具有大Stokes位移的過氧亞硝基陰離子熒光探針的設計、合成及應用

過氧亞硝基陰離子（ 0NOO^- ）是一種重要的活性氧/活性氮（ROS/RNS）物質，在生物體內由一氧化氮（NO·）和超氧陰離子 （?0₂^-） 化合生成[1-2]，具有強氧化性，參與許多生理代謝過程。當生物體內ONOO-濃度過量時，不僅會誘導多種生物靶點的不可逆損傷，還可能介導細胞程序性死亡，從而破壞細胞和組織內環境穩態[3]。研究表明， 0NOO^- 不僅是導致細胞毒性的重要介質，還與多種疾病相關，包括神經退行性病變、慢性關節炎、炎癥反應、多種神經功能障礙、免疫系統異常、循環系統衰竭以及惡性腫瘤等[46]。另一方面，環境污染（如微塑料和 Hg²⁺ 污染）會刺激人體產生氧化應激，導致ONOO激增，對機體造成一定程度的損害[7-8]。因此，開發能有效監控 0NOO^- 實時變化的檢測方法尤為重要。基于小分子熒光探針的熒光檢測技術由于高靈敏度、非侵人性和高時空分辨率而成為監測生物活性物質的有力工具[9-11]。目前，文獻報道了一些可以用于 0NOO^- 檢測的小分子熒光探針[12-14]。Bruemmer等[15]開發了一種具有高特異性的 0NOO^- 熒光探針，成功用于干擾素刺激的肺上皮細胞中 0NOO^- 的監測，但該探針存在Stokes位移小和發射波長短等缺點。因此，開發靈敏度高、響應速度快、具有大Stokes位移的ONOO熒光探針，對于生物過程中ONOO的動態變化的實時監測以及環境污染物造成的氧化應激過程的研究具有重要意義。

本研究分別以具有優良光學性能的喹啉和二苯基麟酰胺作為熒光母體骨架和識別基團，構建了一種“ON-OFF”型熒光探針QFPD。此熒光探針可以選擇性識別 0NOO^- ，同時伴隨著溶液顏色的明顯變化，可實現對ONOO-的肉眼識別。利用此探針成功實現了HepG2細胞和Raw 264.7細胞內源性ONOO°的實時監控；同時，利用此探針實現了微塑料（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA）和 Hg²⁺ 污染脅迫下細胞內ONOO水平變化的熒光成像監測。

1 實驗部分

1. 1 儀器與試劑

NanoDrop 2000/2000C 紫外可見分光光度計、Vanquish core-LTQ XL液相色譜-離子阱質譜聯用儀和3354 細胞培養箱（美國ThermoFisher Scientific 公司）；FL-4700 熒光分光光度計（日本HTACHI公司）；AVANCEIITM500核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；FluoViewFV1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；SC-33610低速離心機（安徽中科中佳科學儀器公司）；VS-1300L-U超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

5-甲醛基呋喃-2-硼酸、對溴苯酚和[1，1'-雙（二苯基膦基）二茂鐵]二氯化鈀（ Pd（dppf）Cl₂ 和氨基胍（Aminoguanidine，AG）（上海阿拉丁公司）；2-甲基喹啉、二苯基次麟酰氯、脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）、佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（Phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）、2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物（2，2，6，6-Tetramethylpiperidine oxide，TEMPO）和硝普鈉（上海麥克林公司）；碘乙烷和哌啶（美國 Sigma公司）；叔丁基過氧化氫和過氧化氫（ 30% ，國藥集團化學試劑有限公司）；超氧化鉀和三乙胺（安耐吉醫藥化學公司）。實驗用水為去離子水。

小鼠巨噬細胞（Raw 264.7）和人肝癌細胞（HepG2）購自中國科學院細胞庫（上海）；青霉素-鏈霉素購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養基購自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.2 探針QFPD的合成

