調節 pH 至 2.0，4^°C 靜置12h 。收集溶液， 8 000r/min 離心 20min ，棄上清液。所得沉淀加入 5mL 甲醇，用 ΔNaOH 調節pH 至7.0，室溫抽提 離心20min ，抽提過程重復3次，收集所有抽提液，利用旋轉蒸發儀進行濃縮。濃縮液用 0. 22μm 的濾膜進行抽濾，即得到脂肽粗提物（ 50μL 脂肽粗提物相當于 1.5mL 的發酵液濾液）[14]。采用打孔抑菌圈法，以溶劑甲醇為對照，分別吸取 50μL 甲醇和脂肽粗提物對Ea-1進行抑菌活性檢測，重復3次， 28^°C 培養箱中培養 24h ，測量抑菌圈直徑。

貝萊斯芽胞桿菌JS6-1蛋白粗提物抑菌效果測定：采用硫酸銨沉淀法提取發酵上清液蛋白粗提物[15]，配制飽和的硫酸銨溶液，用氨水調節 pH 至7.0，備用。JS6-1菌株種子液按照 1% 的接種量接種至 100mL LB培養基中， 35^°C ，180r/min ，振蕩培養 ^48h ， 8000r/min ，離心15min ，收集上清液，加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨最終飽和度為 50% ，混勻，于 4^°C 靜置過夜，8000r/min，4°C 離心 15min ，分別收集上清液和沉淀，沉淀采用5倍體積的PBS緩沖液溶解，0.22μm 濾膜過濾 （50μL 脂肽粗提物相當于0.5mL 的發酵液濾液）。采用打孔抑菌圈法，分別吸取 50μL 沉淀蛋白PBS重懸液和上清液對Ea-1進行抑菌活性檢測，重復3次， 培養箱中培養 24h ，測量抑菌圈直徑。

1.2.6貝萊斯芽胞桿菌JS6-1脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌穩定性研究為探究脂肽粗提物與蛋白粗提物在不同環境下對Ea-1的抑菌穩定性，分別對脂肽粗提物與蛋白粗提物進行高溫、紫外和蛋白酶K消化處理。

高溫對脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌活性的影響：將 10mL 的脂肽粗提物與蛋白粗提物分別在 40，60，80，100^°C 恒溫水浴鍋處理 ^1h 。高速離心后于 0.22μm 濾膜過濾，各取 50μL 處理過的脂肽粗提物與蛋白粗提物用打孔抑菌圈法對Ea-1進行抑菌活性檢測，以未經高溫處理的脂肽粗提物與蛋白粗提物作為對照，重復3次， 培養箱中培養 24h ，測量抑菌圈直徑。

紫外對脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌活性的影響：取 10mL 脂肽粗提物與蛋白粗提物，分別在距離紫外燈 （19W） 下 10cm 處依次靜置5、10、15，25，30min 。高速離心后于 0. 22μm 濾膜過濾，各取 50μL 處理過的脂肽粗提物與蛋白粗提物用打孔抑菌圈法對Ea-1進行抑菌活性檢測，以未經紫外照射的脂肽粗提物與蛋白粗提物為對照，重復3次， 培養箱中培養 24h ，測量抑菌圈直徑。

蛋白酶K對脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌活性的影響：取 1mL 脂肽粗提物與蛋白粗提物，分別加入蛋白酶K使終濃度為 1mg/mL 、2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL，37°C 恒溫水浴鍋處理 ^2h 。高速離心后于 0.22μm 濾膜過濾，各取 50μL 處理過的脂肽粗提物與蛋白粗提物用打孔抑菌圈法對Ea-1進行抑菌活性檢測，以未添加蛋白酶K的脂肽粗提物與蛋白粗提物為對照，重復3次， 培養箱中培養 24h ，測量抑菌圈直徑。

1.3 數據分析

數據采用IBMSPSSStatistics2O軟件進行單因素方差分析中的Duncan's法進行顯著性分析，Origin 2018制圖。

2 結果與分析

2.1 生防菌的分離與篩選

從新疆庫爾勒香梨園采集枝條樣品以及從喀什伽師縣西梅園采集土壤樣品共82份，采用平板對峙法，初步篩選獲得對梨火疫病菌有拮抗效果的菌株65株，結合實驗室已有的JS6-1和JS3-4；采用多次反復試驗，根據抑菌圈直徑 （D ）與菌落直徑大小 （d） 的比值 （D/d ），確定9株拮抗效果較穩定的菌種，其中，XM4與JS6-1的抑菌作用最強， D/d 值為3.9，與其他菌株差異顯著（表1）;其次為XM11、XL6、XM10、JS3-4， D/d 值分別為3.5、3.4、3.4、3.2;XM1、XL3、XL7、XM8、XM9的抑菌直徑為 11. 0～23. 5mm，D/d 值均大于1.8（表2）。部分生防菌平板對峙結果如圖1所示。

