輻射污染區細菌多樣性及相關菌株篩選的多方法分析

中圖分類號：Q93-3 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）03-0715-08

0 引言

【研究意義】放射性輻射會顯著改變周圍土壤的物理、化學及生物學特性，導致環境生物多樣性下降[1]。然而，輻射污染區仍存在豐富的微生物資源。截至目前，針對核輻射污染區微生物的相關研究報道較為有限。【前人研究進展】高放射性污染和低放射性污染的土壤中均含有多種微生物[2]。輻射污染程度嚴重的環境中仍存在豐富的真菌多樣性，而且含黑色素的菌種占主導地位，具有極強的抗輻射特性[3]。同時，相關研究也發現輻射環境中土壤微生物對維持和修復土壤生態功能至關重要[4]，通過參與氧化還原、溶解、沉淀、吸附和甲基化等反應影響放射性元素的遷移[5]，可用于重金屬和放射性核素污染土壤及廢水修復[6-7]，甚至在作物育種[8]、生物醫藥開發[9]等多個領域具有應用前景。通過高通量測序技術研究發現，輻射污染程度會顯著影響土壤中微生物群落分布，隨著污染程度的提高放線菌門、厚壁菌門、酸桿菌門及未分類菌門所占比例逐步提高，并且發現污染區內存在大量未分類單元[10]。【本研究切入點】然而，在分離的1500余株各類微生物中，涉及上百余屬，但獲得的新種屬資源較為有限[11-18]。隨著“微生物培養組學（Microbial cul-turomics）\"概念提出等[19]，微生物培養組學利用高通量測序結果為指引，通過使用多種培養條件不僅可獲得大量未/難培養微生物，也可有效校正高通量測序試驗結果的偏差[20]，已成為微生物資源挖掘和研究的重要手段。【擬解決的關鍵問題采用高通量測序技術，分析輻射污染土樣內細菌群落組成及多樣性，并通過多種分離培養方法挖掘樣品中豐富的微生物資源，研究菌株的生長特性和功能，為進一步揭示輻射污染區內的微生物群落多樣性、挖掘潛在微生物菌種資源提供理論依據。

材料與方法

1.1 材料

1. 1.1 樣品采集

樣品采自高輻射區域（ gt;10000Bq/kg 地下5～20cm 的土壤，隨機選取3個采樣點，各采樣區域在 5m×5m 采取五點采樣法采集樣品，并放置在鉛盒內，送至實驗室， 4^°C 保存，備用。

1. 1.2 主要試劑與儀器

磁性法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒（天根公司）；PCR相關試劑（北京鼎國昌盛生物技術有限公司）；瓊脂糖（Biowest公司）； 50×TAE （Genview公司）；核酸染料（北京鼎國昌盛生物技術有限公司）所有試劑均為分析純。

EPOCH-2酶標儀（美國博騰儀器有限公司）；DYCP-31DNDNA電泳槽（北京六一儀器廠）；DYY-5穩壓電泳儀（北京六一儀器廠）；GelDocGO凝膠成像系統（美國伯樂公司）；TGL-20M 臺式高速冷凍離心機（中國凱特實驗儀器有限公司）；BiometraTonePCR儀（德國耶拿公司）等。

1. 1.3 培養基

2216E（海洋肉湯）培養基（ g/L） ：蛋白脈 5_g ，酵母提取物 1g ，檸檬酸鐵 0.1g，NaCl19.45g MgCl₂5.9g，Na₂SO₄3.24g，CaCl₂1.8g，KCl0.55 22mg，Na₂SiO₃?9H₂O4mg，NaF2.4mg，NH₄NO₃ 1.6mg，Na₂HPO₄8mg ，蒸餾水1L，瓊脂 _15g 。

G（高氏一號）培養基 KH₂PO₄0.5g ， MgSO₄ 0.5 g， FeSO₄ 0.01 g，NaCl 0.5g ，可溶性淀粉 20g ，蒸餾水1L，瓊脂 15g，pH7.2＼～7.4。

