進口嬰幼兒配方奶粉及其原輔料中蠟樣芽胞桿菌流行及生物學特性研究

蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）是一種重要的條件性食源性致病菌，國內外有關于蠟樣芽胞桿菌引發的食物中毒事件時有報道[1-3]。它能夠產生耐熱芽孢，在適宜條件下進行芽孢萌發，并迅速繁殖分泌大量的毒素和酶，從而引起食源性疾病，臨床癥狀主要表現為嘔吐或（和）腹瀉，新生兒或留置導尿管患者是最高風險群體[4]。蠟樣芽孢桿菌的芽孢在環境中無處不在，可以在食品加工和巴氏殺菌溫度下存活。一些蠟樣芽孢桿菌群菌株在乳品加工環境中具有粘附固體表面的能力，并產生多細胞生物被膜群落。因此在嬰幼兒配方奶粉加工過程中并不能完全消除蠟樣芽孢桿菌的芽孢[5]。

嬰幼兒配方奶粉及其原輔料是嬰幼兒特有的食物及基礎原料，當免疫系統發育尚未完全的嬰幼兒食用被蠟樣芽胞桿菌污染的奶粉后，可導致嬰幼兒食物中毒或感染，從而引發菌血癥、心膜炎及腦膜炎等并發癥[。因此，它們的質量安全問題備受大家關注。目前，中國奶粉主要以進口奶粉為主，進口嬰幼兒配方奶粉占整個嬰幼兒配方奶粉產業的一半以上，根據中國海關數據顯示，2016一2021年中國奶粉進口數量和金額總體呈上升趨勢，并在2021年達到最大值154萬t，進口金額為89.21億美元[7。本研究對進口嬰幼兒配方奶粉及原輔料進行蠟樣芽胞桿菌污染情況調查，檢測分離菌株的耐藥性和毒力因子，并對其進行多位點序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）研究，以評估蠟樣芽胞桿菌對嬰幼兒奶粉及原輔料的潛在風險，更好地為嬰幼兒食物安全保駕護航。

1材料與方法

1.1培養基、主要試劑和標準菌株

胰蛋白陳大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白脈大豆肉湯（TSB）、緩沖蛋白陳水（BPW）、甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂（MYP）、多粘菌素B，均購于青島海博生物技術有限公司。營養瓊脂（NA），瓊脂糖（Agarose）購于美國Sigma公司。引物（Primer）由楊凌奧科鼎盛生物科技有限公司進行合成。TaqDNA聚合酶、dNTPs、 10×PCR 擴增緩沖液、DL2000標準質量DNAMarker，均購于大連寶生物公司。PCR檢測的質控菌為蠟樣芽胞桿菌ATCC14579，藥敏試驗質控菌為金黃色葡萄球菌ATCC29213和大腸桿菌ATCC25922，均由本實驗室保藏。

1. 2 樣本的采集

2017年10月至2018年10月，隨機采集國內東部某一重要進口口岸進口的來自17個國家和地區的嬰幼兒配方奶粉及其原輔料樣品，共計270份，其中包括嬰幼兒配方奶粉172份、全脂奶粉、乳清粉、脫脂奶粉、乳清蛋白粉等原輔料98份。

