反轉錄-重組酶介導等溫擴增（RT-RAA） 快速檢測豬繁殖與呼吸綜合征

中圖分類號：S855 文獻標志碼：A 文章編號：1001-4330（2025）03-0748-0

0 引言

【研究意義】豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是養豬業的主要疾病，PRRS的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSvirus，PRRSV），感染后會導致妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸困難、發燒、耳朵變為藍紫色等特征[1-2]。針對 Nsp2 基因建立的RT-RAA檢測方法能夠快速的檢測PRRSV并且可以對PRRSV高致病毒株和經典株進行分型，對PRRSV臨床快檢有實際意義。【前人研究進展】Nsp2為各毒株間差異較大的一個編碼區[3]，不同毒株長短不一，從1168個到1196個氨基酸不等，不同基因型病毒的相似性僅有 32% ，通過與傳統的檢測PRRSV的方法進行比較發現，病毒分離鑒定、血清學檢測方法所需要操作的步驟比較繁瑣不便于檢測方法的推廣[4-5]，所以選擇反轉錄重組聚合酶介導的恒溫擴增（RT-RAA），RT-RAA是基于重組酶介導鏈置換核酸擴增技術開發的恒溫核酸擴增技術[6-8]，RNA在逆轉錄酶作用下被反轉成cDNA，DNA/cDNA能夠在短時間內擴增 10⁹～10¹² 倍，擴增產物所帶的熒光基團釋放熒光信號，可用熒光定量PCR儀檢測熒光信號，根據擴增產物的濃度及熒光信號強度顯示出不同程度的擴增曲線，根據 Ct 值判斷陰性還是陽性[9。【本研究切人點】需研究可以直接鑒別2種毒株，能夠很好的應用于臨床當中，并且可以快速診斷出感染的何種毒株，從而針對此種毒株及時采取措施。【擬解決的關鍵問題】設計經典毒株和高致病毒株引物及探針，針對PRRS的感染及時準確的判斷，為臨床當中對PRRS的診斷提供依據，減少PRRS帶來的損失，為臨床快檢提供一種合適的方法。

材料與方法

1.1 材料

1.1.1病毒

含有PRRSVNsp2全長質粒pMD18T-NSP2-TJ、pMD18T-NSP2-VR2332、PRRSV TJM-F92、PRRSV VR2332、CSFVC株、PRV HN株、PRVBartha-K61株、PEDVLJX株、TGEVPurdue株保存于海南省農業科學院畜牧獸醫研究所海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室。

1.1.2 主要試劑與儀器

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司、TaKaRa合成；RT-RAA核酸擴增試劑（批號：S004ZC）購自杭州眾測生物科技有限公司；通用核酸提取試劑盒（批號：AP-MN-BF-WNA-250）購自南京諾唯贊生物有限公司；熒光定量PCR儀（批號：CFX-96 TOUCH）

1.2 方法

1. 2.1 核酸提取

核酸提取按照通用核酸提取試劑盒的說明操作步驟完成。

1. 2.2 引物和探針的設計

根據Genbank下載的PRRSVNsp2序列，利用Oligo7.0軟件基于Nsp2基因的引物，送生工生物工程（上海）有限公司合成。RAA－Nsp25‘AGCCTGTCCCCGCCCCGCGCAGGAA;3CAGTCT-GTGAGGAAGCAGACAAATC;RAA - HTaq1 探針為GTGCCCGCGTCGCGACGTGTCTCCAAGC（6FAM）G（THE）（TAM）GA-CACCTTTGAGTG用于鑒別高致病毒株；RAA-CTaq2 探 針 為 GCCGATCCCTGTGCCCGCAC-CGCGGCG（Cy5）AA（THE）（BHQ2）TTCAGCAG-GTGAA用于鑒別經典株。

