紅三葉干旱響應基因TpMYB-like的克隆與表達分析

近年來，隨著全球氣溫不斷升高，植物面臨干旱時水分的蒸發和損耗使其生長發育受到嚴峻的考驗。植物本身具有固著性，在面臨外界惡劣的環境時顯得更加被動。因此，植物逐漸形成適應機制來抵制外界帶來的傷害，可以通過其耐旱相關基因表達的變化和某些代謝途徑的改變來抵御和適應嚴峻環境中帶來的水分虧損[1]。其中，屬于調控基因的轉錄因子（transcription factors，TFs）可調節與抗旱性相關的多種功能基因的表達水平，如MYB、CBF（C-repeat binding factor）、WRKY、AP2/ERF（APETALA2/ethylene re-sponse factor）和 bZIP（basic leucine zipper），它們在植物干旱脅迫響應中發揮著重要的作用[2]。MYB轉錄因子是植物中數量最大、分布最廣泛的一類轉錄因子，其蛋白結構主要包括DNA結合結構區（DNA-bindingdomain，DBD）、轉錄調控區（transcription regulation domain，TRD）和負調控區（negative transcription regulation do-main，NTRD）[3]。MYB轉錄因子能夠特異性結合下游靶啟動子，進而調控其轉錄水平，影響植物生長發育及逆境脅迫應答。近年來，MYB轉錄因子的功能在植物抗逆中都有相關研究，如過表達小麥（Triticum aestiuum）的 Ta -SIM（salinity-inducedR2R3-MYB）基因轉人擬南芥中，轉基因擬南芥植株的脯氨酸和可溶性糖含量均高于野生型植株，抗旱性顯著增強[4]。芍藥PIMYB108在煙草植株中過表達時，其黃酮類化合物含量、抗氧化酶活性和光合作用均顯著提高，過表達植株與野生型（WT）植株相比，轉基因植株具有更強的抗旱能力[5]。在大田中穩定過表達GmMYB-OX轉基因大豆和野生型（WT）植株模擬干旱試驗，結果發現GmMYB-OX轉基因植株具有更強的耐旱性[6]。以上研究表明，MYB轉錄因子在調控植物耐旱適應性方面具有重要作用。

紅三葉（TrifoliumpratenseL.）又名紅車軸草、紅荷蘭翹搖等[7]，是豆科（Fabaceae）車軸草屬（Trifolium）多年生草本植物，因其產量高、品質佳、固氮能力強、適口性好等，是豆科植物中最重要的牧草之一。紅三葉耐蔭耐濕性強，常年生長在水分充足的溫暖濕潤地帶，在年降雨量500mm以下的干旱地區栽培種植會使紅三葉草產量不佳、營養價值下降，甚至會造成死亡[8]。在中國，紅三葉主要種植在西北、華北地區，這些地區干旱、水資源匱乏，對其生產的威脅越來越大，因此提高紅三葉的抗旱性，降低干旱脅迫對其生長發育的影響成為亟待解決的問題，對實際生產有著舉足輕重的意義。迄今，國內外對紅三葉的報道大量集中在栽培[9-10]、抗逆生理[1-12]、藥理作用[13]、生產性能和營養價值評價[14-16]等方面，然而，有關紅三葉耐旱基因的挖掘及功能研究方面的報道較少，紅三葉重要經濟牧草的耐旱基因功能分析有助于引導植物的適應性改良和遺傳改良。據此，本研究克隆紅三葉耐旱基因 T_PMYB- e，并對其進行生物信息學和干旱脅迫表達模式分析，以期為紅三葉耐旱基因資源的利用奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料

根據甘肅農業大學草業學院杜文華老師課題組前期《紅三葉新品系的抗旱性研究》的結果[17]，選取抗旱性最強的紅三葉新品系的顆粒飽滿、無病蟲害的成熟種子為試材，用次氯酸鈉消毒后蒸餾水沖洗干凈，置于雙層濾紙的培養皿后放入 光照 ^′8h 黑暗的植物培養間，待植株長出兩片子葉后，將幼苗栽培于統一大小的花盆中（口徑 6.5cm 、底內徑 5cm 、高 7cm ），保持正常水分供應。培養3個月后選擇長勢一致的紅三葉幼苗進行干旱脅迫。用 200mL 的 20% PEG-6000高滲溶液澆灌苦豆子模擬干旱脅迫，所有樣品均設置3次重復。脅迫處理 3，6，12，24h 時，剪取紅三葉的根、莖和葉組織作為待測樣品，在液氮中速凍后置于 -80^°C 冰箱中保存，備用。