1.3 蠟樣芽孢桿菌分離鑒定

在本研究細菌分離前，國內東部某進口口岸分別按照國家標準GB10765-2010《食品安全國家標準嬰兒配方食品》和GB19644-2010《食品安全國家標準乳粉》對270份嬰幼兒配方奶粉及其原輔料樣品進行了菌落總數檢測，其菌落總數均未超過國家規定最高安全限量 1×10⁴ CFU/g（mL）。本試驗按照國家食品安全標準（GB4789.14-2014）中的描述略有改進對蠟樣芽胞桿菌增菌后進行選擇性的分離。首先，稱 25g 樣品放人裝有 225mL BPW的無菌三角瓶中振蕩混勻；將溶液置于 37^°C 搖床中、 120Δr/min 培養 18～24h ：將 2mL 過夜培養液加入 20mL 含 100IU/mL 多粘菌素B的TSB中， 37°，120r/min 搖床培養 18～24h ；然后將培養后的選擇增菌液接種到含多粘菌素B的MYP平板上， 30^°C±1^°C 培養24h ；挑取可疑菌落接種到TSA平板中， 培養 18～24h 。對純化后的菌落用煮沸法制得DNA模板，并使用garB基因進行PCR擴增鑒定。garB基因引物：正向引物（ ）GTTTCTGGTGGTTTACATGG，反向引物（2號 （5^′3^′） TTTTGAGCGATTTAAATGC。PCR反應體系： 10× Buffer 2.5μL ，dNTP 2， 0μL MgCl₂ 1.5μL，Ta q酶 0.125μL ，引物各 0.3μL DNA模板 5. 0μL ，加無菌水至 25μL 。PCR反應條件： 94^°C 預變性 變性 1min 56^°C 退火 1min，72^°C 延伸 1min，35 個循環，最后 72°C 延伸 5min 。將所有鑒定菌株保存于含有 20% 甘油的TSB 菌種管中，放置于一 80^°C 冰箱中，備用。

1.4 細菌耐藥性測定

參照美國臨床實驗室標準委員會（CLSI）推薦的瓊脂稀釋法對菌株進行耐藥性測定。14種抗生素及其耐藥折點為：青霉素（PEN，0.25μg/mL） ，氨芐西林 （AMP，0.5μg/mL） ，阿莫西林/克拉維酸 （A/C， 8/4μg/mL） ，苯唑西林（OXA，4 μg/mL ），頭孢西丁 （FOX，8μg/mL） ，紅霉素（ERY，8 μg/mL ），四環素（TET，16μg/mL） ，氯霉素（CHL， 32μg/mL ），阿米卡星（AMK，64 μg/mL ），慶大霉素（GEN，16μg/mL） ，環丙沙星（CIP，4 μg/mL ），利福平（RIF，4μg/mL） ，萬古霉素 （VAN，16μg/mL） 和甲氧芐啶/磺胺甲惡唑 （T/S，4/76μg/mL） 。金黃色葡萄球菌ATCC29213和大腸桿菌ATCC25922被用作藥敏試驗質控菌株。

1.5 毒力基因檢測

參照有關文獻[8-10]的報道，執行溶血素腸毒素BL（hblA、hblC、hblD）、非溶血性腸毒素（nheA、nheB、nheC）、細胞毒素K（cytK）、腸毒素T（bceT）、腸毒素FM（EntFM）以及嘔吐毒素（ces）基因引物合成和PCR擴增。

1.6 MLST分型

按照蠟樣芽胞桿菌MLST分型網站（ht-tps：//pubmlst. org/organisms/ bacillus-cereus/primers）執行7個管家基因 （glp，gmk，ilvD 、pta、pur、pycA、tpi）引物合成、PCR擴增和擴增產物測序。擴增引物及退火溫度見表1。PCR反應體系：引物各 1μL，dNTP 2μL ， 10× Buffer 2.5μL，MgCl₂ 1. 5μL， Taq酶 0.125μL ，DNA模板 2μL ，加無菌水至 25μL 。PCR擴增條件為：95°C 預變性 5min，95°C 變性 30s ，每對擴增引物的退火溫度見表 1，72^°C 延伸 1min ，35個循環，最后 72^°C 延伸 10min 。將PCR擴增測序結果在線提交至蠟樣芽胞桿菌MLST數據庫（ht-tps：//pubmlst. org/organisms/bacillus-cereus）獲得ST型和克隆群（Clonalcomplexes，CCs）。最后進行UPGMA分析ST序列型的發育樹。