選取上述抑菌作用較強的生防菌 （D/dgt; 2.50）XM1、XM4、XL6、XM9、XM10、XM11及實驗室已有的JS6-1和JS3-4，采用打孔抑菌圈法對菌株發酵液抑菌效果進行復篩。復篩結果如表2所示，以抑菌圈直徑代表發酵液抑菌效果。其中，實驗室已有的JS6-1抑菌效果最強，抑菌圈直徑為 23.13mm ，與其他菌株差異顯著；其次為伽師縣西梅果園土壤篩出的XM4，抑菌圈直徑為20.87mm ；其他菌株的抑菌能力依次為 XM10gt; （24號 JS3-4gt;XL6gt;XM11gt;XM9gt;XM1 。部分生防菌發酵液抑制梨火疫病菌的結果如圖1所示。

2.2 生防菌的分類鑒定

對上述拮抗效果較好的11株生防菌進行16SrRNA基因PCR擴增，將擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，所得序列提交至NCBI數據庫進行BLAST比對，并申請基因登錄號，采用MEGA7.0軟件構建系統發育樹（圖2）。結果表明：XM1、XL3、XM4、XL7、JS6-1均為貝萊斯芽胞桿菌（B．velezensis），XM8、JS3-4為暹羅芽胞桿菌（B.siamensis），XL6、XM11為枯草芽胞桿菌（B．subtilis），XM9為多粘類芽胞桿菌（Paenibacilluspolymyxa），XM10為解淀粉芽胞桿菌（B．amyloliquefa-ciens）。

2.3生防菌的室內防效測定

2.3.1葉面噴施選取上述11株菌株進行盆栽葉噴防效測定，盆栽防效測定結果如表3所示。結果表明，貝萊斯芽胞桿菌JS6-1、XM4防效均在70% 以上，與其他菌株防效差異顯著，其中JS6-1防效最佳，預防性防效達到 79.56% ，治療性防效達到 74.09% 。其次，預防性和治療性防效均大于 60% 的菌株有貝萊斯芽胞桿菌XL7、解淀粉芽胞桿菌XM10、枯草芽胞桿菌XM11和暹羅芽胞桿菌JS3-4。所測菌株中，同一菌株預防性防效優于治療性防效，說明在實際生產中，提前進行病害預防十分必要。

2.3.2灌根選取上述XM1、XM4、XL6、XL7、XM10、XM11、JS6-1、JS3-4（主要選取預防性防效大于 50% 的芽胞桿菌）進行灌根防效測定。結果表明（表4），貝萊斯芽胞桿菌XM4、JS6-1和解淀粉芽胞桿菌XM10防效均在 60% 以上，與其他菌株防效差異顯著，其中JS6-1預防性防效最佳，達74.4% ；XM10治療性防效最佳，達 61.55% 。其次，預防性和治療性防效均大于 50% 的菌株有貝萊斯芽胞桿菌XL7、枯草芽胞桿菌XM11和暹羅芽胞桿菌JS3-4。

2.4貝萊斯芽胞桿菌JS6-1抑菌機理初探

2.4.1發酵液與上清液抑菌效果對比據“1.2.5\"節方法進行試驗，其抑菌結果如圖3所示。

由圖3可知，JS6-1發酵液和上清液均產生抑菌圈，其中發酵液抑菌圈直徑為 22.5mm ，上清液抑菌圈直徑為 18.2mm ，說明抑菌物質可以分泌到細胞外，JS6-1發酵液和上清液均對梨火疫病菌有較好的抑制效果，但發酵液抑菌效果優于上清液抑菌效果。

2.4.2脂肽粗提物抑菌效果測定據\"1.2.5\"節方法進行試驗，其抑菌結果如圖4所示。

由圖4可知，右孔未產生抑菌圈，說明溶劑甲醇對梨火疫病原菌無抑制效果，左孔抑菌圈直徑達 30.11mm ，說明貝萊斯芽胞桿菌JS6-1可產生T 為模式菌株；分支上的數字為 Botstrap值，表示構建系統進化樹時計算1000次時形成該節點的百分比，只顯示大于 50% 的值；括號內字母與數值為GenBank登錄號；標尺0.02代表 2% 的16SrRNA基因序列的進化差異.