R2A培養基（ ）：酵母浸出粉 0.5g ，蛋白脈 0.5g ，酪蛋白水解物 0.5g ，葡萄糖 0.5g ，可溶性淀粉 0.5g，K₂HPO₄0.3g ，無水 MgSO₄0.024g ，丙酮酸鈉 ，蒸餾水1L，瓊脂 15g ，額外添加1% NaCl， pH7.2～7.4 。

TSA培養基 （g/L） ）：胰酪陳 15g ，大豆木瓜蛋白酶水解物 5g，NaCl5g ，瓊脂 15g，pH 7.2～ 7.4。

淀粉酶培養基（ ：淀粉 10g ，牛肉膏 3Δg 蛋白豚 10g，NaCl5g ，蒸餾水1L，瓊脂 15g，pH 7.2＼～7.4。

蛋白酶培養基（ g/L ：脫脂奶粉 50g ，蒸餾水1L，瓊脂 15g，pH 7.2～7.4 。

纖維素酶培養基（ ）：羧甲基纖維素鈉10g，（NH₄）₂SO₄4g，KH₂PO₄2g，MgSO₄0.5g ，蛋白陳 10g ，牛肉膏 5g ，蒸餾水1L，瓊脂 15g，pH 7.2 ～7.4 。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取、擴增與測序

采用磁性法土壤和糞便基因組DNA提取試劑盒提取土壤樣品微生物DNA。細菌上游引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA - 3^′ ），下游引物為806R（ 5^′ -GGACTACHVGGGTWTCTA- ），PCR擴增體系為：5XPhusionbuffer4μL ，dNTPs（10 mmol/L） 0.4μL ，上、下游引物（5μmol/L 各 0.8μL ，Phusion DNA 聚合酶 0.2μL ，模板DNA 10ng ，用 補足至 20μL 。PCR擴增條件為： 98^°C 1 min， 98^qC 10 s， 50% 30 s，72% 30s進行30次循環，最后在 72% 下延長5min 。

PCR產物采用 2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用EPOCH-2酶標儀進行定量，根據PCR產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用 2% 的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測PCR產物，對目的條帶采用通用型DNA純化回收試劑盒（TianGen）回收產物。委托北京諾禾致源科技股份有限公司通過Illumi-naNovaSeq高通量測序平臺進行測序分析。

1.2.2 高通量數據

測序獲得的原始序列進行：（1）使用FLASH（V1.2.11）軟件對每個樣本的reads進行拼接，得到原始Tags數據（RawTags）；（2）使用fastp（VO.23.1）軟件對拼接的得到的RawTags進行過濾得到高質量的Tags數據；（3）使用USEARCH（V11.0.667）軟件鑒定并去除嵌合體序列，得到最終的有效數據（EffectiveTags）；（4）使用QI-IME2（V1.9.1）軟件中的Uparse算法（V7.0.1001）對樣本中在 100% 相似度水平的Ef-fectiveTags進行聚類，獲得各分類水平下個樣本內的擴增子序列變體（Amplicon SequenceVari-ants，ASVs）組成，并根據Silva分類學數據庫對ASVs進行分類學注釋，得到每個樣品的ASVs。利用Past軟件（v4.09）計算 ∝ 多樣性指數（chaol、coverage、Shannon和Simpson）。采用微科盟生信云平臺（https：//bioincloud.tech/）對土樣的微生物物種進行可視化分析，采用韋恩圖展示各樣品間不同的細菌群落組成。

1.2.3輻射污染區土壤內細菌的分離培養

撒土法培養：稱取 0.2g 王樣去除石子和較大雜質后，將土樣均勻覆蓋在G、1/32216E、R2A和TSA培養基表面。

傳統稀釋法：稱取 5.0g 土樣加人 50mL 生理鹽水中， 處理1h，之后室溫靜置 30min 獲得稀釋10倍的土壤懸浮液。通過稀釋梯度法制作 10^-2～10^-5 的土壤懸浮液，取不同濃度梯度的土壤懸浮液 100μL ，涂布于G、1/32216E、R2A和TSA培養基平板中。