1. 7 數據統計與分析

采用Minitab18軟件對不同地區蠟樣芽孢桿菌污染率和耐藥性進行卡方 （x²） 檢驗分析（ Plt;0.05 ，差異顯著； Plt;0.01 ，差異極顯著）。

表1用于MLST分析的7個管家基因的引物及其擴增條件

Table1 Primers and amplification conditions forseven housekeeping genes used in MLST analysis

2 結果與分析

2.1進口嬰兒配方奶粉及原輔料中蠟狀芽孢桿 菌的檢出情況

270份進口嬰幼兒配方奶粉及原輔料中共檢出108個蠟樣芽孢桿菌陽性樣品，總污染率為40.0%（108/270） ，其中嬰幼兒配方奶粉的污染率為 45.9%（79/172） ，原輔料的污染率為 29.6% （29/98）。嬰幼兒配方奶粉中蠟樣芽胞桿菌的污染率極顯著高于原輔料中蠟樣芽胞桿菌的污染率Ω^′P=0. 008lt;0. 01） 。從歐洲、澳洲、亞洲及北美地區進口的嬰幼兒配方奶粉及原輔料中蠟樣芽孢桿菌污染率分別是 43.9%.35.8%.31.3% 和36.4% （表2）。各地之間蠟樣芽孢桿菌的污染率無顯著差異 （P=0.33gt;0.05） 。

表2各地進口嬰幼兒配方奶粉及其原輔料中蠟樣芽孢桿菌檢出情況

Table2 DetectionofB.cereus in imported infant formula milk powder and its raw materials invarious regions

注： ?? 為同行差異極顯著。 Note： ?? indicates extremely significant differences.

2.2蠟樣芽孢桿菌的耐藥情況

耐藥性檢測結果如表3所示。菌株耐藥率最高為甲氧芐啶/磺胺甲惡唑 （99.1% ，107/108）和青霉素（ 92.6% 100/108） ，其次為阿莫西林/克拉維酸（80. 6% ，87/108）、頭孢西丁（79. 6% .86/108）苯唑西林 （76.9% ，83/108）、氨芐西林（2號 （75.0%，81/108） 和紅霉素 （0.9%，1/108） 。所有分離菌株對四環素、氯霉素、環丙沙星、萬古霉素、利福平、慶大霉素和阿米卡星敏感。嬰幼兒配方奶粉和原輔料樣本中的分離菌株對苯唑西林耐藥性差異顯著 ?P=0.015lt;0.05） ，對氨芐西林耐藥性差異極顯著 P=0，008lt;0，01） ，對其他抗生素耐藥情況無顯著差異。

108株分離菌株共檢測出17種耐藥譜，如表4所示。所測108株菌至少對1種抗生素耐藥，最高耐7種抗生素。其中檢出率最高的耐藥譜為FOX-T/S-AMP-PEN-OXA-A/C（53. 7% ，58/108），其次是 FOX-T/S-AMP-PEN-OXA（ 10.2% ，11/108）、FOX-T/S-PEN-A/C（7. 4% ，8/108）、T/S-AMP-PEN-OXA-A/ C（6. 5% ，7/108）、T/S-PEN 和 T/S-PEN-A/C（4. 6% ， 5/108 ）、FOX-T/S-A/C（2. 8% ， 3/108 ）、FOX-T/S-AMP-OXA（1.9%，2/108） ，其余耐藥譜菌株均為1株。92.6%（100/108） 的菌株具有多重耐藥性（耐藥種類 ?3 ）。

表3不同來源蠟樣芽胞桿菌的耐藥率

Table3DrugresistancerateofB.cereusisolated fromdifferentsources

表4不同來源蠟樣芽胞桿菌的耐藥譜

Table4Antimicrobial resistance profile ofB.cereus isolated from different sources

2.3 毒力基因檢測

毒力基因檢測結果表5所示。nheC毒素基因檢測率最高 （89.8% ，97/108）、其次是nheA（70. 4% ，76/108）和 nheB（66. 7% ，72/108），cytK、bceT、hblA、hblC、hblD和ces毒素基因的檢出率依次為 30.6%.26.9%.7.4%.5.6%， 2.8% 、和 0.9% ，所有菌株均未檢測到entFM毒素基因。 37% 的菌株同時攜帶nheA、nheB和nheC基因，未發現攜帶hbACD基因簇的菌株。