探針QFPD的具體合成路線見圖1。

1.2. 1 化合物1和2的合成

參照文獻[16]合成化合物1，無需純化，直接用于下一步反應。

將對溴苯酚（ 1.73g ， 10mmol ）和5-甲醛基呋喃-2-硼酸 （1.678g ！ 12mmol ）溶于 30mL 四氫呋喃中，加人 K₂CO₃ 溶液（ 250mg/mL ， 10mL ）攪拌均勻。隨后加入催化劑 Pd（dppf）Cl₂（75mg，0.1mmol） ，在氮氣保護下于 60^°C 回流反應 ^4h 后，冷卻至室溫（ 25^°C ，用飽和 ΔNaCl 溶液洗滌，乙酸乙酯萃取。減壓濃縮后，粗產物通過柱色譜法以正已烷-乙酸乙酯（20：1，V/V）為洗脫劑進一步純化，得到淡黃色化合物 Ω²（940mg ，產率 50% ）。 ¹H NMR（ 500MHz ，DMSO） δ=10.05 （s，1H），9.53 （s，1H），7.72 （d， J=11.4Hz ，2H），

7.61 （d ，J=3.7Hz ，1H），7.06（ d，J=3.7Hz ，1H），6.89 （d， J=8.7Hz ，2H）（見電子版文后支持信息圖S1）。 ¹³C NMR （ 125MHz ， DMSO） δ=177.49 ，159.71，159.59，151.48，127.40，120.22，116.50，107.02（電子版文后支持信息圖S2）。HR-MS（ESI， m/z ）cacld for C₁₁H₈O₃⁺[M+H]⁺：189.0551 ，found： 189.01（電子版文后支持信息圖S3）。

1. 2.2 化合物QFP-OH的合成

將化合物1（ 602mg ， 3.5mmol 和化合物2（ 376mg ， 2mmol 溶于 15mL 無水乙醇中，隨后滴入5滴哌啶，回流反應 ^1h 后，冷卻至室溫（ 25^°C ），旋蒸除去溶劑后，粗產物通過色譜柱以二氯甲烷-甲醇0 （100：1，V/V） 作為洗脫劑進一步純化，獲得紫黑色固體QFP-OH（ 410mg ，產率 60% ）。 ¹H NMR（ 500MHz ， DMSO） δ=8.93 （d， J=9.1Hz ，1H），8.54 （dd， J=9.0 ！ 5.7Hz ，2H），8.31 （ d，J=8.0Hz ，1H），8.23 （d， J=15.2Hz ，1H），8.14 （t， J=8.6Hz ，1H），7.90 （t ，J=7.5Hz ，1H），7.84 （d ，J=8.7Hz ，2H），7.47 （d， J=15.3Hz ，1H），7.36 （d， J=3.6Hz ，1H），7.13 （d， J=3.7Hz ，1H），6.91 （d， J=8.7Hz ，2H），5.11（q， J=7.0Hz ，2H），1.60（t， J=7.2Hz ，3H）（電子版文后支持信息圖S4）。 ¹³CNMR （204號（ 125MHz ，DMSO） δ=159.44 ，159.14，154.98，150.62，143.57，138.60，135.32，133.61，130.71，129.07，128.12，127.31，123.42，120.98，120.51，119.19，116.47，113.20，108.67，46.68，14.41（電子版文后支持信息圖S5）。HR-MS（ESI， m/z ）cacld for C₂₃H₂₀NO₂⁺ [M]：342.1489，found：342.071（電子版文后支持信息圖S6）。

