三七總皂苷對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及抗焦亡機制研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.14.007

EfectsofPanaxNotoginsengSaponinsonMyocardiallschemia-reperfusionInjuryinRatsandtheMechanismofAnti-pyroptosis ZHAOWeikun1，UTongtong'，UXiangwe，QNYang1，LUFengxia1，Yuting2，HUANGYul，OQ，UHuaxin，Ue

1.TheFirst AfaesiafuindaUveitunag，ina;uiicavsit99 Guangxi， China

Corresponding AuthorQINYang，E-mail：1258778506@qq.com;LYU Xiangwei，E-mail：lvxiangwei910 @ 163.com

AbstractObjective：ToobservetheefectofPanaxnotoginsengsaponins（PNS）onmyocardialischemia-repefusion（I）injuryand exploreitsmechanismrelatedtotheregulationofcardiomyocytepyroptosis.Methods：EighteenadultmaleSDratsweredividedintosham group，IR groupandPSgroupbyrandomnumbertablemethod，with6ratsineach group.Themodelwaspreparedbyligatigtheleft anteriordescendingcoronaryarteryAD）ofratswithischemiafor30minutesandreperfusionfor2hours.Theatsinthesamgroupand the IR groupwere intraperitoneally injectedwith normal saline（ 10mL/kg） ，while those in the PNS groupwere intraperitoneally injected with （20 PNS（50mg/kg） 30 minutes before modeling.The degree of myocardial injury was observed by hematoxylin-eosin（HE） staining.The expresionofcsteineaspartatespecicprotease-1Caspase1）asdetectedyimmunoistochemistryeexpresiosofCaspse1 andgasdermin D（GSDMD）proteincontentsinmyocardialtisseweredetectedbyWesternBlotResuts：Comparedwiththeshamgroup， thedegree ofmyocardialinjuryintheIRgroupwasaggravated，andtheproteinexpressionsofaspase-1andGDinceased Plt; 0.05）.ComparedwiththeIRgroup，thedegreeofmyocardialinjuryinthePNSgroupwasaleviatedandtheproteinexpressionsof Caspase-1 and GSDMD decreased（ ?∠1.5^′ .Conclusion：Panax notoginseng saponins could alleviate myocardial iR injury in rats，and its mechanism might relate to the inhibition of cardiomyocyte pyroptosis.

Keywordsmyocardialiscemiareperfusioninjuypanaxotogisengsapons;pyptosis;csteineaspasticaidspeificote1 （Caspase-1） ; gasdermin D（GSDMD）; rats; experimental study

急性心肌梗死（acutemyocardial infarction，AMI）發生時，早期治療可恢復缺血心肌的血液供應，降低死亡風險；持續的缺血狀態導致心肌細胞出現不可逆性損害。經皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術可快速恢復中斷的血流，是挽救存活心肌的有效方法。然而，恢復血流可能增加心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusioninjury，MiRl）引起的其他并發癥和心肌細胞死亡的風險。MIRI促進心肌組織釋放大量的炎癥細胞和氧自由基，細胞離子穩態失衡，引起心肌細胞死亡，最終導致一系列結構和功能障礙[1]。細胞焦亡是一種作用機制和形態學上特殊的細胞死亡形式，認為是依賴炎性半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1（cysteine aspastic acid-specific protease-1，Caspase-1）水解消化道皮膚素D（gasderminD，GSDMD）的一種單核細胞死亡，進而募集較多炎性因子，并伴有炎癥級聯反應[2-3]。有研究發現，細胞焦亡在MIRI中顯著增加，是心肌細胞死亡的重要途徑[4]。三七總皂苷（panaxnotoginsengsaponins，PNS）是中藥材三七的主要提取物，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗氧化、清除自由基等，可改善心肌細胞損傷[5]。相關研究顯示，PNS通過抑制氧化應激、炎癥反應和細胞凋亡等改善MIRI，發揮心臟保護作用[。然而，國內外關于PNS與心肌細胞焦亡和MIRI關系的相關研究報道較少。本研究旨在探討PNS對大鼠MIRI的可能保護作用機制。

1材料與方法

1.1 實驗動物

選取18只無特定病原體（SPF）級SpragueDawley（SD）雄性大鼠，體質量 200～2309 。所有實驗過程均經桂林醫科大學動物倫理委員會批準（編號：GLMC201903060）。大鼠飼養在12h光照/黑暗循環交替下，溫度 20～25^°C ，濕度 50%～60% ，通風較好，安靜無噪聲，予以合適的潔凈水及標準動物飼料，術前12h禁食，不禁水。大鼠在麻醉狀態下進行有創操作，減輕大鼠的疼痛。

1.2 實驗試劑

抗體GSDMD、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Caspase-1購自上海Abcam公司；二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量分析試劑盒購自Beyotime公司（Changsha，China）。