2.4.3蛋白粗提物抑菌效果測定據\"1.2.5\"節方法進行試驗，其抑菌結果如圖5所示。

由圖5可知，上清液無抑菌活性，用PBS溶解的粗提物有抑菌活性。說明蛋白粗提物具有抑菌活性，且用硫酸銨沉淀蛋白的方法能夠使抑菌物質完全沉淀。

2.5貝萊斯芽胞桿菌JS6-1脂肽粗提物與蛋白粗提物抑菌穩定性研究

對提取的脂肽粗提物與蛋白粗提物分別進行高溫、紫外照射和蛋白酶K處理。結果如下。

熱穩定性試驗結果（圖6）表明，與對照相比，40^°C，60^°C，80^°C 處理對JS6-1脂肽粗提物的抑菌活性無顯著影響 （Pgt;0.05），100% 處理使脂肽粗提物的抑菌圈直徑下降 7.95% ，存在顯著差異（ .Plt;0. 05 ，但仍具有較強的抑菌活性；蛋白粗提物在不同溫度下處理 30min 后的抑菌圈直徑隨著溫度的升高呈下降趨勢，在 100°C 條件處理下的抑菌圈大小為 12.85mm ，抑菌活性較室溫條件下降 29.59% ，表明脂肽粗提物熱穩定性優于蛋白粗提物。紫外輻射穩定性試驗結果（圖7）表明，抑菌圈直徑隨著紫外燈照射時間的延長呈下降趨勢，與對照相比，紫外照射 30min 后，脂肽粗提物抑菌圈直徑下降 10.97% ，存在顯著差異（ $P { lt; } 0 . 0 5 ＼dot$ ，其他處理時間脂肽粗提物抑菌圈

直徑無顯著性差異（ Pgt;0.05） ；而蛋白粗提物的抑菌圈直徑下降 23.87% ，存在顯著差異（ Plt; 0.05），表明與蛋白粗提物相比，脂肽粗提物更耐紫外線照射。圖8顯示與對照相比，經不同蛋白酶K濃度處理，脂肽粗提物存在一定程度變化，抑菌圈直徑最高下降 9.31% ；在 3mg/mL 、4mg/mL 濃度蛋白酶K處理下，蛋白粗提物抑菌圈存在顯著差異（ Plt;0.05） ，抑菌圈直徑最高下降 15.94% ，說明脂肽粗提物在蛋白酶K消化處理下穩定性更好。

3討論

由于新疆特殊的地理位置，氣候高溫干燥、土壤鹽堿度較高，在多種逆境脅迫下，該地區土壤等環境中蘊含豐富的功能性微生物資源。為進一步獲得高適應性和定殖能力強的菌種，本試驗選擇庫爾勒香梨園和喀什地區同為薔薇科的西梅園采集樣品，進行生防菌篩選，以期為梨火疫病的防控提供更多優良的微生物資源。

芽胞桿菌能分泌產生多種對病原菌具有顯著抑菌作用的脂肽類抗生素、抗菌蛋白、細菌素和聚酮化合物等活性代謝產物[16-17]，是其生防作用的重要機制。但目前關于貝萊斯芽胞桿菌對梨火疫病原菌抑制機理的報道相對較少，賀旭等[18]采用酸沉淀法、硫酸銨飽和沉淀法、正丁醇萃取法對FX1菌株除菌發酵濾液中的抑菌活性物質進行了粗提及抑菌活性檢測，結果表明，酸沉淀法和硫酸銨飽和沉淀法得到的粗提物具有顯著的抑菌作用，酸沉淀法提取物抑菌活性更強。本研究通過酸沉淀法、硫酸銨飽和沉淀法分別對貝萊斯芽胞桿菌JS6-1的脂肽粗提物、蛋白粗提物進行提取，結果表明，脂肽粗提物和蛋白粗提物均具有顯著抑菌效果，再次明確貝萊斯芽胞桿菌脂肽類和蛋白類抑菌物質均具有顯著的抑菌效果。

