基于NP基因的禽流感疫苗研究進展

1禽流感概述

禽流感（Avianinfluenza），是由A型流感病毒引起禽類的一種從呼吸系統到嚴重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病。禽流感病毒（AIV）的宿主較廣，只有少數血清型高致病力毒株才能引起禽類發病，如H5、H7、H9等亞型，根據不同的病毒毒力和宿主情況，禽流感感染的表現形式包括急性敗血癥死亡、呼吸道病型或隱性感染性帶毒等，不同的H抗原和不同的N抗原之間很少發生交叉免疫反應，而不同的毒株在感染不同家禽時也表現出不同程度的毒力4。A型流感病毒基因組由分節段的單股負鏈RNA組成，其病毒粒子為球形，有時呈絲狀體等多形態，基因組由分子量大小不同的8個節段所構成（如圖1所示），共編碼11種蛋白，其中8個是組成病毒顆粒的重要部分，如聚合酶蛋白（PolymeraseProtein）、血凝素（Hemagglutinin，HA）、核蛋白（Nucleoprotein，NP）和神經氨酸酶（Neuraminidase，NA）等。

1878年，禽流感在意大利的雞群中被首次發現，緊接著從1955年一1996年，全球進入了禽流感的時代。根據國外相關文獻記載，20世紀期間，北美、北非、中東及歐洲等多個地區都曾暴發過禽流感2。每一次禽流感的大規模暴發都會對經濟產生巨大影響。例如，在1983一1984年，美國暴發的禽流感造成了超6000萬美元的損失。據世界衛生組織統計，2003—2023年，關于人感染H5N1型流感病毒的病例，全球有23個國家共報告882例，其中包括461例死亡案例，可見其給公共衛生安全帶來了嚴重危害。

我國針對禽流感感染采取了綜合性的防控措施：將撲滅與免疫結合起來。實踐證明，在臨床上接種禽流感疫苗是預防該疾病最為科學和高效的手段。然而，在研究中，因禽流感具有較強的變異性，往往疫苗研制的速度趕不上毒株變異的速度，但近年來，隨著科技的發展，我國在禽流感疫苗研發領域取得了顯著進展，有效遏制了禽流感的傳播和感染[3。禽流感病毒是一個全球性挑戰，一旦疫情暴發，全球禽類養殖業會受到重創，嚴重時還會威脅人類的生命安全。因此對禽流感病毒進行持續的監測和鑒定顯得尤為重要，而迅速診斷和及時監控是控制禽流感的首要舉措。據資料顯示，疫苗免疫是預防禽流感最為有效的方法之一，而確保疫苗的安全性和有效性則是其中的關鍵環節[4]。

2禽流感病毒NP基因

核蛋白（NP）是禽流感病毒的重要組成部分，不僅在病毒復制過程中起關鍵作用，還在宿主免疫應答中扮演重要角色。禽流感病毒NP基因是一種單體的磷酸化多肽，它的含量在病毒粒子中僅次于最高者，在流感病毒的各個基因中最為保守。它的開放閱讀框架（ORF）長度為1497個堿基對，編碼498個氨基酸，其編碼的核蛋白是病毒核糖核蛋白復合體的核心成分，參與病毒基因組的轉錄和復制過程，其結構主要包括N端和C端兩個功能區，其中N端通常承擔著與RNA分子的結合，而C端主要負責促進NP蛋白的多聚化。

在宿主的免疫應答機制中，NP蛋白具有顯著的免疫原性，能夠觸發強烈的細胞免疫反應。據研究結果顯示，NP蛋白是細胞毒性T淋巴細胞（CTL）攻擊的主要目標之一，因此，NP基因在疫苗研發過程中常被視為一個至關重要的靶點。同時，禽流感病毒核蛋白NP是一個十分保守的蛋白質，在不同亞型禽流感間的保守度超過 90% 。更重要的是，NP蛋白的單克隆抗體被廣泛應用于禽流感血清學和分子生物學檢測中，研究NP蛋白能夠為AIV檢測治療提供參考。