1. 2 試驗方法

1.2.1RNA提取及cDNA合成將干旱脅迫處理下、不同時間節點的紅三葉根、莖和葉用液氮速凍，研磨成粉末狀后利用天根RNA提取試劑盒（DP419）提取總RNA，利用BioSpec-nano 紫外可見分光光度計檢測RNA質量， 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，選擇質量良好的RNA反轉錄得到紅三葉干旱脅迫0、3、6、12和 24h 的cDNA，于 -20^°C 冰箱保存，后續用于基因脅迫表達特征分析。

1.2.2TpMYB-like基因克隆與測序根據紅三葉轉錄組數據中 T/pMYB–like 的基因序列，使用SnapGene軟件設計擴增引物（ T_PMYB -F： 5^′

ATGAATGAGAATAAGATTGAT -3^′ 、TpMYB-R：5^′ -CTAACTTATCTTTGAAGG- 3^′ ），送至北京擎科生物科技股份有限公司合成。使用 2× SanTaqMix酶進行PCR擴增，反應體系 20μL 2×San Taq Mix 10μL 、TpMYB-like-F和TpMYB-like-R各 1μL 、cDNA 2μL 、 06μL 。PCR反應程序： 94^°C 預變性 5min;94°C 變性 30s，58^°C 退火 30s，72^°C 延伸 1min，72^°C 再延伸 7min ，30個循環。PCR擴增產物經1.0% 瓊脂糖凝膠電泳后確定目的條帶后，用TaKaRa的膠回收試劑盒回收目的基因片段，然后連接pMD19-T并使用 E . coli DH5α Compe-tentCells試劑盒轉化大腸桿菌 DH5α 感受態細胞，在含有抗生素（氨芐青霉素）的LB固體培養基上涂布劃線，倒置培養基于 37^°C 恒溫培養箱培養 12h 。挑選陽性菌落于LB液體培養基進行搖菌，菌落PCR鑒定后選取陽性的菌液送至擎科生物公司進行測序。

1.2.3TpMYB-like生物信息學分析對T/pMYB–like 編碼蛋白進行生物信息學分析，具體軟件及網址見表1。

1.2.4 T_PMYB 基因的表達模式分析提取模擬干旱脅迫處理不同時間節點（0、3、6、12和 24h ）下的紅三葉根、莖和葉的RNA，以反轉錄得到的cDNA為模版，TpAction為內參基因（TpActionF： 5^′ -CTATTCATTGATGATGCTGCTA- 3^′ 、Action-R： 5^′ -CGCCTCCAAGACGATTCAC- ?3^′ ）檢測TpMYB-like（TpMYB-like-F： 5^′ -TGAT-GATGCTGCTACAATT- 3^′ 、TpMYB-like-R： 5^′ 一CGCCTCCAAGACGATTCAC- 3^′ ）的表達變化。天根SYBRGreen-熒光定量試劑盒的qRT-PCR反應體系為： 10μL （204號 2× TalentqPCRPreMix、0.6μL TpMYB-like-F、0.6 μL TpMYB-like-R、2μL cDNA、6.8 μL RNase-Free ; qRT-PCR反應程序為： 95°C 預變形 3min，95^°C 變形5s，58^°C 退火 15s，40 個循環。每個樣品設置3個重復。采用相對定量 2^-ΔΔCt 方法計算試驗結果，GraphPadPrism軟件對數據處理并作圖。

2 結果與分析

2.1紅三葉新品系RNA質量檢測與 TpMYB like基因克隆

利用TaKaRa試劑盒提取PEG-2OOO處理下紅三葉的根、莖和葉，RNA的 OD_260/280 值為 1.8～2.2 濃度為 200～500ng/μL ，且 1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示兩條帶，表明RNA質量較好，可進行后續試驗。通過TaKaRa反轉錄試劑盒獲得cDNA并以其為模板， TρMYB-like-F/R 為引物進行PCR擴增，對得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，克隆得到長度 1 269bp 的清晰目的條帶（圖1），膠回收純化后將其與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌，菌落PCR鑒定后將陽性菌落送樣測序，測序結果經比對發現該序列與目的序列一致。