1.3實驗分組

隨機將SD大鼠分為假手術組、IR組和PNS組，各6只。予以 1% 戊巴比妥鈉（ 40mg/kg 對大鼠進行腹腔麻醉，麻醉后固定在動物手術臺，氣管插管后，使用小型動物呼吸機進行通氣。之后在胸骨左緣第4肋間實施開胸手術，打開心包，充分暴露心臟。假手術組大鼠開胸后僅在左前降支（LAD）下穿6/0尼龍線在活結中，使結扎末端外露；IR組距離LAD根部 4mm 處結扎 ，松開結扎線，再恢復血流灌注 2h 。PNS組SD大鼠于造模前 0.5h 予腹腔注射PNS 50mg/kg^[7] ；假手術組和IR組大鼠腹腔注射生理鹽水 10mL/kg 。

1.4心肌組織病理學變化

再灌注結束后立即將解剖出來的心臟以生理鹽水清洗血液，將心臟在 4% 多聚甲醛溶液中浸泡，石蠟包埋，制成 5μm 厚的石蠟薄片，在二甲苯I中浸泡脫蠟，梯度乙醇水化，用蒸餾水洗滌，之后進行蘇木精-伊紅（hematoxylinandeosin，HE）染色。染色結束后予以樹脂進行封片，并在光學顯微鏡（200倍）下，觀察心肌病理學改變。為定量評估心肌損傷，由2名實驗方案不知情的獨立觀察者對切片進行損傷評分8，形態學標準：0分為無損傷；1分（輕度）為間質水腫和局灶性壞死；2分（中度）伴有廣泛的心肌細胞腫脹和壞死；3分（嚴重）伴有收縮帶、毛細血管壓迫性壞死和炎性細胞浸潤;4分（危重度）指彌漫性壞死伴收縮帶、中性粒細胞浸潤和出血。

1.5免疫組化檢測細胞焦亡Caspase-1蛋白表達

按試劑盒說明書操作進行，石蠟切片經二甲苯及梯度乙醇常規脫蠟至水化，修復抗原，將玻片置于內源性過氧化物酶阻斷劑中孵育 10min ，血清封閉，室溫孵育 20min ，一抗（Caspase-1）孵育， 4^°C 冰箱中保存過夜；二抗孵育 15min ，二氨基聯苯胺（DAB）顯示液顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，吹干后封片。使用光學顯微鏡觀察每個標本，并隨機選取的樣品予以200倍放大。

1.6蛋白免疫印跡法（WesternBlot）檢測細胞焦亡相關蛋白的表達

取 100mg 剪成碎片的心肌組織置于生理鹽水中清洗，在含有 1% 苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA緩沖液中充分勻漿 30min ，裂解后轉移到 1.5mL 的離心管中，以 12000r/min ， 4^°C 離心 10min ，將收集的上清液煮沸 5min ，使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度，蛋白質在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上運行，并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后將PVDF膜與一抗（Caspase-1、DSDMD、GAPDH）室溫孵育過夜，之后經辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫下孵育2h，通過化學發光系統檢測蛋白。

1.7 統計學處理

采用GraphPadPrism6.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數士標準差 表示，3組間比較采用單因素方差分析。以 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1PNS對大鼠心肌病理結構的影響

假手術組大鼠心肌細胞排列規則，心肌組織纖維整齊，無纖維結構異常；與假手術組比較，IR組大鼠心肌細胞排列紊亂，細胞核散亂無序，心肌組織肌纖維紊亂甚至斷裂、肌絲溶解等病理變化，心肌損傷分數增加（ Plt;0.05） ；與IR組比較，PNS組心肌細胞排列較為完整，壞死心肌細胞減少，心肌組織纖維排列較整齊、形態較完整，心肌損傷分數降低（ Plt;0.05 ，心肌損傷得到明顯改善。詳見圖1、圖2。

圖13組心肌組織病理學改變（HE染色， ×200 一

圖23組心肌損傷分數比較（IR組與假手術組比較， 與IR組比較， #Plt;0.05 ）

2.2PNS對大鼠心肌細胞焦亡相關蛋白表達的影響

免疫組化驗證Caspase-1的表達水平，Caspase-1蛋白心肌細胞質黃色或棕黃色為陽性細胞表達。與假手術組比較，IR組Caspase-1蛋白表達增加；與IR組比較，PNS組Caspase-1蛋白表達減少（ Plt;0.05 。詳見圖3、圖4。

圖33組心肌細胞焦亡蛋白Caspase-1光鏡圖（免疫組化， ×200 一

圖43組心肌組織Caspase-1定量分析變化（IR組與假手術組比較， ：與IR組比較， #Plt;0.05 ）

與假手術組比較，IR組焦亡相關蛋白Caspase-1、GSDMD增高；與IR組比較，PNS組焦亡相關蛋白Caspase-1、GSDMD降低（ Plt;0.05， 。PNS可一定程度抑制MIRI導致的心肌細胞焦亡。詳見圖 5～ 圖7。