1.2.3 化合物QFPD的合成

將化合物QFP-OH（ 80mg 0.23mmol 溶于 2mL 無水二氯甲烷中，加入適量三乙胺，在 0^°C 下緩慢滴入二苯基次麟酰氯（ 210μL ， 1.17mmol ），攪拌反應1h后，旋蒸除去溶劑得到粗產物，通過色譜柱以二氯甲烷-甲醇（80：1，V/V）作為洗脫劑進一步純化，得到橙色固體目標物QFPD（ 50mg ，產率 40% ）。 ¹H NMR1 500MHz ， DMSO） δ=8.76 （ d，J=9.0Hz ，1H），8.56 （d， J=9.0Hz ，1H），8.39 （d， J=15.2Hz ，1H），8.02 （d， J=9.0Hz ，1H），7.98＼～7.92（m，4H），7.85（t ，J=7.9Hz ，1H），7.79 （d， J=8.0Hz ，1H），7.59（d， J=7.5 ， 1.3Hz ，2H），7.55 （d ，J=7.3Hz ，3H），7.53＼～7.51 （m，3H），7.39＼～7.33 （m，2H） ），7.30＼～7.23（m，3H），6.45 （d， J=3.6Hz ，1H），5.11（q， J=7.0Hz ，2H），1.63 （t， J=7.3Hz ，3H）（見電子版文后支持信息圖S7）。 ¹³C NMR （ 125MHz ， CDCl₃ ） δ=157.62 ，154.66，151.75，151.69，151.02，143.71，138.00，135.04，134.76，132.80，132.78，131.85，131.77，131.41，131.32，131.09，130.38，129.99，128.87，128.76，128.40，127.98，127.87，127.72，126.50，125.38，123.95，121.63，121.47，121.43，117.84，112.46，109.22，46.99，14.20（電子版文后支持信息圖 S8）。HR-MS（ESI， m/z ）cacld for C₃₅H₂₉NO₃P⁺ [M]：542.1880，found：542.303（電子版文后支持信息圖S9）。

1.3 性能測試

取適量探針QFPD溶于二甲基亞砜，配制成 10mmol/L 探針儲備液。光譜測試在磷酸鹽緩沖溶液（PBS， 10.0mmol/L ， pH=7.4 ）中進行，探針濃度均為 10μmol/L 。其它干擾物（Phe、Ala、Cys、Pro、Gly、GSH、Hcy、Se、Thr、Asn、Val、Tyr、His、VC、 ΔS^2- 、 S₂O₃^2- 、 SO₃^2- 、 SO₄^2- 。、 HS^- 、 HSO₃^- 、 HSO₄^- 、 NO₂^- 和NO₃^- ）均用去離子水溶解，制備成 10mmol/L 母液。 0NOO^- 溶液根據文獻[17]中的方法進行配制。在室溫條件下采用紫外可見吸收光譜儀和熒光光譜儀測試其光譜， λ_ex/λ_em=450nm/580nm ，激發和發射狹縫寬度設置為 20nm 。

1.4 細胞毒性實驗

選用小鼠巨噬細胞（ Raw264.7 細胞）和人肝癌細胞（ 細胞）作為模型細胞，評估QFPD的細胞毒性。將Raw264.7細胞和HepG2細胞接種于含有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中，在 37^°C 、 5% CO₂ 、飽和濕度的培養箱中培養 24～48h ，直至細胞融合度達到 80%～90% [18]。

采用CCK-8法檢測探針的細胞毒性。分別將Raw264.7細胞和HepG2細胞以每孔 5×10⁵ 個細胞的密度接種于96孔板，每孔加入 100μL 細胞懸液和培養基混合液，在 37^°C 、 5%CO₂ 的培養箱中預培養 24h 添加不同濃度梯度的探針QFPD（0、5、10、15、20和 25μmol/L ），每個濃度設置3個復孔，培養 12h 后，移去培養基，各孔用無菌PBS緩沖液輕柔洗滌細胞1次，然后加入 100μL 培養基（含 10% 的CCK-8溶液），繼續培養 1～4h 。采用酶標儀測定各孔在 450nm 波長處的吸光度值（OD值），計算細胞存活率[19]：

式中， A_s 、 A_c 和 ∣A_b 分別代表實驗組、陰性對照組和空白組的吸光度值。

1.5 細胞成像

將Raw264.7細胞和HepG2細胞按照1.4節的實驗步驟培養 24～48h 后，接種于共聚焦培養皿中（ 7×10⁵ cell/dish），在 37^°C 、 5%CO₂ 的條件下繼續培養 24h 。