97.2% （105/108）菌株攜帶有1種及以上毒素基因，其中配方奶粉和原輔料源菌株毒素基因的檢出率分別為 97.5% （77/79）和96. 6% （28/29）。108株分離菌株共有25種毒力編碼基因譜見表6。其中最常見的是 nheA+nheC（14.8%

表5不同來源蠟樣芽胞桿菌的毒力基因攜帶率

Table5 Virulence gene carrying rates of B.cereus isolated from different sources

表6不同來源蠟樣芽胞桿菌毒力基因譜

Table6 Virulence gene profiles of B.cereus from different sources

2.4 MLST分型

MLST分型結果得40個ST型（表7），其中ST770型是主要分子克隆系 （12.0%，13/108） ，其次為ST1223（7. 4% . 8/108 ）、s ，7/108）、ST164和ST2568均為 （5.6%，6/108） 六ST144和ST2569均為 （4.6%，5/108 ）、 ST32 ST92、ST1263和ST2519均為 （3.7%，4/108） ）、ST26、ST205、ST1063和ST371均為 （2.8% ，3/108）、ST1939、ST45、ST476、ST2062和ST127均為 （1.9%，2/108） 。其余20個ST型均只有1株菌株 （0.9%，1/108） 。

表7蠟樣芽胞桿菌的MLST數據分析

Table7MLSTdataanalysisofB.cereusisolates

對不同的ST序列進行聚類分析，其結果如圖1所示，可以獲得40個聚類群，其中嬰幼兒奶粉源菌株分為34個聚類群，原輔料源菌株分為

19個聚類群。從耐藥菌株與應ST或CC克隆系進行相關性分析，結果表明耐藥性與ST及CC克隆系不存在關聯性。

3討論

聯合國糧農組織/世界衛生組織（FAO/WHO）將已知污染嬰兒配方奶粉的病原體按照損傷程度分為A、B、C三類，盡管蠟樣芽孢桿菌被歸類為低風險C類[11]，但蠟樣芽胞桿菌是一種條件性食源性致病菌，容易污染淀粉類、甜點類、肉制品類及乳制品類等富含脂類及蛋白質的食品而引發食物中毒，尤其對未發育完全且免疫力低下的嬰幼兒更易引發食物中毒和感染[12]。本研究中進口嬰幼兒配方奶粉及其原輔料中蠟樣芽孢桿菌污染率（ 40.0% ）低于澳大利亞嬰幼兒配方奶粉0 78% ）[13]和中國國產 （48.7%～70.6%） 嬰幼兒配方奶粉的污染率[14-15]；略高于塞爾維亞（ （31.3% ）[16]和中國其他團隊報道 （19.0%）^[17] 市售嬰幼兒奶粉的污染率。由此可見，不同國家和地區的嬰幼兒奶粉及其原料極易受到蠟樣芽胞桿菌污染。嬰幼兒配方奶粉中蠟樣芽胞桿菌的污染率 （45.9%） 顯著高于原輔料的污染率 （29.6%） ，可能是因為蠟樣芽孢桿菌的孢子能夠在高溫下存活并通過熱處理的奶制品或設備傳播，在嬰幼兒奶粉的加工過程中存在二次污染的可能[18]。近年來，由于嬰兒感染蠟樣芽孢桿菌的數量不斷增加，歐洲食品安全局建議嬰兒配方奶粉中的蠟樣芽孢桿菌芽孢檢出應盡可能小于 lt;100 CFU/g^[19] 。截止目前，中國食品安全國家標準未對嬰幼兒配方奶粉中蠟樣芽胞桿菌污染做出限量規定，但是有關方面應積極開展嬰幼兒配方奶粉及其原輔料中蠟樣芽胞桿菌污染的風險評估工作。