3基于NP基因的禽流感疫苗類型

3.1DNA疫苗

DNA疫苗，即“裸”DNA疫苗，也被稱為基因疫苗、核酸疫苗或多核苷酸疫苗，在基因治療研究中，是一個衍生并發展起來的新的研究領域。這類疫苗的原理是將編碼特定蛋白質抗原的基因整合進真核表達載體中，隨后通過直接或間接的方式注人動物體內，使該基因在動物體內表達相應的抗原。這一過程能使機體產生特定的體液免疫和細胞免疫應答，從而提供長期的免疫力。值得注意的是，DNA疫苗無需增加劑量即可提升接種者的依從性。DNA疫苗作為第三代疫苗，該疫苗不僅具有減毒活疫苗的優點，還具備成本低廉、易于操作和免疫時間長等特點5，因此DNA疫苗被用于治療由許多病原體引起的疾病，也引起了眾多學者的關注，并對它展開大量的研究，研究發現，當與同一種疫苗免疫相比時，聯合免疫刺激機體能產生更強的體液免疫反應和更高的抗體效價[。

因DNA分子較穩定，DNA疫苗與傳統疫苗相比，具有安全持久、制作簡單、生產成本較低、應用廣泛等優點，2020年馮亞亞等通過對BALB/c小鼠接種基于NP的疫苗，研究結果顯示，當BALB/c小鼠接種NP疫苗后，與接種PB1和M1疫苗的小鼠相比，它們對PR8病毒展現出了更強的抵抗力。根據現有資料，如果將基質蛋白、NP和PB1這三種質粒組合起來用于免疫，通常能夠有效地保護小鼠、豬和弼猴免受異源病毒的挑戰。孫蘭以禽流感NP基因為研究對象，構建原核重組質粒pET32a-rTX-NP。經細胞融合后，通過酶聯免疫吸附試驗，又采取亞克隆的方法制得單克隆抗體，并對小鼠進行免疫，結果顯示，其廣譜性好、綜合性好，在禽流感流行病學中有一定的價值。

3.2基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗又被稱為生物合成亞單位疫苗或重組亞單位疫苗，其制備方法是將具有中和表位的抗原基因在原核或真核系統中進行蛋白表達，這一方法利用多種表達系統表達保護性抗原基因，并將所得表達產物與佐劑結合制成疫苗。

在生產過程中，基因工程亞單位疫苗可以將細菌、酵母、哺乳動物細胞和昆蟲細胞等作為表達系統，這些系統在一定程度上能夠高效表達保護性抗原基因，進而制備出大量純化的疫苗蛋白，因此該疫苗具備易于實現規模化生產的特點，同時它的優點也包括安全性高、免疫持久、純度高、穩定性好，為此常被認為是最安全的疫苗類型之一。

鑒于基因工程亞單位疫苗具備出色的安全性和免疫原性，能夠有效激發機體生成針對NP蛋白的特異性抗體和細胞免疫應答，目前已有多種針對禽流感病毒NP基因的基因工程亞單位疫苗被研發出來。2022年楊景等8把前期分離到的1株三源重組的Y280系H9N2亞型禽流感NP基因作為原材料，利用基因工程的手段，進行原核表達，將禽流感NP基因進行PCR擴增，通過連接、轉化、陽性克隆鑒定（菌落PCR + 測序）等方法，先后連接克隆載體、原核表達載體，成功構建了禽流感NP重組蛋白，進一步從誘導劑濃度、時間和誘導溫度等條件進行優化，提高了蛋白的表達量，并經過鎳柱純化得到較純的NP重組蛋白，經試驗證明其免疫原性良好，特異性好。

此外，目前多個研究機構和疫苗生產公司將提取的H5N1亞型禽流感病毒NP基因作為原料，利用基因工程技術使其在原核或真核細胞中表達，得到NP蛋白，對該蛋白進行純化，將純化后的蛋白與佐劑結合，最終制成H5N1亞型的禽流感NP基因工程亞單位疫苗。經過試驗發現該疫苗能夠刺激機體產生針對NP蛋白的特異性免疫反應，同時為接種者提供對H5N1亞型禽流感病毒的免疫保護。然而，需要注意的是，雖然禽流感NP基因相關的基因工程亞單位疫苗在研究中展現出良好的免疫效果和安全性，但目前這類疫苗可能仍處于臨床試驗或研發階段，尚未廣泛應用于實際生產中。