（1）探針QFPD對Raw264.7細胞和 HepG2 細胞內源性 0NOO^- 的熒光成像共分為6組：第1組，向細胞中加入探針QFPD（ 10μmol/L ），在 37^°C 下培養 20min ；第2組，向細胞中加入PMA（ 2μg/mL ，在37^°C 下培養 3h ，加入探針QFPD（ 10μmol/L 繼續培養 20min ；第3組，向細胞中加入LPS（ 1.5μg/mL 培養 12h 后，再加入探針QFPD（ 10μmol/L 培養 20min ；第4組，將細胞與NAC（ 1mmol/L ）共同培養60min ，再加入探針QFPD（ 10μmol/L ）繼續培養 20min ；第5組，將細胞用AG（ 1mmol/L ）預處理 3h ，然后加入探針QFPD（ 10μmol/L 培養 20min ；第6組，將TEMPO（ 300μmol/L ）加入細胞中培養 30min 后，加入探針QFPD（ 10μmol/L 培養 20min 。

（2）PMMA誘導HepG2細胞產生 0NOO^- 的熒光成像將HepG2細胞與不同濃度PMMA（5、10、20、和 50μg/mL ）共培養 24h ，再加入探針QFPD（ 10μmol/L） 繼續培養 20min 。

（3） Hg²⁺ 脅迫HepG2細胞產生 0NOO^- 的熒光成像設計2組實驗：第1組為 Hg²⁺ 脅迫時間對細胞內 0NOO^- 濃度波動影響實驗，在相同濃度的 Hg²⁺（5μmol/L ）脅迫下，測定不同培養時間（15、30和60min ）下HepG2細胞內 0NOO^- 的濃度波動；第2組為不同濃度 Hg²⁺ 脅迫對細胞內 0NOO^- 濃度的影響，將HepG2 細胞分別于5、10和 的 Hg²⁺ 中暴露 30min ，加入探針QFPD（ 10μmol/L ）繼續培養 20min 。

2 結果與討論

2. 1 探針QFPD對ONOO的光譜響應

首先考察了探針QFPD的光譜性質。如圖2A和2B所示，探針QFPD在 450nm 處有明顯吸收峰；以 450nm 作為激發波長時，在 580nm 處有明顯熒光信號。當探針QFPD與 0NOO^- 反應后， 450nm 處的吸收峰紅移至 550nm 處；以 450nm 作為激發波長時，體系在 580nm 處的熒光發生猝滅，這是由于0NOO^- 的強氧化性引起識別基團磷酰胺鍵發生特異性斷裂[20]。考察了QFPD對不同濃度 0NOO^- 的響應時間（圖2C），發現熒光強度的降低速率與 0NOO^- 濃度呈正相關，并且在 10min 左右達到最低值，表明QFPD 對 0NOO^- 具有良好的響應，且響應速度較快。上述結果表明，探針QFPD對 0NOO^- 具有良好的熒光響應，且具有較大的Stokes位移（ 130nm ）。探針QFPD與其它探針的性能比較結果見電子版文后支持信息表1。

2.2pH值對探針QFPD識別ONOO的影響

考察了 pH 值對QFPD-ONOO體系熒光強度的影響，結果見圖 2D 。在 pH=4.0～5.0 范圍內，體系熒光較強，此時探針QFPD對 0NOO^- 的響應較弱，這可能是因為 0NOO^- 在酸性條件下易分解，其有效濃度降低，間接影響探針的檢測靈敏度[21]。在 pH=6.0～10.0 范圍內，QFPD 對 0NOO^- 的響應較強，熒光強度降低了數十倍。