BiologEco生態板法：稱取 土樣加入50mL 生理鹽水中 37^°C，150r/min 處理1h，之后室溫靜置 30min 獲得稀釋10倍的土壤懸浮液。通過稀釋梯度法制作 10^-3 的土壤懸浮液，每孔150μL ，加入BiologEco生態板及稀釋3倍后的BiologEco生態板內，培養后按照碳源利用情況每孔取100μL ，涂布于G、1/32216E、R2A和TSA培養基平板內。

紫外輻照預處理：稱取 1.0g 土樣在含有10ml無菌水平皿內，利用 6W 紫外燈輻照 20min 后，吸取 100μL 土壤懸浮液，在 G，1/3 2216E 、R2A和TSA培養基平板上進行稀釋涂布培養。

所有平板均在 37% 恒溫培養5＼～7d，挑取不同形態菌株單菌落劃線培養。分離到的菌株保存在相應斜面上，在 4^°C 下保存，同時采用 30% 甘油管和安瓿管保藏于 -80% 冰箱。

1.2.4 菌株16SrRNA基因測序

細菌的16SrRNA基因的PCR擴增模板DNA采用快速凍融法，擴增引物為27F（ 5^′ -AGAGTTT-GATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（ 5^′ - GGTTAC-CTTGTTACGCTT -3^′ ）。PCR擴增體系為（ 30μL ：

2×PCR Taq Master Mix 15μL ，上、下游引物（10μmol/L 各 1μL ，模板DNA 2μL ddH₂O11μL_c PCR反應體系： 94°C 5 72^°C45s，35 個循環， .72%10min 。

1.2.5 細菌功能特性

1. 2.5.1 細菌耐受性

選取97株不同種的細菌進行鹽堿及產酶活性分析。將NaCl添加至培養基中使濃度達到3.0%.5.0%.10.0% 和 12.0% ，將待測菌株在平板上劃線培養后放入 37% 恒溫培養箱內培養3d，以確定菌株耐受NaCl的生長范圍。

用 1mol/L 的鹽酸和氫氧化鈉將培養基pH調至7.0、9.0、11.0和12.0，將待測菌株在平板上劃線培養后放人 37% 恒溫培養箱內培養 3～5d 。以上檢測每組3個重復。

1. 2.5. 2 菌株產酶特性

采用點接法將待測菌株接種于產酶篩選培養基上， 37% 恒溫培養箱內培養 3～5d 。其中，蛋白酶、纖維素酶采用透明圈法；淀粉酶活性采用 1% 碘液法，觀察菌苔周圍培養基變色情況；氧化酶活性通過滴加 1% 四甲基對苯二胺鹽酸鹽溶液，觀察菌體是否立即變色；過氧化氫酶活性滴加 3% 過氧化氫溶液，觀察菌體是否有氣泡產生；每組3個重復。

1.3 數據處理

經 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將濃度合格的樣品送至上海生物生工技術有限公司進行序列測定。測序結果經DNAstar-Lasergenev6軟件檢查峰圖后，將兩端序列進行拼接和校對，獲得有效序列。將所得序列用EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net）和NCBI（美國國家生物技術信息中心）數據庫進行比對，根據相似度較高的序列確定菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 細菌群落組成及多樣性分布

研究表明，共獲得347326條細菌16SrRNA基因序列，308067條質控序列，有效序列為285122條，占比 82.09% 。按 100% 相似度聚類，共有2178個ASVs。各樣品文庫覆蓋率均在 99% 以上。FS1樣品的Chao1和Shannon指數較高，該地點微生物群落多樣性較豐富。表1～2