2.2TpMYB-like生物信息學分析

2.2.1TpMYB-like基因編碼蛋白的理化性質及親疏水性分析利用ExPASy的ProtParam在線工具對TpMYB-like基因編碼的氨基酸序列進行理化性質分析，發現其CDS全長1269bp，開放閱讀框（ORF）為694bp， T_PMYB -like編碼蛋白的分子式為 C₃₄₁₇H₅₁₉₄N₈₇₀O₈₉₆S₃₃ ，包括626個氨基酸，該蛋白相對分子量為73856.10，理論等電點（PI）為9.60，帶正電荷的殘基（ Arg⁺ Lys）總數為82，帶正電荷的殘基（ Asp+Glu） 總數為39，含有20種氨基酸（圖2-A），絲氨酸（Ser）含量最高，占 12.3% ，甲硫氨酸（Met）含量最低，占 1.4% （圖2-B）。蛋白不穩定系數為41.18（不穩定蛋白）。利用在線軟件ProtScale對TpMYB-like蛋白的親、疏水性進行解析，結果如圖3所示，第190個氨基酸位置，疏水性最大值為1.4，在第199個氨基酸位置，疏水性最小值為一2.8。總平均親水性 lt;1 ，表明TpMYB-like是親水性蛋白（圖3）。

2.2.2保守結構域與蛋白結構分析利用NC-BI中 的 Conserved Domain Search Service 對TpMYB-like蛋白進行保守結構域預測，結果顯示TpMYB-like蛋白的氨基酸位置在 246～302 、330～376 位有2個MYB結構域（圖4），因此該蛋白屬于R2R3-MYB家族。利用在線軟件PSIPRED對TpMYB-like蛋白的二級結構進行分析，結果如圖5所示，該蛋白的組成形式主要有α^- 螺旋、無規卷曲和延伸鏈3種，其中 α -螺旋占比較大。同時，利用在線軟件SWISS-MODEL對TpMYB-like編碼的蛋白質進行三級結構預測，發現TpMYB-like蛋白大豆 GmMYB 的晶體結構具有 70.97% 的相似性，以該蛋白為模板，通過同源建模的氨基酸殘基范圍為 142～212 位，占編碼氨基酸總數的 24% 。TpMYB-like蛋白如圖6所示，由 a- 螺旋和無規卷曲組成。

2.2.3磷酸化、糖基化位點、信號肽及跨膜結構域分析蛋白質磷酸化是生物體調節、控制蛋白質活力和功能的最基本的機制。利用在線軟件NetPhos3.1對TpMYB編碼蛋白進行磷酸化位點預測，結果顯示該蛋白磷酸化位點潛能 gt;0.5 ，且含有47個磷酸化位點，包括32個絲氨酸（S）磷酸化位點，9個蘇氨酸（T）磷酸化位點，4個酪氨酸（Y）磷酸化位點（圖7）。蛋白質的糖基化是蛋白翻譯后的一種修飾，對蛋白行使功能有著重要的影響。利用NetNGlyc1.O軟件對TpMYB-like編碼蛋白進行糖基化位點預測，結果表明TpMYB-like蛋白有5個潛在的糖基化位點，分

別位于第28、38、44、217、239個氨基酸位置（圖8）。通過SignalP4.1工具對TpMYB-like信號肽剪切位點預測，結果如圖9所示，原始剪切位點分值（C值）為0.127，信號肽分值（S值）為0.110，綜合剪切分值（Y值）為0.109，TpMYB-like蛋白D值為0.101；Sec/SPI為0，其他類型蛋白占比為O.5，因此推測TpMYB-like蛋白可能不含有信號肽，即該蛋白可能屬于非分泌性蛋白。跨膜結構主要含有跨膜域、胞外域、胞內域，使用Phobius軟件對TpMYB-like編碼蛋白的跨膜結構域進行分析，結果如圖10所示，TpMYB-like蛋白沒有跨膜結構。

2.2.4亞細胞定位預測及系統進化樹分析利用在線工具BaCeILo對 TpMYB -like編碼蛋白的亞細胞定位進行預測，結果發現 TpMYB -like蛋白主要定位于線粒體 （43.6% ）、細胞核 （32.8% ）、細胞質（ 15% ）、液泡 （4.3%） 和分泌系統囊泡（ 4.3% ）（圖11）。