3.3重組病毒載體疫苗

重組病毒載體疫苗采用基因工程技術，將編碼有效抗原的特定基因片段插入載體病毒基因組中并進行表達，從而誘導機體產生體液及細胞免疫應答。通過模擬自然感染過程，該疫苗可以激發機體產生對目標抗原的免疫反應。由于病毒基因組具有較高的穩定性，此類疫苗無需添加佐劑就可產生高免疫原性和持久免疫應答，此外，重組病毒載體疫苗安全性、高效性以及快速生產上還展現出良好的優勢。

在禽流感疫苗研發中，重組病毒載體疫苗占據重要地位。此類疫苗是將禽流感病毒的抗原基因整合到病毒載體中，常用的載體有火雞皰疹病毒（HerpesTurkeyvirus，HVT）、新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）和腺病毒（adenovirus，AdV）等[，當這些疫苗進人宿主細胞后，可以有效表達相應抗原，從而刺激機體產生免疫應答。

3.4病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒（VLPs）疫苗，一種由病毒結構蛋白自我組裝而成的空心微粒疫苗，其粒徑通常在 15～400nm ，這些顆粒在外形上與天然病毒一樣，但它們缺乏了病毒的遺傳信息，因此不具備感染性和復制功能。VLPs疫苗可以模擬病毒的天然構造，并且還保留了病毒的自然結構特征，這使VLPs疫苗可以有效地激活B細胞和T細胞的免疫反應，誘導機體產生高濃度的中和抗體。更重要的是，VLPs結構穩定，為該疫苗長期儲存和運輸提供了有力保障。

隨著基因工程技術的不斷發展，VLPs疫苗的生產效率和純度不斷提高，其作為一種新型疫苗技術，在禽流感等傳染病中也發揮著重要的作用。據報道，科研人員利用重組桿狀病毒表達了AIV（A型流感病毒）的結構蛋白（包括NP），發現自動組裝形成的VLPs免疫SPF雞，可以誘導雞體產生高效價的抗禽流感的特異性抗體。在將NP蛋白應用于VLPs疫苗的制備的過程中，動物實驗結果表明，將保守性NP蛋白整合到VLPs中能夠顯著增加疫苗的免疫原性。

結語

禽流感疫苗在不同動物模型中的保護效果不同，拿小鼠做實驗時，基于NP基因的禽流感疫苗展現出了理想的保護效果，然而當家禽成為實驗對象時，它的防護能力明顯減弱，難以達到理想狀態。由于禽流感的高變異性，不同地區的禽流感病毒已經分化出不同的基因型，如H5N2亞型流感在亞洲、歐洲以及非洲的流行株存在明顯的差異，沒有針對性設計研發的禽流感疫苗在處理同種亞型的流行株時也可能出現免疫效果差、疫苗失活的情況。不僅如此，禽流感疫苗在激發細胞免疫時效果十分明顯，在體液免疫應答中卻相對較弱。

目前國內許多科研人員致力于探索多種新型疫苗技術，包括核酸疫苗、亞單位疫苗以及病毒樣顆粒（VLP）疫苗，為了增強疫苗的免疫效果，他們也將探索多種疫苗平臺的聯合使用，如DNA疫苗與重組病毒載體疫苗的結合、亞單位疫苗與VLP疫苗的結合。目前，疫苗研發技術在不斷進步，科研人員對疫苗研究也在不斷深入，相信未來會有更多新型疫苗進入市場。針對疫苗的價格，企業為搶占市場進行降價銷售，但禽流感疫苗的接種率仍未明顯提高，據統計，2024年我國流感疫苗的報廢率高達 40% ，相關政策表明，為了提高疫苗可及性，政府大力推動新型疫苗技術，降低成本。在技術、政策的支持下，相信未來禽流感防控工作也將邁向新的高度。

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作者簡介：楊漫漫（2002—），女，漢族，本科。研究方

向：微生物學。*通訊作者：胡曉亮（1984—），男，漢族，博士，講師。

研究方向：野生動物傳染病防控。