試驗共獲得2178個ASVs，涉及30個門、384個屬，各樣品菌群總體組成相似。厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）擬桿菌門（Bacteroidota）及放線菌門（Actinobacteriota）為輻射污染區細菌的優勢菌門，累計占比在 97.60% 以上。同時，樣品中還檢測到典型耐輻射菌奇異球菌屬Deinococcus所在菌門（Deinococcota），但占比較低，僅為 0.04% 。屬水平上動性球菌屬（Pl-anococcu）Exiguobacterium、芽孢桿菌屬（Bacil-lus）海洋桿菌屬（Pontibacter）和變形桿菌屬（Pro-teus）等占比均在 5% 以上，累計占比在 46.51% ＼～53.23% 。另外，試驗還發現存在著較多未明確分類菌屬，占比在 5.45%～6.26% 。圖1

2.2 可培養細菌及其分子鑒定

研究表明，共分離獲得277株細菌，基于16SrRNA基因序列比對，共涉及4個門、51個屬、97個種。其中，微小桿菌（Microvirga）、鏈霉菌（Streptomyces）海洋桿菌（Pontibacter）纖維單胞菌（Cellulomonas）芽孢桿菌（Bacillus）、固氮螺旋菌（Azospirillum）和假單胞菌（Pseudomonas）等屬菌株較多。鏈霉菌屬菌株涉及種類最多，包含18個種45株，占 16.25% ，其次為海洋桿菌屬，占7.22% 。盡管分離到的微小桿菌最多，但種類較少，包含5個種69株，占 24.91% 。圖2

表1 不同土壤樣品內基因組DNA序列信息

2.3 不同方法篩選細菌

研究表明，傳統稀釋法分離到121株細菌，涉及29個屬，57個種，其次為BiologEco生態板碳源利用情況進行分離，獲得102株細菌，涉及20個屬，27個種。不同篩選方法也表現出互補性，如撒土方法分離到了ActinomaduraBailinhaonel-laKibdelosporangium等；傳統稀釋法分離到Plas-torhodobacter、BrachybacteriumPorifericola及Brevundimonas等；BiologEco生態板分離到SaccharomonosporaMicrobacterium、Indioceanicola和Pig-mentiphaga等；而經紫外輻照預處理后則分離到Modestobacter、Rhodocytophaga 和 Halalkalibacter等屬。圖3＼～4

2.4 潛在細菌新種挖掘

研究表明，在分離獲得的277株細菌株中，有10株菌與已知模式菌株序列相似性均小于98.5% 共涉及4個屬，其中有6株海洋桿菌屬（Pontibacter）2株假紅桿菌屬（Plastorhodobacter）等。輻射污染區內存在諸多需要進一步挖掘的潛在微生物新類群（物種）資源。表3

表3潛在新種的16SrRNA基因序列比對

2.5 篩選菌株抗逆特性及生物學活性

2.5.1 菌株鹽堿耐受特性

研究表明，此次篩選的細菌菌株中絕大部分具有耐鹽堿能力，其中 89.69% 的菌株能耐受 3% 的 NaCl，21.65% 的菌株可在 10% NaCl以上濃度生長， 65.98% 的菌株可在pH9的條件下生長，30.93% 的菌株能在 pH11 條件下生長。圖5

2.5.2 菌株生物活性

研究表明，試驗菌株產酶特性中： 65.98% 的菌株具有淀粉酶活性； 46.39% 的菌株具有蛋白酶活性； 44.33% 的菌株具有纖維素酶活性； 38.14% 的菌株有氧化酶活性； 97.94% 的菌株具有過氧化氫酶活性。圖6