將TpMYB-like編碼的氨基酸序列比對到NCBI數據庫中，下載同源性較高的11個物種的氨基酸序列：白三葉（Trifoliumrepens）、百脈根（Lotuscorniculatus）、赤豆（Vigna angularis）、豌豆（Pisumsativum）、大豆（Glycinemax）、蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）、綠豆（Vigna ra-diata）、木豆（Cajanuscajan）、苜蓿（Medicagosativa）、狹葉羽扇豆（Lupinusangustifolius）鷹嘴豆（Cicerarietinum）。利用MEGA6.0軟件將TpMYB-like與以上11個物種的氨基酸序列構建系統發育樹，結果發現紅三葉TpMYB-like與其他11個物種合成兩個大分支，鷹嘴豆、赤豆、豌豆、大豆、百脈根、苜蓿、白三葉聚為一個分支，紅三葉與狹葉羽扇豆、木豆、綠豆、蒺藜苜蓿4個物種聚為一個分支（圖12）。

2.3模擬干旱脅迫下TpMYB-like基因表達模式分析

選取穩定表達的Action為內參基因，qRT

PCR檢測 T_PMYB–like 基因在紅三葉根、莖和葉中的表達模式，結果表明 T_PMYB–like 在紅三葉3種組織的表達量為葉 gt; 根 gt; 莖，說明該基因表達具有組織特異性（圖13-A）。同時，對干旱脅迫下紅三葉根、莖、葉不同時間點 T_PMYB–like 表達量進行qRT-PCR檢測，結果顯示，用 20% 的PEG-6000脅迫紅三葉植株，發現在根組織中T_PMYB–like 基因表達量呈不穩定的動態變化，與對照 （0h） 相比， 3h 時表達量增加， 6h 時表達量迅速升高至峰值， ^12h 時表達量再次下降，干旱脅迫 12～24h 時表達量再次升高（圖13-B）；在莖組織中， T_PMYB–like 基因表達量在 ³h 達到峰值后迅速下降， 12～24h 又呈現上升的趨勢（圖13-B）；就葉而言， T_PMYB–like 表達量在干旱脅迫 0～3h 時迅速升高達到峰值， 3～6h 時急劇下降，隨著干旱脅迫時間的增加，TpMYB-ike的表達量緩慢升高后又降低（圖13-B）。

3討論

植物在生長發育的過程中存在多種生物及非生物脅迫，當發生干旱脅迫時，植物為了適應這種逆境條件，其自身會產生一系列相應的形態、生理及基因表達方面的復雜機制來保護自身免受逆境脅迫的危害[18]。轉錄因子調控功能基因的表達是植物抗逆反應過程中的關鍵環節，MYB作為植物體內最大的一類轉錄因子，具有高度保守的MYB結構域，通常每個MYB結構域含3個規則間隔排列的色氨酸殘基，這種特殊結構域可形成“螺旋-轉角-螺旋\"構型，從而使MYB轉錄因子與DNA結合參與調控[19]。本研究結果表明，TpMYB-like的CDS全長1269bp，ORF閱讀框長694bp蛋白的氨基酸位置在 246～302.330～ 376位有2個MYB結構域，屬于R2R3-MYB家族。TpMYB-like蛋白是一種不穩定的親水蛋白，這與荔枝（Litchichinensi）[2o]、四季秋海棠（Begonia sem perflorens）[21]、馬鈴薯（Solanumtuberosum）[22]等MYB轉錄因子結果一致。本研究還發現，TpMYB-like蛋白不含有信號肽和跨膜結構，這與柴華等[23]研究結果相同。系統進化分析發現，TpMYB-like蛋白與狹葉羽扇豆LaMYB、木豆TpMYB-like蛋白的結構域同源性達到 88% ，說明TpMYB-like在進化過程中具有高度保守性，這為進一步研究TpMYB-like的功能特征奠定了基礎。由于蛋白或表達產物行使功能的差異，不同植物中MYB蛋白的亞細胞定位結果也有所不同，如黃花苜蓿MfMYB3R-3在細胞核中發揮作用[23]，艾草中92個R2R3-MYB轉錄因子，89個蛋白定位在細胞核中，3個蛋白同時定位于細胞核和細胞質中[24]。本研究通過對TpMYB-like蛋白進行亞細胞定位預測發現該蛋白定位在線粒體中，由此說明MYB轉錄因子可以在植物細胞內的不同位置發揮調節作用。