另外，有研究表明，抑菌活性物質的抑菌效果易受外界環境如溫度、紫外光等因素的影響[19]由于新疆環境較特殊，具有高溫、強紫外線等環境，因此本研究增加了對脂肽粗提物、蛋白粗提物抑菌穩定性研究。結果表明JS6-1脂肽粗提物經不同溫度、紫外光、蛋白酶K等不同條件處理后，均有一定程度的變化，這與吳艷清等[19]研究結果比較相似。本研究發現，經 60^°C 處理后，脂肽粗提物抑菌活性無顯著性差異（ Pgt;0.05? ，而蛋白粗提物的抑菌圈直徑下降 26.31% ，存在顯著差異（ Plt;0. 05） 。與對照相比，經紫外照射25min ，脂肽粗提物抑菌活性無顯著性差異0 ?Pgt;0.05） ，而蛋白粗提物的抑菌圈直徑下降20.42% ，存在顯著差異（ Plt;0.05） 。在3mg/mL.4mg/mL 濃度蛋白酶K處理下，脂肽粗提物抑菌圈直徑最高下降 9.31% ，存在顯著差異（ ?Plt;0.05） ，蛋白粗提物抑菌圈存在顯著差異（ ?Plt;0.05） ，抑菌圈直徑最高下降 15.94% 。由此可見，本研究JS6-1脂肽粗提物相比蛋白粗提物對溫度、紫外線和蛋白酶處理具有更強的耐受能力。推測脂肽類物質結構中存在的肽環（peptidering）結構可能是脂肽類物質保持較高穩定性的重要原因之一[20]。

綜上，本研究篩選獲得11株較優良的梨火疫病生防菌，結果表明XM4、XL7、XM10、XM11、JS6-1、JS3-4菌株對梨火疫病均具有較好的防效，在梨火疫病的病害防治中具有較好的應用前景。其中貝萊斯芽胞桿菌JS6-1菌株脂肽和蛋白粗提物均具有顯著的抑菌效果，脂肽粗提物抑菌穩定性優于蛋白粗提物，在田間應用中具有較大的應用潛力，相關機制有待深人研究。

參考文獻 Reference：

[1]陳春利.春雷霉素 @ ZIF-93納米材料的制備及其在防治梨火疫病中的應用[D].新疆阿克蘇：塔里木大學，2023.

[2]EASTGATEJA.Erwinia amylovora ：the molecular basisoffireblightdisease[J].MolecularPlantPathology，2000，1（6）：325-329.

[3] 魯晏宏，郝金輝，羅明，等.梨火疫病拮抗菌篩選及溫室防效測定[J].微生物學通報，2021，48（10）：3690-3699.

[4] SANTANDERRD，CATALA-SENENTJF，FIGAS-SE-GURA A，et al.From the roots to the stem：unveiling pearroot colonization and infection pathways by Erwinia am y-lovora[J].FEMS Microbiology Ecology，2020，96（12）： fi-aa210.

[5] SHOLBERG，PETERL，KATHLEEN B，et al. Survey ofErwinia amylovora isolates from British Columbia for re-sistance to bactericides and virulence on apple[J]. CanadianJournal of Plant Pathology，2001，23（1） ：60-67.

[6]TANCOS K A，COX K D. Effects of consecutive strepto-mycin and kasugamycin applications on epiphytic bacteria inthe apple phyllosphere[J].Plant Disease，2017，101（1）：158-164.

[7]MCGHEE G C，GUASCO J，BELLOMO L M，et al.Genet-ic analysis of streptomycin-resistant （SmR） strains of Er-winia amylovora suggests that dissemination of two geno-typesisresponsible for thecurrent distribution of SmR E ：amylovora in Michigan[J].Phytopathology，2o11，101（2）：182-191.

[8] ZELLER W，WOLF B. Studies on biological control of fireblight[J].ActaHorticulturae，1996，（411）：341-346.

[9]王俊，高建誠，巴音克西克，等.利用蜜蜂傳播生防菌防治梨火疫病[J].植物檢疫，2022（1）：9-12.

[10] 何亞芳，包慧芳，王寧，等.甜瓜鐮刀菌果腐病菌拮抗菌篩選及其拮抗性研究[J].園藝學報，2023，50（10）：2257-2270.

[11］耿源濛，孫權，顧欣，等.干旱區土壤中西瓜專化型尖孢鐮刀菌拮抗菌的篩選及分類[J].河南理工大學學報（自然科學版），2016，35（4）：526-532，567.

[12] 程睿君.煙草黑脛病拮抗菌ZY-11-2的篩選、鑒定及其生物防治效果研究[D].陜西楊凌：西北農林科技大學，2019.

[13] 李洪濤，張靜文，盛強，等.我國 20 個梨品種（種質））對國外梨火疫病菌的抗病性評價[J].果樹學報，2019，36（5）：629-637.