3討論

3.1LinXueju等[21]采用高通量測序技術在漢福德試驗場地下微生物群落組成的分析中發現了細菌和古菌譜系中的新支系，同時發現了變形菌門中未培養的譜系。MarieRagon等2發現細菌域變形菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和放線菌門等在切爾諾貝利核電站污染區域占比較高；真菌域中子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomyco-ta）和壺菌門（Chytridiomycota）等占比較高。團隊前期采用高通量測序技術初步發現輻射污染區共涉及細菌域的19個門和6個潛在菌門及其它未分類菌門的726個屬。在高輻射污染區中DevosiaHalomonasBacillusMicrovirga 和 Jeotgali-bacillus等屬為主要菌群，并發現存在大量未分類菌屬占比在 24.79% [10]。試驗研究發現，采集的土壤樣品中共包含30個門，240個科，384個屬，其中以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門及放線菌門占比較高，累計占比在 97.60% 以上，與前期結果基本一致。但在高輻射不同區域內菌群在屬水平分類上存在差異，主要菌屬為Planococcu、Exig-uobacteriumBacillusPontibacter和Proteus，且未分類種屬明顯降低，占比在 5.45%～6.26% 。

3.2J-CLagier等19通過采用212種不同的培養條件，分離鑒定出174種同時與高通量測序結果比較發現282個已知物種內有51個與培養組學鑒定結果重疊。AmiDiakite等[23研究結果表明，培養組學獲得了35個未知的細菌，其中19個是新的分類群，與分子方法相比培養組學使豐度提高了 20% 。李文鈞等[24通過培養組學方法，針對鏈霉菌屬微生物設計培養基，獲得了400個潛在新種其中 12% 屬于鏈霉菌屬，并且與傳統培養方法相比，效率提高了4倍。盡管前期從輻射污染區分離到1500多株微生物，也鑒定命名了Yu-hushiella deserti、Deinococcus wulumuqiensis、Deino-coccus malanensis及 Paenibacillus wulumuqiensis等新種[15，25-27]，但與高通量結果相比獲得物種仍較為有限。通過采用撒土法、傳統稀釋法、BiologEco生態板法和紫外輻照預處理等方法，共獲得277株細菌，隸屬于變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，涉及51個屬，97個種，顯著提高了輻射污染區微生物分離效率和物種多樣性。而且個別菌屬也只在一種篩選方法內獲得，表明不同篩選方法具有較好的互補性。同時，與高通量測序結果比較Porifericola、Mesobacillus、Paeniba-cillus和Kibdelosporangium等屬僅在培養法獲得，進一步證明培養組學方法可獲得高通量測序未發現的微生物，并且可有效校正試驗偏差。

4結論

土壤樣品內細菌域共涉及30個門384個屬，輻射污染區大部分菌株均有良好的耐鹽堿能力，獲得許多產功能酶菌株，并發現10株潛在新種。

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Abstract：【Objective】 To screen and mine the microbial species resources by analyzing the diversity and community composition of soil bacteria in the radiation-contaminated area.which provides a theoretical basis for the comprehensive mining and utilization of the microbial resources in radiation-contaminated areas. 【Methods】Soil samples were randomly colected from three sites in the high radiation area of a radiation - contaminated area in northwest China，and the composition of soil bacterial communities in the area was analyzed by using Ilumina NovaSeq high -throughput sequencing technology； the bacteria within the soil were isolated by various screening methods，molecularly identified by using 16S rRNA，and their functional properties were preliminarily studied.【Results】The results of high-throughput sequencing showed that the bacterial domains within the soil samples involved 3O phyla and 384 genera，with the dominant phyla being Firmicutes （52.15% ），Proteobacteria （30.17% ），Bacteroidota （10.42% ）and Actinobacteriota （4.94% ）. Actinobacteriota， 4.94% ）.Planococcus （17.45% ），Exiguobacterium（ 13.65% ），Bacillus （6.97% ）and Pontibacter （ 6.78% ）were the dominant genera. Culturable methods were used to isolate 277 bacterial strains which belonged to 51 genera and 97 species. The dominant bacteria genera were Microvirga （24.91% ）， Streptomyces（ 16.25% ），Pontibacter （7.22% ），Cellulomonas （5.78% ），etc.Ten potential new species were isolated，and majority of the obtained strains had strong salinity tolerance and functional enzyme-producing activities.【Conclusion】The diversity of soil bacteria in radiation-contaminated areas is relatively rich.

Key words ：radiation -contaminated area； high -throughput sequencing；culturable bacteria； functionalcharacteristics