2.3 探針QFPD對ONOO的滴定實驗

在優化的實驗條件下，檢測QFPD探針對不同濃度 0NOO^- 的熒光響應。如圖3所示，在PBS（ 10.0mmol/L ， pH=7.4 體系中，隨著 0NOO^- 濃度 （0～20μmol/L ）不斷增大，探針在 580nm 處的熒光強度逐漸下降直至趨于平緩。在 1.4～12μmol/L 濃度范圍內，體系的熒光強度與 0NOO^- 濃度具有良好的線性關系，線性回歸方程為 y=-64.08x+927.34 R²=0.9932 ），檢出限（LOD， 3σ/k 為 1.37μmol/L 。

2.4探針QFPD對ONOO的選擇性和抗干擾能力

選擇性是評價探針性能的重要指標之一。選擇常見的陰離子、氨基酸和活性氧物種作為干擾物質進行干擾實驗，結果見圖4。當體系中存在上述干擾物質時，未對探針識別 0NOO^- 產生明顯影響，表明

探針QFPD對ONOO具有良好的選擇性。

2.5 探針QFPD對HepG2細胞和Raw264.7細胞的毒性實驗

CCK-8細胞毒理實驗結果表明，探針QFPD濃度低于 25μmol/L 時，HepG2細胞和Raw264.7細胞的存活率均高于 90% （圖5），表明探針QFPD具有良好的細胞相容性，并且對這兩種細胞具有較低的細胞毒性。鑒于QFPD在低濃度下展現出的低毒性和良好的生物相容性，選擇 10μmol/L QFPD開展后續的細胞成像實驗。

2.6 探針QFPD對細胞內源性ONOO-的原位成像

鑒于探針QFPD在體外的良好光學特質，考察了其應用于細胞內ONOO原位成像的可行性，結果見圖6。研究發現，當Raw264.7細胞與 10μmol/L 探針QFPD共同孵育 20min 后，細胞內顯示較為明顯的黃色熒光信號（圖6B）。有研究表明，LPS 和PMA 能誘導細胞內產生 0NOO^-[22] ，因此，向細胞內分別加入PMA（ 5μg/mL ）和LPS（ 1.5μg/mL ），與細胞共孵育一定時間后，再分別向細胞內加入探針QFPD0 10μmol/L 孵育 20min ，發現細胞內的熒光信號顯著降低（圖6C和圖6D），說明PMA和LPS誘導下細胞內的 0NOO^- 顯著增加。為了進一步驗證探針QFPD是否與 0NOO^- 發生反應，使用NAC（ 1mmol/L 與細胞共孵育1h，再加入QFPD（ 10μmol/L 共孵育 20min ，發現熒光強度顯著增加（圖6E），這是由于NAC作為一種高效的ROS清除劑，減少了 ?0₂^- 與NO·的生成量[23]，從而使細胞內 0NOO^- 含量顯著降低。同時，分別將一氧化氮合酶抑制劑AG（ 1mmol/L ）和自由基清除劑TMEPO（ 300μmol/L ）與細胞共孵育一定時間后，再與探針孵育 20min ，發現細胞內的熒光強度也顯著增強（圖6F和6G），進一步證實了QFPD可以實現對細胞內 0NOO^- 的原位檢測。以HepG2細胞為模型細胞開展上述實驗，得到了與Raw264.7細胞成像相同的趨勢（圖6H＼～6N），進一步證明了探針QFPD可用于靈敏檢測細胞內源性 0NOO^- 濃度變化和原位成像，具有良好的應用前景。

考察了微塑料污染對細胞造成的影響。以不同濃度的PMMA溶液與HepG2細胞共孵育 24h ，再與探針孵育一定時間后進行成像研究。如圖7所示，隨著PMMA濃度升高（5、10、20和 50μg/mL ），細胞內的熒光信號較探針單獨存在時逐漸降低，說明在微塑料的刺激下，細胞內會產生氧化應激，導致 0NOO^- 濃度激增，有可能損害細胞正常功能。這也從另一方面驗證了探針能夠監測到微塑料（PMMA）刺激下體內 0NOO^- 濃度水平的波動。