圖53組心肌組織Caspase-1、GSDMD蛋白表達條帶圖

3討論

MIRI具有較高的致殘率、致死率，顯著影響AMI病人的臨床療效和長期預后。目前，MIRI可能發生的機制主要涉及鈣超載、氧化應激、線粒體損傷、炎癥反應和自噬等[9-11]。區別于心肌細胞死亡的其他形式，細胞焦亡是新發現的、具有高度的促炎性，由Caspase-1介導激活和GSDMD執行的程序性細胞死亡過程。細胞焦亡與MIRI的經典機制相互交織[12-16]，激活炎癥小體，活化Caspase-1，引發細胞焦亡，進而加重MIRI。故抑制心肌細胞焦亡對改善MIRI有重要的臨床意義。

本研究構建MIRI模型，結果顯示，PNS可減輕缺血大鼠病理結構改變及心肌損傷程度減輕；IR組Caspase-1和GSDMD蛋白升高，提示MIRI可能是由于誘導心肌細胞焦亡引起的，應用PNS可顯著降低焦亡蛋白Caspase-1和GSDMD表達，減輕MIRI。

細胞焦亡是一種新型細胞程序性死亡，依賴于活化的Caspase-1，介導執行GSDMD使細胞質膜形成孔隙，進而發生脹大直至細胞膜破裂，釋放大量細胞內容物，其特征表現為Caspase-1活化、細胞膜孔形成及促炎因子的細胞外釋放。其中，Caspase-1對細胞焦亡發揮著關鍵作用。在細胞模式識別受體的介導下，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3、凋亡相關斑點樣蛋白和Caspase-1前體組成炎性小體，進而引起3個蛋白的結構域暴露，之后結構域緊密結合，激活無活性的Caspase-1，進一步裂解促炎性細胞因子前體轉變為成熟體，導致炎性生物活性物質釋放至細胞外，從而募集更多的炎性細胞，炎癥反應被放大，啟動下游一系列的炎癥應答，導致疾病的發生與發展[17]。相關研究發現，炎癥小體介導的Caspase-1活性增強，進而誘導細胞焦亡在MIRI中發揮重要作用1]。敲除Caspase-1可顯著縮小心肌缺血面積，改善MIRI后心室重構，表明Caspase-1可能是減輕MIRI的有效靶點之—[19]。使用Caspase-1抑制劑可預防心肌損傷，減輕再灌注損傷[20]。本研究結果顯示，IR組心肌損傷程度嚴重，Caspase-1蛋白表達增加；應用PNS后，心肌損傷程度減輕，Caspase-1蛋白表達降低。提示PNS可能通過抑制Caspase-1，進而調控焦亡，減輕MIRI。

GSDMD是Gasdermin結構域保守蛋白家族中機制研究明確的蛋白，主要通過依賴Caspase-1的經典細胞焦亡途徑，可一定程度反映機體的細胞焦亡過程和炎癥水平[21]。細胞焦亡發生時，在激活的Caspase-1介導下，GSDMD蛋白被分割成C端和N端結構域，GSDMD-N識別并結合細胞膜上的磷脂類分子后，形成細胞膜表面孔道，進而導致細胞腫脹，質膜裂解，細胞內容物的泄漏及炎性因子的釋放，進而介導細胞焦亡[22]。炎性因子釋放進一步激發細胞裂解信號途徑，最終引發細胞死亡；GSDMD可激活由炎癥小體介導的Caspase-1，促使細胞焦亡持續發生[23]。相關研究顯示，心肌細胞中GSDMD缺失使心肌梗死面積顯著縮小，GSDMD基因缺失阻斷了MIRI誘導的心肌細胞焦亡[24]。本研究結果顯示，IR組焦亡蛋白GSDMD含量增高；應用PNS后，可降低焦亡蛋白GSDMD的表達。

綜上所述，心肌細胞死亡是MIRI的終末事件，涉及的相關分子機制復雜。細胞焦亡是一種高度促炎的細胞死亡形式，主要是由Caspase-1、GSDMD兩個關鍵蛋白參與，與多種心血管疾病的發生發展密切相關。本研究結果提示，心肌細胞焦亡與MIRI密切相關，PNS對MIRI具有明顯的保護作用，其機制可能與下調心肌細胞焦亡蛋白Caspase-1、GSDMD表達，減少心肌細胞焦亡有關。本研究存在一定的局限性：未檢測白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等炎性因子；針對PNS以何種路徑介導抑制心肌細胞焦亡的機制尚未明確，有待深入研究，以期為MIRI的臨床預防和治療提供可能的新思路。

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