當前，中國進口嬰幼兒配方奶粉任占整個嬰幼兒配方奶粉產業的一半以上，進口來源主要是荷蘭、新西蘭、愛爾蘭等歐洲和澳洲國家[7。本研究中荷蘭、愛爾蘭等11個歐洲國家進口奶粉中蠟樣芽孢桿菌污染率為 43.9% 、美國和阿根廷等北美國家污染率為 36.4% 、新西蘭和澳大利亞為35.8% ，新加坡和中國香港兩個亞洲國家和地區污染率為 31.3% 。這與Wang等[15]報道的中國進口嬰幼兒配方奶粉蠟樣芽孢桿菌污染率（52.9% ）基本一致。由此可見，中國進口嬰幼兒奶粉及其原料中蠟樣芽胞桿菌污染率較高，其安全問題不可忽視，應加強進口嬰幼兒奶粉及其原輔料的質量監測。

抗生素的過度使用，甚至不規范使用，導致細菌的耐藥性出現嚴峻的局面。本研究中蠟樣芽胞桿菌對常用的磺胺類和 β -內酰胺類抗生素耐藥率極高，其耐藥率在 68.4%～98.7% 。與一些國內外報道食源性和臨床蠟樣芽胞桿菌的耐藥表型相一致[20-24]。蠟樣芽孢桿菌對 β -內酰胺類藥物的主要耐藥機制是產生能水解 β -內酰胺環的 內酰胺酶，從而使 β -內酰胺類抗生素失去活性[25]， β -內酰胺酶的產生甚至可以導致蠟樣芽孢桿菌對第三代頭孢菌素的耐藥[26]。氨基糖苷類、大環內酯類和氯霉素類抗生素通常被推薦為治療蠟樣芽孢桿菌感染的首選藥物[15]，本研究發現有少量菌株對大環內酯類抗生素產生耐藥性，應警惕耐大環內酯類抗生素蠟樣芽孢桿菌的出現。92.6% 的菌株具有多重耐藥性，最高耐7種抗生素，多重耐藥的蠟樣芽胞桿菌可能會對嬰幼兒產生潛在危害，對這些多重耐藥菌株應引起大家的重視。

蠟樣芽胞桿菌的食物中毒與其表達毒素密切相關。Hbl、Nhe和CytK是引起腹瀉型食物中毒的3種主要毒素，與嘔吐相關的毒素主要是由ces基因簇合成[27]。非溶血性腸毒素Nhe 的3個亞基蛋白分別由nheA、nheB和nheC基因編碼，當3個亞基蛋白同時存在并表達時毒性最大[28]。 37% 的菌株同時攜帶nheA、nheB和nheC基因，低于Zhao等[29]報道的中國乳制品94.4% nheABC基因簇的攜帶率。并未檢測到hblACD基因簇，這與先前的報道相一致[30-31]。盡管蠟樣芽孢桿菌引發腹瀉與多種因素有關，如芽孢在胃中存活的能力、在腸道中的萌發能力、粘附于腸道上皮以及多種毒性因子的表達，而表達Nhe毒素的能力已被證明是腹瀉相關的一個重要標志[32]。本研究中也有 0.9% 菌株被檢測攜帶有ces基因，這與之前報到的大約 1% 的 B .cereus菌株具有合成嘔吐毒素所需的ces基因一致[33]。由此可見，中國進口嬰幼兒配方奶粉及其原輔料中蠟樣芽胞桿菌攜帶腹瀉基因的菌株占例較高，也存在攜帶嘔吐毒素基因的菌株，安全隱患不容忽視。

