微流管蛋白納米孔組裝及單分子分析

在人工脂雙層上組裝膜蛋白通道是通道阻滯劑藥物的開發和篩選、蛋白通道生物物理性質研究以及單分子電化學分析的基本平臺，其基本原理是基于分析物或者藥物分子對通道阻塞所致的電導變化[1-2]，其變化幅度和頻率與分析物的結構、大小、濃度以及生物分子的序列和構象等直接相關。近年來，這種單分子技術已得到了廣泛應用，分析對象包括無機金屬離子、有機物等小分子以及蛋白質、DNA和RNA等大分子。基因工程和化學修飾使納米通道的功能進一步擴充，已經發展成為單分子化學反應研究、DNA 和蛋白質快速測序以及單分子分析測量的有效工具[3-I1]。但是，脂雙層的易脆性和不穩定性限制了其進一步發展和商業化應用。

傳統的平面無支撐脂雙層形成方法是Montalamp; Mueller法[12-13]，是由兩個水/空氣界面脂單層在微米大小的 Teflon微孔上融合而成。為了改善脂雙層的壽命，研究者進行了大量工作。牛津大學Bayley研究組[14-17]利用在油相中形成的水凝膠構建脂雙層3D 網絡和蛋白通道平臺，但技術要求較高。Kang 等[18]前期使用凝膠包裹脂雙層構建蛋白通道芯片[19]，壽命可達 48h 。荷蘭格羅寧根生物分子科學和生物技術研究所Haiza等[20]通過微加工 Si/SiO₂ 芯片調制微孔大小和形狀改善脂雙層。加州大學洛杉磯分校的Schmidt研究組[21]和東京大學的Takeuchi研究組[2]分別設計了微流十字交叉芯片，在水/有機介質界面微流自動形成脂雙層，可大大減少納米通道檢測的樣品量，過程易于自動控制，但成功率僅為 30%

本研究采用微流管與屏蔽管套的雙管結構設計，開發了微流管火花打孔的新方法。本方法能夠在微流管壁的任意選定位置精確形成高度密封且結構穩定的脂雙層及膜蛋白通道。通過將微流控與納流技術相結合，本方法展現出優異的重現性和抗干擾能力，使納米孔檢測的分辨率與靈敏度得到顯著提升，為納米孔單分子技術從實驗室研究走向實際應用提供了有效途徑。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Axopatch200B膜片鉗放大器、1440A型數模A/D轉換器和 pClamp10.0 數據處理軟件（美國AxonInstruments公司）；4040A型函數發生器（美國BKPrecision公司）；精準火花發生器（美國Daedalon公司）。直徑200、500和 800μm 的 Teflon管（壁厚 38μm ，美國Goodfellow公司）。植烷酸卵磷脂（DPhPC，美國AvantiPolarLipids公司）；無水戊烷（ gt;99.7% ，美國Honeywell Burdickamp; Jackson公司）；十六烷0 599% ，美國Sigma-Aldrich公司）。實驗用水為超純水（ 18.2MΩ^?cm ）

1.2 實驗方法

1.2.1 a 溶血素 （a-HL） 的表達、純化及組裝

依據文獻[23]的方法從金黃色葡萄球菌中分離和純化天然單體 α-HL 。由單體 α -HL在兔紅細胞膜上實現七聚體 α -HL 的組裝及十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離和純化[24]，采用體外轉錄和表達技術制備 α -HL（M113F/K147N）突變體[25]。

1.2.2Teflon微流管微孔的制作

采用特制的火花穿孔器在微流管上電激穿孔。火花穿孔器由火花發生器和兩個鉑絲電極組成。兩個電極互相垂直排列，一個伸入Teflon內管，另一個垂直放在Teflon 管外，調節電激距離和電激次數即可通過尖端火花放電在Teflon管壁上形成直徑 10～60μm 的不同微孔。

1.2.3 平面脂雙層及蛋白質通道電子記錄

本研究采用自制的雙管微流系統，通過改良的Montal-Mueller法[12-13]形成DPhPC脂雙層。Teflon 微流管上的微孔將系統分隔為cis室（微管內）和trans室（微管外），兩室分別放置 Ag/AgCl 電極。在脂雙層形成前，采用十六烷-戊烷（1：10，V/V）混合溶液處理微孔。通過實時監測膜電容變化追蹤脂雙層的形成過程。脂雙層形成后，向cis室注人目標蛋白，使其自發重組形成跨膜通道。采用膜片鉗放大器記錄實時電流（內置 5kHz 低通濾波器，計算機采樣頻率 20kHz ），其中cis室的 Ag/AgCl 電極始終保持接地狀態。施加正電位意味著trans室具有較高的電位，對應 α-HL 結構的帽子區朝向cis室， β 折疊區朝向Trans室。