目前， Hg²⁺ 污染已成為備受關注的重金屬污染問題。 Hg²⁺ 具有很強的神經毒性，可刺激氧化應激反應，脅迫細胞產生活性氮物種[24]。本研究設計了兩組實驗，以考察探針QFPD用于監控 Hg²⁺ 脅迫下細胞發生應激反應產生 0NOO^- 的能力： （1）Hg²⁺（5μmol/L） 與HepG2細胞共同孵育不同時間（15、30和60min ）；（2）不同濃度的 Hg²⁺（5， 10 和 50μmol/L ）對HepG2細胞短時間的急性中毒實驗，結果見電子版文后支持信息圖S10。由圖S10A和S10C可見，隨著時間延長， 細胞內的熒光信號顯著降低，表明 Hg²⁺ 能夠刺激細胞產生 0NOO^- ；隨著 Hg²⁺ 濃度提高， 0NOO^- 的生成量增加，細胞內的熒光強度逐漸降低（圖S10B和S10D）。以上實驗結果證明，探針QFPD具備實時監控 Hg²⁺ 脅迫下細胞應激反應以及0NOO^- 水平波動的能力。本研究為環境污染物引起的氧化應激研究提供了一種新方法，為環境污染的監測和治理提供了新思路。

3 結論

本研究以喹啉為熒光母體、二苯基麟酰胺為 0NOO^- 特異性識別基團，設計開發了一種具有大Stokes位移（ 130nm 、可特異性識別 0NOO^- 的熒光探針QFPD。具有強氧化性的 0NOO^- 可觸發磷酰胺鍵斷裂并導致熒光猝滅，使溶液顏色由黃色變為紫色。此熒光探針具有檢測靈敏度高、選擇性好、pH適用范圍寬和生物相容性好等優點。利用QFPD成功實現了細胞內源性 0NOO^- 的原位成像監控。此探針也被用于 Hg²⁺ 和微塑料PMMA脅迫下的細胞應激反應過程的監控以及細胞內 0NOO^- 水平波動的動態監測，發現污染物通過誘導氧化應激導致ONOO水平激增，為相關環境污染物的毒理學研究提供了直接證據。

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1（College of Biological Engineering， Qingdao University of Science and Technology， Qingdao 266042， China）

2（Liaoning Key Laboratory of Development and Utilization for Natural Products Active Molecules， School of Chemistry and Life Science， Anshan Normal University， Anshan 1140O7， China） 3（Yantai Institute of Coastal Zone Research， Chinese Academy of Sciences， Yantai 264003， China）

AbstractPeroxynitriteanion （ONOO）， which is originatedfrom the reaction of nitric oxide （NO）and superoxide anion （ 0₂^-） ， plays a pivotal role in immune defense and signal regulation. Excessive levels of ONOO may induce the occurrence of various diseases such as Alzheimer's disease，inflammation，cardiovascular disease and cancer， etc. Existing detection methods for ONOO ^- have limitations such as complexity， time consumption， and low cell biocompatibility. In this study，a novel fluorescent probe QFPD was developed using quinoline and diphenylphosphinamide as fluorescent keleton and recognition group，respectively. The strong oxidizing property of ONOO' triggerd the cleavage of phosphoramide bond，leading to fluorescence quenching and a visible color change of the solution from yellw to purple，thereby enabling“ON-OFF” type recognition of ONOO.QFPD exhibited excellent characteristics including good selectivityand high sensitivity in fluorescence detection （Limit of detection of 1.37μmol/L ），large Stokesshift（ 130nm ）， rapid response （1O min），and strong antiinterference ability.Additionally，QFPDdemonstrated good biocompatibilityand could realize real-time dynamic monitoring of endogenous ONOO\". Furthermore， QFPD was successfully applied to environmental toxicology researchby visualizing the oxidative stress effects induced by microplastics polymethyl methacrylate （PMMA）and （20 Hg²⁺ exposure，which might be a novel tool for the mechanism research on oxidative stress associated with microplastic pollution and heavy metal exposure.