MLST方法的分子分型更有利于揭示菌株的分子特征和病原菌的瀕源。本研究MLST分型呈現多樣性，主要流行克隆系為ST770，與中國報道的蔬菜[34]和肉類[35]污染的蠟樣芽胞桿菌主要流行克隆系相同。有報道稱ST26是全球范圍內蠟樣芽孢桿菌引起嘔吐型食源性疾病主要克隆系菌株，嘔吐型食源性疾病在亞洲特別是中國、日本和韓國等國家較為常見[36]。在本研究中，也發現有少量的ST26型菌株污染，但這些菌株僅僅攜帶有nheB和nheC基因，這與之前報道ST26型菌株經常攜帶ces基因不一致。相反，本研究中存在1株ST770攜帶ces基因，結果揭示攜帶ces基因的菌株存在分子遺傳的多樣性。

4結論

本研究的結果表明，蠟樣芽孢桿菌在進口嬰兒配方奶粉及原輔料中的污染率較高，存在多重耐藥，攜帶廣泛的毒力基因譜，呈現ST型多樣性，這對消費這些產品的嬰幼兒身體健康構成潛在的危險。因此，建議國內擴大對進口嬰兒配方乳粉及其原輔料中蠟樣芽胞桿菌的監測范圍，有助于提升進口嬰兒配方奶粉及原輔料的質量安全水平，確保嬰幼兒食品的安全。

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Prevalence and Molecular Characteristics of Bacillus cereus in Imported Infant Formula Milk Powder and its Raw Materials

ZHOU Ting1，ZHANG Jie2，LIU Xinyu2，SHEN Jinling3 and WANG Xin2 .Collgeof Veterinary Medicine，Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi7121oo，China;2.Collgeof Foc Science and Engineering，Northwest Aamp;F University，Yangling Shaanxi7121oo，China;3.Technology Center for Animal Plant and Food Inspection and Qurantine，Shanghai Customs，Shanghai 2Oo135，China）

Abstract To investigate the contamination status and related molecular characteristics of Bacillus cereus in imported infant formula milk powder and its raw materials in China，27O samples were collected from October 2Ol7 to October 20l8.Isolation and identification of B .cereus，as well as drug resistance，virulence genes，and MLST typing of isolated strains，were conducted.The results showed that 108B . cereus-positive samples were detected among 27O samples，with an overall detection rate of 40.0% ，including 45.9% for infant formula and 29.6% for raw materials.Resistance analysis revealed that allstrains were resistant to at least one antibiotic，with the most prevalent resistance being to methicillin/sulfamethoxazole （99.1% ）and penicillin （92.6%） . Additionally， 92.6% of the strains exhibited multidrug resistance.Toxin gene detection revealed the highest detection rate for the nheC toxin gene （89.8% ），followed by nheA 70.4% ，nheB（ 66.7% ）andcytK（ 30.6% 》 37% of the strains carried all three nheA， nheB and nheC genes.No strain was found to carry the hblACD gene cluster，and only one strain carried the ces toxin gene. MLST typing yielded 4O ST-types， ST770 （12.0% ） was the major molecular clonal line，followed by ST1223，ST1084，ST164，ST2568， ST144，ST2569，ST32，ST92，ST1263，ST2519 and ST26.The results indicated a contamination rate of B .cereus in imported infant formula milk powder and its raw materials in China.Many strains carried diarrhea toxin genes，and the ST typing showed diversity. Therefore，it is recommended to expand the scope of monitoring B.cereus in imported infant formula milk powder and its raw materials to provide a scientific basis for prevention and control of related foodborne diseases.

Key words Infant formula;Bacillus cereus ;Drug resistance; Molecular characteristics

Received 2023-12-05 Returned 2024-05-10

Foundation itemNational Natural Science Foundation of China（No. 31871894）；Natural Science Foundation of Sichuan Province （No.2023NSFSCo178）.

First author ZHOU Ting，female，assistant laboratory technician. Research area： pathogenic microorganisms.E-mail：zhouting@nwsuaf.edu.cn

Corresponding authorWANG Xin， male， professor. Research area：foodborne pathogenic microorganisms. E-mail： xinwang7516@nwsuaf.edu. cn

（責任編輯：郭柏壽 Responsibleeditor：GUOBaishou）