2 結果與討論

2.1Teflon微流管納米孔傳感器的設計與無支撐脂雙層膜的形成

微流管納米孔傳感器采用雙管設計，內管為具有微孔的Teflon微流管，外管為直徑大于內管的玻璃屏蔽管，玻璃可透光，便于觀察微孔。Teflon微流管納米孔裝置的設計與無支撐弧形脂雙層膜的形成過程如圖1所示，弧形脂雙層和蛋白通道均在無防震臺、無屏蔽籠情況下形成。首先垂直放置裝置（圖1A），分別在內管和管間注射含 1% DPhPC脂的戊烷溶液（油相）和含 1mol/LNaCl 的 10mmol/L Tris-HCl緩沖液（ pH 7.4） （水相），并保持液面在微孔下（圖1B）。溶液靜置 2min ，在油/水界面自組裝形成脂單層，然后再繼續注射水相溶液，直至油/水界面通過微流孔，微孔兩端的油/水界面脂單層依靠范德華力和毛細作用力融合，自發形成脂雙層（圖1C和1D）。形成脂雙層的關鍵是油/水界面形成完好的脂單層。為此，溶液必須保持靜置至少 2min ，而與隨后液面上升的速度無關。如果向cis室注射膜蛋白，數分鐘內即可自發組裝形成蛋白質通道（圖1E）。

此微流控成膜系統通過光學與電化學方法檢測脂雙層形成過程。由圖2A和2B可見微孔在脂雙層形成前后的光學成像存在差異，其中藍色標記區域為脂雙層，與孔邊緣過渡區構成脂單層。弧形脂雙層結構如圖2C所示，可完全密封微孔。對脂雙層膜施加三角波電位循環掃描，可記錄到瞬態方波膜電容電流（圖2D）。在 50μm 微孔上，由膜電流計算得到的膜電容值為 65pF ，根據膜電容（ C_m） 與膜厚度 （l_m） 的

關系（ C_m=ε₀ε_mA_m/l_m ，其中， ε₀ 為真空介電常數； ε_m 為膜電容的介電常數，脂膜的 ε_m=2 ： A_m 為膜的面積），推導出脂雙層厚度為 4.0nm 。通過測量膜電流計算得到膜電阻為 18GΩ ，這種脂雙層膜的高密封電阻支持pA級納米通道電流的高分辨率無泄漏檢測。系統穩定性測試結果（圖2E）表明，脂雙層形成 42h 后，膜電容電流方波仍保持完整波形且無衰減，而傳統Montal-Mueller法在 120μm Teflon片上形成的平面脂雙層（圖2F）僅 2h 即出現波形畸變和嚴重漏電，充分證明微流控系統形成的弧形脂雙層具有顯著的結構穩定性和電學密封性優勢。

2.2 微流管微孔大小與弧形脂雙層膜的穩定性

采用特制的火花穿孔器可以在微流管上電激穿孔制作直徑 10～60μm 的微孔。圖3為一組Teflon管微孔照片，可見微孔為圓形，形狀規則且邊緣光滑無毛刺。采用傳統方法在Teflon片上能夠獲得的微孔最小直徑為 80μm^[26] 。采用本方法在 Teflon管上可以很容易地形成 10μm 的微孔，這可能與 Teflon 管的微曲面有關。為了證實微孔大小與脂雙層穩定性有關，測試并記錄了膜電容電流方波形狀和泄漏電流大小以確定脂雙層壽命，結果見表1。在 10μm 的微孔上微流形成的弧形脂雙層膜壽命可達 98h ，微流管越小，脂雙層膜越穩定，這與文獻[27]在SU-8聚合物底物上光刻微孔的結果一致。此外，通過對直徑500和 800μm 的兩種微流管的測試結果可以看出，脂雙層膜壽命與微流管大小關系不大。此外，傳統的電化學測試必須在防震臺上和屏蔽籠中進行，以減少機械振動和電磁干擾，否則對于pA級的電流無法檢測。微流管的脂雙層膜測試系統突破了傳統電化學檢測需防震臺/屏蔽籠的限制，其雙管式微型化結構既消除了pA級電流測量的環境干擾，又具有便攜性，所構建的弧形脂雙層膜在形態和穩定性上均優于平面仿生膜，更接近天然細胞膜特征。