T_PMYB–like 基因在干旱脅迫應答中發揮重要的調控作用，本研究對紅三葉模擬干旱脅迫處理發現， T_PMYB–like 基因在紅三葉的根、莖和葉中均表達，該基因在葉中相對表達量最高，根中次之，莖中表達量較低，艾草（Artemisiaargyi）AaMYB60AA，AaMYB63 和 AaMYB86 基因也呈現出葉中的表達高于莖和根，而橡膠（Heveabra-siliensis）HbMYB88在橡膠樹莖和花中表達量高，在根、葉片、樹皮和膠乳中表達量極低[25]。掌葉大黃（Rheum palmatum） RpMYB2，RpMYB6 基因在根中轉錄本豐度最高，而 R_PMYB3 、R?MYB5 基因分別在葉片、葉柄中高表達[26]說明MYB具有較為明顯的組織特異性。

4結論

本研究成功克隆到紅三葉TpMYB-likeCDS全長序列 1 269bp ，其ORF閱讀框長694bp， T/pMYB–like 編碼蛋白包括626個氨基酸，有2個MYB結構域，屬于MYB超家族；該蛋白含有47個磷酸化位點、5個潛在的糖基化位點、不含有信號肽和跨膜結構；亞細胞定位顯示該蛋白定位于線粒體； T_PMYB–like 在 20% PEG-6000模擬干旱脅迫下的紅三葉根、莖和葉中均可誘導表達，但在葉組織中表達量最高，該基因可能在紅三葉防御干旱脅迫的過程中起重要作用。

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Cloning and Expression Analysis of Drought Stress TpMYB-like Gene in Trifolium pratense

SU Dandan and DU Wenhua

（Research Center for Sustainable Grassand and Livestock Management，Key Laboratory of Grassand Ecosystem unde！ Ministry of Education of China，Pratacultural College of Gansu Agricultural UniversityLanzhou730o7o，China）

AbstractTo explore the biological function of TpMYB-like gene in Trifolium pratense under drought stress， T . pratense was used as experimental material. We successfully cloned TpMYB-like gene by PCR and analyzed its bioinformatics and expression pattern to investigate the role of TpMYBlikein T . pratense under drought stress. The results showed that the coding region of the gene was bp in length，the open reading frame（ORF） encoded 626 amino acids，contained two MYB structural domains，belonged to the R2R3-MYB superfamily；the protein had 47 phosphorylation sites，five potential glycosylation sites，and lacked a signal peptide or transmembrane structure; the prediction of subcellular localization showed that the protein was localized in the mitochondria;and the phylogenetic analysis revealed that the TpMYB-like was clustered into a single branch with 91% homology to four species： Lupinus angustifolius ，Cajanus cajan，Vigna radiata，and Medicago truncatula ; qRTPCR showed that the expresson of TpMYB-Like could be induced in the roots，stems and leaves of T . pratense under simulated drought stress at 20% of PEG-6ooo，and the amount of expression was in the following order from high to low：leavesgt;roots gt; stems. The TpMYB-like gene was hypothesized to be induced by drought stress in T .pratense and might play a key role in its drought resistance. T_PMYB-like gene was hypothesized to be induced by drought stress in T . pratense，and might play an important role in its drought resistance.

Key words Trifolium pratense ; Drought stress;MYB gene; Gene cloning; Expression analysis

Received 2024-08-20 Returned 2024-09-21

Foundation itemGansu Provincial Higher Education Industry （No.2O22CYZC-49）；Major Special Project of Gansu Province （No. 21ZD4NAol2）; Major Special Project of Tibet Autonomous Region （No.XZ202101ZDo03N）;National Natural Science Foundation of China （No. 32260339）.

First author SU Dandan，female，doctoral student. Research area：grass germplasm resources and their breeding and cultivation.E-mail：ddansu@163.com

Corresponding authorDU Wenhua，female，Ph. D，professor. Research area： grass germplasm resources and their breeding and cultivation.E-mail：duwh gsau. edu. cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsibleeditor：GUYulan）