[14]XIN Z，ZHI J Z，YE H，et al. Isolation and identification ofantifungal peptides from Bacillus BHo72，a novel bacteri-umisolated from honey[J].Microbiological Research，2013，168：598-606.

[15]王全，王占利，高同國，等.響應面法對解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）12-7產抗菌蛋白條件的優化[J].棉花學報，2016，28（3）：283-290.

[16] FAN B，WANG C，SONG X，et al. Bacillus velezensisFZB42 in 2018：the gram-positive model strain for plantgrowth promotion and biocontrol[J]. Frontiers in Micro-biology，2019，10：1279-1280.

[17]任建雯，羅云艷，馮印印，等.貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5的分離鑒定及細菌素、抗菌肽基因簇挖掘[J].微生物學通報，2021，48（3）：742-754.

[18] 賀旭，韓劍，盛強，等.梨火疫病拮抗細菌 FX1及其抑菌物質的防病作用[J].園藝學報，2023，50（5）：1118-1129.

[19]吳艷清，王游游，王暢，等.枯草芽孢桿菌WL2 脂肽粗提物對致病疫霉的抑制作用及其分離鑒定［J].河北大學學報（自然科學版），2018，38（6）：632-639.

[20] 王鑫.柑橘潰瘍病菌拮抗菌的篩選及F9 菌株抑菌物質的探究[D].廣州：華南農業大學，2017.

Screening of Biocontrol Bacteria against Fire Blight and Preliminary Study on Its Biocontrol Mechanism

LIN Shengnan ^1，2 ，WU Zifei1·2，WANG Ning1，2，GUO Wenchao3，HE Tianming ⁴ ，

SHI Yingwu2， ZHAN Faqiang2，YANG Rong2，BAO Huifang2 and LUO Mingl

（1.CollegeofAgronomy，XinjiangAgricultural University，Urumqi830o52，China；2.InstituteofMicrobiologyXinjiang AcademofAgricultural Sciences，Xinjiang KeyLaboratoryof Special Enviromental Microbiology，Urumqi830091， China；3.Plant Protection Research Institute，Xinjiang Academyof Agricultural Sciences，Urumqi830o91，China; 4.College of Horticulture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi83oo52，China）

AbstractTo screen and obtain excellent strain resources，the biocontrol bacteria were isolated from the branches of Korla pear orchard and soil samples of Gashi County，Kashgar. The antibacterial effect was rescreened by the plate confrontation method，inhibition zone method and the control effects were tested on potted Pyrus betulaefolia seedlings. The crude liptide and protein were extracted from the representative strain with good bacteriostatic effect and treated with temperature，UV and proteinase K to explore the effects of diferent factors on the stability of bacterial inhibition.By this study，11 strains with significant bacteriostatic ability were obtained through rescreening from 67 strains. The results of confrontation plate test showed that Bacillus velezensis XM4 and JS6-1，B. subtilis XL6 and XM11，B. amyloliquefaciens XM10 and B . siamensis JS3-4 had strong antagonistic effect. The results of potted control test showed that the control effect of B . velezensis JS6-1 was the best，which reached 79.56% . The crude lipopeptide and protein of JS6-1 had significant bacterial inhibitory effect， and the diameter of the crude lipopeptide reached 30.11mm . The bacteriostatic ability of the crude lipopeptide changed slightly after treated by high temperature，ultraviolet irradiation and proteinase K digestion. While the inhibitory activity of the crude protein decreased significantly.

Key words Fire blight;Erwinia am ylovora ; Bacillus ；Biocontrol mechanism

Received 2023-10-24 Returned 2023-11-19

Foundation item Science Fund for Distinguished Young Scholars of Xinjiang（No.2O22DolE63）； Independent Cultivation Project of Xinjiang Academy of Agricultural Sciences （No. xjnkycxzx-2022- 003）;Project of Fund for Stable Support to Agricultural Sci-Tech Renovation （No. xjnkywdzc2023005）； Xinjiang Forest and Fruit Industry Technology System （No. XJLGCYJSTX05-2024-11）; Major Science and Technology Projects in Xinjiang（No.2023A0200604-03）.

First authorLIN Shengnan，female，master student. Research area： plant pathology. E-mail： 1825879102@qq. com

Corresponding authorBAO Huifang，female，research fellow. Research area： plant pathology. E-mail：bbhf777 xaas. ac. cn

LUO Ming，female，professor. Research area： plant pathology. E-mail： luomingxjau@sina. com

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUOBaishou）