小麥TaLFNR1-7A基因的生物信息學及表達分析

中圖分類號：S512 文獻標識碼：A 文章編號： 1000-4440（2025）06-1041-09

Abstract：Feritin-NADP+reductase（FNR）isan important enzyme that playsa crucial role inphotosynthesis and cellularrespiration processs.Thisstudyusedcommon wheatChinese Spring as the materialandcloned the TaLFNR1-7A geneusing RT-PCR technology.Bioinformaticsand gene expresion analysis were performedon it.The resultsshowed that the CDS sequence length of TaLFNR1-7A gene was 1O86bp，encoding 361 aminoacids.The encoded protein was a nontransmembrane stablehydrophilicprotein，withoutasignalpeptide，containing atotalof39phosphorylation sites.It was predicted tobelocalizedinthechloroplast.Phylogeneticanalysisandmultipleaminoacid sequence alignmentrevealed that common wheat（Chinese Spring）and emmer wheat exhibitedcloserphylogenetic proximity basedon the TaLFNR1-7A gene，with a sequence similarity of 97.01% . Analysis of promoter cis-acting elements revealed that the TaLFNRl-7A gene contained17cis-acting elements，including seven light-responsive elements.TheqRT-PCRanalysisrevealed that the expresionof TaLFNR1-7Agene was highestin wheat leaves，folowedbystems and germs，with thelowestlevelobserved in

roots.TheTaLFNR1-7A generespondedtomultipleabioticstresses，including drought（PEG-6OOO treatment），methyl jasmonate（MeJA），sodiumchloride（NaCl），andabscisicacid（ABA）.The findings ofthisstudyprovideasignificantfoundation forfurther exploringthe functionalmechanisms of the TaLFNR1-7A gene in wheat growth anddevelopment.

Keywords：wheat；TaLFNRl-7A gene；bioinformatics；gene cloning；expression analysis

小麥（TriticumaestivumL.）作為全球主要糧食作物之一，在世界范圍內具有不可或缺的地位。作物的光合效率在農業生產中發揮著至關重要的作用，因為作物生長發育和產量的形成離不開光合作用，光合效率直接決定了作物的產量和品質，因而發掘、鑒定并利用與光合能力相關的主要功能基因，對小麥品種遺傳改良具有重要作用。

鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶是一種重要的酶，廣泛存在于植物、藍藻和一些細菌中，它在光合作用和細胞呼吸中起到核心作用，主要負責催化鐵氧還蛋白（FD）與NADP+之間的電子傳遞。FNR是一種包含黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔因子的黃素蛋白。FAD在電子轉移過程中起關鍵作用。植物中FNR蛋白可根據其功能和定位差異分為兩類：一類是位于光合組織（主要是植物葉片的葉綠體）中的LFNR（葉型FNR蛋白）；另一類是存在于非光合組織（主要是根部質體）中的RFNR蛋白（根型FNR蛋白），這兩類FNR蛋白各自有多個同源蛋白[4]。根型FNR在非光合質粒中催化相反的反應（鐵氧還蛋白的還原）[5-8]；葉型FNR主要催化光合作用中線性電子傳遞（LET）的最后一步反應，即促使電子從還原態的FD轉移至 NADP⁺ ，生成的還原型輔酶Ⅱ主要用于卡爾文循環中的 CO₂ 固定以及葉綠體內其他代謝過程[9-10]。前人研究結果表明，在擬南芥中兩種不同的核基因編碼兩種LFNR亞型，它們的等電點（pI）不同[1]，這兩種LFNR蛋白（LFNR1和LFNR2）只在綠色組織中積累，并存在于3種不同的葉綠體區室（類葉綠體膜、基質和內膜）中。在擬南芥fmr2突變體中，AtLFNR1既以與類囊體膜結合的形式存在，也以可溶性蛋白的形式存在，而在fnr1突變體中，AtLFNR2僅以可溶性蛋白的形式存在于基質中，這表明在擬南芥中，AtLFNR1對于AtLFNR2的膜附著至關重要，且AtLFNR1-AtLFNR2異源二聚體的形成可能介導了這種附著[12]。在玉米中研究發現，其基因組中含有3個同源的LFNR基因，分別命名為ZmLFNR1、ZmLFNR2、ZmLFNR3，這3種LFNR基因之間相似性達 83% ＼～92% 。然而，前人研究發現，3個ZmLFNR具有不同的膜結合特征，ZmLFNR1特異性定位在類囊體膜上，ZmLFNR3蛋白不與膜結合，只存在于葉綠體基質中，而ZmLFNR2蛋白既能與膜結合，又存在于葉綠體基質中[4，13]。在水稻中研究發現有2個同源的

LFNR基因，分別命名為OsLFNR1和OsLFNR2，兩者的相似性達到 80% ，有趣的是，這兩個LFNR基因的表達具有拮抗現象，即當其中一個LFNR基因超表達時，另一個LFNR基因的表達不管是在轉錄水平還是在蛋白質水平都會受到明顯的抑制[14]。在小麥中研究發現有4個不同的LFNR同源蛋白。這些LFNR可以劃分成2個組：LFNRI和LFNRⅡ，每組都包括2個不同的LFNR，2個LFNR之間只在N-端存在幾個氨基酸的差異[13，15]，小麥LFNR蛋白N-端的差異可能會導致其活性、葉綠體內分布以及對不同鐵氧還蛋白親和力的改變[16]。在大腸桿菌中，FNR 是活性氧（ROS）清除所必需的[17-18]。從小麥fnr1基因突變體可見，小麥葉片黃化、光合作用受阻、生長發育不良，相關研究結果表明，這種現象是由于突變體中NADPH/NADP+的比值顯著下降所致，而NADPH參與葉綠體中活性氧的清除和氧化還原平衡的維持，其較差的活性氧清除能力導致小麥更容易遭受脅迫傷害。總而言之，LFNR基因在植物抵抗脅迫的過程中非常重要。

綜上所述，LFNR基因在植物生長發育過程中以及在應對環境脅迫時均發揮至關重要的作用。本研究在中國春小麥中克隆TaLFNR1-7A基因并探究其在非生物脅迫中的響應，同時進行生物信息學分析并預測其相關功能，用RT-PCR和qPCR檢測該基因在小麥各組織中的時空表達差異和在脅迫中的響應，初步解析TaLFNR1-7A基因在小麥中的生物學功能，為后期深入研究奠定基礎，并為選育優良小麥品種提供候選基因。

材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以普通小麥中國春種子胚芽以及15d幼苗的根、莖、葉片為供試材料。

1.2試驗方法

1.2.1植物總RNA提取與cDNA的合成將中國春小麥胚芽以及幼苗的根、莖、葉片分別利用RNA提取試劑盒（廣州飛揚生物工程有限公司生產的OMEGA試劑盒）提取RNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度并檢測其重量。利用南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供的反轉錄試劑盒合成根、莖、葉片以及胚芽的cDNA。

1.2.2 TaLFNR1-7A基因的克隆 從本實驗室

ZY96-3轉錄組數據庫中分析篩選獲得TaLFNR1-7A基因，根據基因數據庫已有的基因登錄號從Ensem-blPlants數據庫中下載目的基因核苷酸序列，設計特異性引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。以中國春小麥 15d 組培苗cDNA為模板，使用 2× PhantaMaxMasterMix以及特異性引物對基因進行PCR擴增，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至北京擎科生物科技股份有限公司對擴增產物進行測序。

1.2.3生物信息學分析使用在線軟件對TaLFNR1-7A基因進行生物信息學分析。使用Ex-PASy-ProtParam （ https：//web. expasy. org/prot-param）、Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2）、TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）、NCBI Con-served Domain Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 、SingalP 4.O Server（ht-tps：//services. healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1）、Expasy ProtParam（https：//web.expasy.org/protscale/）、PSIPRED（http：//bioinf. cs.ucl.ac.uk/psipred/）、NetPhos 3.1 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）、Blast（ht-tps：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）和 SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）等在線軟件，分別對蛋白質的理化性質、亞細胞定位、跨膜結構域、保守結構域等進行分析。Blast在線獲取TaLFNR1-7A的同源氨基酸序列，并對TaLFNR1-7A基因構建其系統進化樹，篩選出與TaLFNR1-7A基因同源性比較高的基因，最后對基因序列進行比對。1.2.4組織表達分析為了檢測TaLFNR1-7A基因表達情況，利用中國春小麥種子胚芽以及幼苗的根、莖、葉片cDNA為模板并使用特異性引物進行qRT-PCR檢測。反應體系為： 1.0μL cDNA 模板、10.0μL TaqPro Universal SYBRqPCR Master Mix 、上下游引物各 0.4μL （濃度為 10μmol/L ） 8.2μL ddH₂0 ，總體積為 20.0μL 。反應條件設置為：預變性 95°C3min ，接著進行40個循環，每個循環包括：（204號 95%10s，60c30s ，使用 2^-ΔΔCt 計算各組織中的相對表達量。

1.2.5TaLFNR1-7A基因對非生物脅迫的響應分別對 15d 苗齡中國春小麥施加 50mmol/L 脫落酸（ABA）、 100mmol/L 茉莉酸甲酯（MeJA）、250mmol/L氯化鈉（NaCl）以及 20% 聚乙二醇（PEG-6000）模擬干旱處理，分別在 0h，3h，6h，12h，24 h，48h，72h 取葉片提取植物總RNA并反轉錄成cDNA，最后進行qRT-PCR檢測基因表達量。

2 結果與分析

2.1 TaLFNR1-7A基因的克隆

以普通小麥中國春 15d 幼苗的葉片cDNA為模板，利用引物TaLFNR1-7A-F和TaLFNR1-7A-R進行PCR擴增，其擴增產物經 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳。由圖1可見TaLFNRI-7A基因在 1086bp 處有明顯條帶，測序結果與基因組數據庫中的基因序列一致。

2.2TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質理化性質及亞細胞定位

利用ExPASy-ProtParam工具對TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質進行理化性質分析。結果顯示，該基因編碼的蛋白質共有361個氨基酸。其分子式為C1 776H2799N469O532S.9，相對分子量為39842.73，等電點為8.48。此蛋白質包含44個帶負電荷的氨基酸殘基（ Asp+Glu ），48個帶正電荷的氨基酸殘基（ Arg+Lys） 。據分析該蛋白質總原子數為5595，脂溶性指數為74.04，而不穩定系數為34.36。綜合推測該蛋白質屬于穩定性蛋白質。使用Cell-PLoc2.0在線工具進行預測分析，結果顯示TaLFNR1-7A基因編碼的蛋白質定位在葉綠體上。

2.3TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質的理化性質以及二級結構和三級結構

對TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質的跨膜結構域預測，結果（圖2）發現其不含有跨膜結構域，說明TaLFNR1-7A蛋白為非跨膜蛋白。

應用NetPhos3.1Server在線工具分析結果（圖3）表明，TaLFNR1-7A基因編碼的蛋白質共含有39個磷酸化位點，其中有17個絲氨酸（Serine）、13個蘇氨酸（Threonine）和9個酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點，這些磷酸化位點可能在調節蛋白質活性、穩定性和相互作用中發揮重要作用。

保守結構域預測結果如圖4所示，TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質屬于PLN03115家族蛋白質。其翻譯的LFNR在葉綠體線性電子轉移中起著很好的作用，也與光系統I（PSI）周圍的循環電子轉移有關。

根據SignalP4.1Server進行的蛋白質信號肽分析結果顯示，TaLFNR1-7A蛋白的信號肽可能性得分為0.261，這表明該蛋白質沒有信號肽。此外，應用SignalP3.0Server預測顯示TaLFNR1-7A蛋白為非分泌蛋白。

TaLFNR1-7A蛋白三級結構預測結果見圖7，預測其為一種葉片鐵氧還蛋白-NADP+還原酶，氨基酸序列一致性為 84.03% ，推測該蛋白質可能參與光合電子轉遞途徑中的非環式電子傳遞。

2.4基于TaLFNR1-7A基因的同源關系

在NCBI-BLAST中得到烏拉爾圖小麥（Triticumurartu）節節麥（Aegilopstauschii）水稻（OryzasativaL.）等22個物種的LFNR蛋白氨基酸序列。使用MEGA11工具構建系統進化樹（圖8），從圖8可知，基于TaLFNR1-7A基因普通小麥中國春與二粒小麥、烏拉爾圖小麥、節節麥的同源關系較近。

2.5 TaLFNR1-7A順式作用元件

利用PlantCARE在線工具進行TaLFNR1-7A基因啟動子順式作用元件預測，結果顯示共有17種順式作用元件，其中含赤霉素響應元件（P-box）、脫落酸響應元件（ABRE）、參與茉莉酸甲酯反應的順式調控元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）等，以及7個光響應元件（AE-box、GATA-motif、GT1-motif、Sp1、TCCC-motif、TCT-motif、ARE）和與分生組織表達相關的順式調控元件（CAT-box）等。

2.6TaLFNR1-7A基因的組織表達

為比較TaLFNR1-7A基因在普通小麥中國春不同組織中的表達量，對TaLFNR1-7A基因進行qRT-PCR檢測（圖10）。利用中國春小麥幼苗根、莖、葉片以及種子胚芽的cDNA為模板進行qRT-PCR，以Actin為內參基因。結果顯示，TaLFNR1-7A基因在葉片中表達量最高，其次是在莖中和胚芽中，表達量最低的為根部。

2.7TaLFNR1-7A基因在不同脅迫下的表達

15d苗齡的普通小麥中國春TaLFNR1-7A基因在 50mmol/L ABA、100mmol/L MeJA .250mmol/L NaCl、 20% PEG-6000模擬干旱脅迫下不同時間的表達量如圖11所示，在PEG-6000模擬干旱處理后6h 和 ^48h 基因表達量與 0h 相比極顯著增高（ Plt; 0.01）， ^12h 和 72h 與 ^0h 相比顯著增高（ Plt; 0.05）;MeJA脅迫 6h 時TaLFNR1-7A基因表達量顯著低于 0h （ Plt;0.05） ，其余脅迫時間極顯著低于 （ Plt;0.01 ）； NaCl 脅迫處理 ^12h 時基因表達量與0h 相比極顯著增高， ³h 和 ^72h 與 ^0h 相比極顯著降低；ABA脅迫處理 24h 基因表達量與 0h 相比極顯著增高， ³h 和 ^12h 與 0h 相比極顯著降低。綜上可知，TaLFNRI-7A基因對PEG-6OOO、MeJA、NaCl和ABA脅迫均有一定程度的響應。

3討論

本研究結果表明，普通小麥中國春TaLFNR1-7A基因在葉片、莖和胚芽中的表達量極顯著高于在根中的表達量，而且預測發現TaLFNR1-7A基因編碼蛋白質定位于葉綠體，這與趙秀秀等[9的研究結果相同。由此可知TaLFNR1-7A基因編碼葉型鐵氧還蛋白-NADP+氧化還原酶，催化鐵氧還蛋白和NADP+之間的電子轉移，在光合作用和細胞呼吸過程中發揮關鍵作用。本研究還發現，TaLFNR1-7A基因CDS序列長度為 1086bp ，共編碼361個氨基酸，這一結果與吳曉佩[20]對文心蘭的研究結果有所不同。通過生物信息學分析特定基因編碼的蛋白質，可以預測其相關生物學功能，有助于揭示基因的結構和功能，為進一步深入研究該基因的生物學功能提供指導。

TaLFNR1-7A蛋白屬于非跨膜的穩定的親水性蛋白質，無信號肽，這些與趙秀秀等[19]對黃金芽茶樹LFNR基因預測分析結果相同。通過對TaLFNR1-7A相近的多個基因序列及分子進化關系分析發現，TaLFNR1-7A基因與來自于二粒小麥中的LFNR基因生物學功能比較接近。這些結果表明，TaLFNR1-7A基因序列在不同小麥中相對保守。本研究中TaLFNRI-7A基因對ABA、MeJA、NaCl和PEG-6000模擬干旱等脅迫處理均有響應，MeJA是廣泛存在于植物中的植物生長調節劑，對植物生長發育以及抵抗不良環境影響有積極影響[21-22]，TaLFNR1-7A在 100mmol/L MeJA脅迫下基因表達量與脅迫前相比顯著下降，與文心蘭LFNR基因在0.2mmol/LMeJA脅迫下的表達趨勢有所不同[23]非生物脅迫條件下，植物細胞內活性氧（ROS）的穩態被破壞，導致ROS迅速積累，調控基因表達和細胞代謝，使植物迅速響應脅迫并作出調整以適應環境變化。而FNR基因的缺失則會導致植物內ROS的過度累積，本研究中，在 NaCl 脅迫處理下隨著時間增加TaLFNRI-7A基因表達量出現先上升后下降的趨勢，在 ^12h 時達到最高，與李蓉等[23]的研究結果一致。PEG-6000模擬干旱處理在 6h.48h 表達量顯著升高，維持NADPH/NADP+的穩定，提高對ROS的清除能力以抵御脅迫對植物的侵害。本試驗對TaLFNR1-7A基因的研究結果為今后更深層次研究提供了重要信息。

4結論

普通小麥中國春TaLFNR1-7A基因的功能機制涉及多個復雜的調控網絡。本研究成功克隆了中國春小麥中的TaLFNR1-7A基因，對其進行了系統的生物信息學和表達分析。結果表明，TaLFNR1-7A蛋白屬于非跨膜的穩定的親水性蛋白質，定位于葉綠體。TaLFNR1-7A基因在葉片中表達量最高，表明其在光合作用中發揮重要作用。系統進化分析顯示，TaLFNR1-7A基因與二粒小麥LFNR基因具有高度相似性，表明其在不同小麥物種中具有較高的保守性。此外，TaLFNR1-7A基因響應多種非生物脅迫（如PEG-6OOO 模擬干旱、NaCl、ABA和MeJA），表明其在植物應對環境脅迫中可能發揮重要的調控作用。這些結果為進一步解析TaLFNR1-7A基因在普通小麥生長發育和非生物脅迫響應中的分子機制提供了重要基礎。今后可以通過功能驗證試驗（如基因敲除或過表達）進一步探索其具體調控機制，為小麥抗逆育種提供理論支持和分子靶點。

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（責任編輯：黃克玲）