1.2.3 熒光RT-RAA反應體系建立

反應體系：總體積為 50μL 。將 42.5μL 含有 25μL 的溶液ABuffer、 12.9μL 去離子水、2μL 上游引物（ 和 2μL 下游引物（ 10μM ）的混合物加入單元管中溶解反應干粉，隨后向試管中加入 5μL RNA樣本和 2.5μL 溶液BBuff-er。將反應管置于熒光定量PCR儀中， 42% 預熱 擴增 ^30s，40 個循環數，同時熒光信號采集。有典型的擴增曲線出現且出峰時間 ?15 min ，為陽性;無擴增曲線或有擴增曲線但出峰時間 gt;18min 時為陰性。

1.2.4 熒光RT-RAA敏感性

以質粒pMD18T-NSP2-TJ、pMD18T-NSP2-VR2332為模板，將質粒10倍梯度稀釋（ 10¹～ 10¹⁰ copies/ μL ），按反應體系對PRRSV的核算樣品進行檢測，測定該方法的敏感性。

1. 2. 5 熒光RT-RAA特異性

對所列實驗室保存的病原進行核酸提取，以得到的核酸為模板，進行RT-RAA反應。

1.2.6 熒光RT-RAA重復性試驗

應用RT-RAA熒光法對臨床樣本進行重復性檢測。

1.2.7 熒光RT-RAA法的臨床應用

使用核酸通用提取試劑盒提取海南省海口市、臨高縣、瓊中縣等地方豬場采集血清樣本200份豬血清樣品RNA，采用研究建立RT-RAA方法并且同時采用PCR方法檢測，比較2種方法結果的一致性。

1.3 數據處理

將臨床樣本用RT-RAA熒光法檢測，統計其陽性樣本以及陰性樣本的數量，得到的檢測結果與PCR檢測結果進行對比，確定符合率。

2 結果與分析

2.1 PRRSVRT-RAA敏感性試驗結果

研究表明，將質粒pMD18T－NSP2-TJ從1.71×10⁹ 倍比稀釋至 1.71×10¹ copies/ μL ，每個分別加入模板進行反應，以確定RT-RAA的最低檢測濃度。RT-RAA熒光法最低檢測濃度為1.71×10¹ copies/ μL ，同理將 pMD18T-NSP2 -VR2332從 2.19×10⁷copies/μL 稀釋至 2.19×10¹ copies/ μL ，最低檢測濃度為 2.19×10³ copies/μL 。圖1＼～2

2.2 PRRSVRT-RAA特異性試驗

研究表明，選取 pMD18T－ NSP2 - TJ、pMD18T-NSP2-VR2332、CSFV、PRVBartha-K61、PEDVPurdue、TGEVLJX，分別用RAA-HTaql探針和RAA-CTaq2探針驗證其特異性。RAA-HTaq1探針對pMD18T-NSP2-TJ具有良好的特異性，RAA-CTaq2 探針對 pMD18T-NSP2-VR2332具有良好的特異性。圖3，圖4

2.3 重復性試驗結果

研究表明，RT-RAA熒光法檢測高致病毒株樣本試驗結果為批內平均值為13.51，標準差為0.72，變異系數 0.53% ;RT-RAA熒光法檢測高致病毒株樣本試驗結果為批間平均值為12.98，標準差為0.50，變異系數 3.9% ;RT-RAA熒光法檢測經典株株樣本試驗結果為批內平均值為12.38，標準差為0.46，變異系數 3.6% ;RT-RAA熒光法檢測經典株樣本試驗結果為批間平均值為12.97，標準差為0.42，變異系數 3.2% 。

2.4 臨床樣本檢測

研究表明，高致病毒株陽性67份，陰性133份；經典株陽性72份，陰性128份。高致病毒株陽性樣品64份，陰性樣品136份，該方法的敏感性為 95.5% ，特異性為 100% ；經典株陽性樣品67份，陰性樣品133份，該方法的敏感性為 93.0% ，特異性為 100% 。表1＼～2

表1高致病毒株RT-RAA熒光法與PCR方法檢測臨床標本的比較

Tab.1 ComparisonsofRT-RAA fluorescence methodandPCRmethodbetweenRT-RAA fluorescence method and PCR method for thedetection ofclinical specimens ofhighly virogenicstrains

表2經典株RT-RAA熒光法與PCR方法檢測臨床標本的比較

Tab.2 ComparisonstableofRT-RAA fluorescencemethodandPCRmethodfor thedetectionofclinicalspecimens

3討論

3.1我國報道 PRRS在1995 年[10]，由于感染豬只會終身帶毒排毒，增加了此類疾病的防控難度。

PRRSVNsp2基因編碼的蛋白屬病毒的非結構蛋白，其基因序列是整個PRRSV基因組中變異最大的區域之一，也是PRSSV病毒分型的重要分子特征。因此以PRRSV的Nsp2基因為靶標建立的檢測鑒別PRRSV的方法，能夠快速的檢測與鑒別 PRRSV病毒的毒株類型[11-15]，該方法適宜養殖場快速檢測鑒別以及推廣使用。

3.2逆轉錄重組酶介導核酸擴增技術（RT-RAA）是以RAA技術為基礎建立出來的方法，他的原理為先將病原體的RNA通過逆轉錄合成cDNA，再利用重組酶代替普通PCR的高溫變性，完成模板的解鏈過程，然后在單鏈結合蛋白的作用下，由聚合酶完成鏈的延伸，最終便可生成新鏈。與其他的檢測方法比較，比如PCR、LAMP、qPCR、RT-PCR以及RAA 試紙法相比[14-18]，RT-RAA^[19-20] 熒光法具有靈敏度高特異性強的優勢，在 30min 內就可以出現結果，在較短的時間內完成對疾病的檢測，既可以節約時間成本還能及時有效的對疾病作出檢測，能幫助生豬養殖場對PRRS早判斷早撲滅。該方法可以根據設計的引物，實現PRRSV的快速、準確的檢測與分型。如果待檢測樣品存在PRRSV，則檢測樣品時會出現擴增曲線，根據兩個探針的起峰情況，可對PRRSV高致病毒株與經典株進行區分。如果待測樣品不存在PRRSV高致病毒株或經典株，檢測樣品檢測不到相應的峰。

4結論

通過基于RT-RAA方法的建立可以鑒別PRRSV的經典毒株和高致病病毒株，可以實現一個試驗鑒別出兩種毒株的方法。建立的PRRSVRT-RAA熒光法可以區分2種不同的毒株并且特異性良好、靈敏度高。

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Abstract：【Objective】Theobjective of this study is to establish a rapid detection method for PRRSV Nsp2 gene by reverse transcription recombinase- mediated isothermal amplification（RT -RAA）fluorescence.【Methods】Primers and probes of classical strains and highly virogenic strains were designed to detect the sensitivity and specificity of RT-RAA.【Results】The results showed that the proposed method had no cross -reactivity with the nucleic acids of swine fever virus （CSFV），pseudorabies virus （PRV Bartha - K61），porcine epidemic diarrhea virus（PEDV Purdue）and porcine infectious gastroenteritis virus （TGEV LJX）.The minimum detection limit of this method was 1.71×10¹ copies/ μL for highly pathogenic strains and （2 2.19×10³ copies/ μL for classical strains. Compared with the PCR method，the sensitivity and specificity of RT-RAA fluorescence quantification method were 95.5% and 100% ，respectively. The sensitivity and specificity of RT -RAA classical strain fluorescence quantification method were 93.0% and 100% ，respectively and the two methods were highly consistent.【Conclusion】 The PRRSV RT-RAA fluorescence method established in this study can distinguish two different strains with good specificity and high sensitivity.

Key Words： PRRSV；RT - RAA; Nsp2 gene;specificity； sensitivity; highly virulent strains; classical strains