2.3脂雙層膜上膜蛋白重組、噪音分析和通道電子性質

為驗證微流系統構建的脂雙層膜的功能特性，選用天然 α -HL（溶液狀態為七聚體）和突變體 α -HL（M113F/K147N）（溶液狀態為單體）進行對比研究。分別在微流管裝置的cis室注射1.5fg兩種膜蛋白后，二者在數分鐘內均可形成單通道，可觀察到電壓驅動下離子電流由 階向單通道電流階的階躍，說明天然 α -HL蛋白能夠以完整的七聚體形式直接插入脂雙層而形成通道，而 α -HL（M113F/K147N）會吸附在脂雙層膜表面重組后形成七聚體 α-HL（M113F/K147N）₇ 單通道。在含1mol/LNaCl的 10mmol/L Tris-HCl（ pH7.4） 緩沖液中，施加 +40mV 電壓， α -HL（M113F/K147N） 通道電流為 （28.68±0.16 pA（n=3） ；施加 -40mV 電壓，通道電流為為 （-30.07±0.18）pA（n=3） 。這與文獻[28]報道的通道電流值基本一致。上述實驗結果表明，微流系統生成的脂雙層膜具有很好的仿生流動性和活性，膜蛋白能夠直接嵌入或重組產生通道。

在傳統方法制備的平面脂雙層和微流系統的弧形脂雙層上，天然 α -HL形成的通道噪音不同（圖4）。在 120mV 電位下， 1mol/LNaCl 溶液中記錄的天然 α-HL 通道電流（圖4A）和偏離基線電流的標準偏差分別為2.15和 0.98pA ，直方圖中通道電流的半峰寬分別是（ 4.85±0.01 pA和（ （1.89±0.01 ）pA。因此，弧形脂雙層上形成的蛋白質通道具有較小的干擾噪音，在分析測試中具有較高的信噪比。

為了進一步驗證所構建的蛋白質通道的性質，研究了 β -環糊精（ β -CD）在天然 α-HL 通道中的鍵合情況。在微流裝置的Trans室中加入 β -CD，記錄并分析 -40mV 電壓下 β -CD分子在通道中的鍵合電流曲線（圖5A）。通過統計 β. -CD分子在通道中的平均鍵合時間 （τ_off） 和時間間隔（ （τ_on） ，分別計算鍵合速率和解離速率 k_on=1/（C?τ_on） ， k_off=1/τ_off? ，可得 β -CD分子在 25°C 的鍵合平衡常數 K_f=k_on/k_off=（310±12）L/mol （n=3 ），與文獻[29]的數值（ 290L/mol ）相近，證實微流系統組裝的蛋白質通道性質未發生變化。本研究針對生物素（Biotin，分子量244，一種重要的小分子維生素）與 β -CD的弱相互作用特性，克服了傳統納米孔技術因分辨率不足導致的檢測限制，采用微流控系統蛋白質通道實現了單分子水平的作用力分析。圖5B是在 -120mV 電壓下的代表性 I-t 曲線。將 β -CD分子加入trans室，生物素加人cis室，通過 ?_I-t 曲線統計萃取 τ_off 和 τ_on ，計算得到 β. -CD分子與生物素分子的鍵合常數為 （320±30）L/mol（n=3，25^°C） ，此結果與核磁共振測量值（ 290L/mol ）一致[30，表明微流管蛋白質納米孔技術可用于高分辨率要求的單分子分析。

3 結論

本研究設計并搭建了一種新型雙管式微流納米孔分析系統。基于本研究開發的微孔加工技術，可在微流管指定位置上精確制備最小直徑為 10μm 的微孔。為實現多網絡納米孔并行（如多孔微流管或平行多微流管陣列）提供了技術基礎。此系統實現了納米孔的光電同步檢測功能，克服了傳統系統因光路限制導致的光學信號采集難題，不僅支持光調制納米孔的電學檢測，還可拓展應用于光化學反應過程及光生自由基的納米孔單分子研究。此微流管蛋白質納米孔系統具有小型化、便攜和容易自動化控制的優點，可以大大減少樣品的使用量，更為重要的是，系統的抗干擾能力使其特別適合于高分辨率要求的單分子分析。

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Assembly of Protein Nanopore in Microfluidic Tube and Its Application in Single-Molecule Analysis

ZHENG Peng'，SHI Xin-Yu1，WEI Xing-Peng'，KANG Xiao-Feng *2 1（Shandong Feiyang Chemical Co. Ltd.， Taian 271200， China） （204號 ² （College of Chemistry and Materials Science，Northwest University， Xi'an 710127， Chia）

AbstractAs the simplest label-free single-moleculeanalytical technique in solution，nanopore technology has been widely used in rapid sequencing of protein and nucleic acid，and single-molecule sensing. However，the main challenge is to getthis technology outof thelabandachieve automation，miniaturizationas wellas rapidanalysisat high throughput. In this work，a new microfluidic tubing protein nanopore analysis system was designed and constructed by combining microfluidic and nanopore nanofluidic analysis techniques.Anarcuate lipid bilayer was formed in the microfluidic device through lipid monolayer at the oil/water interface by developed aperture processing technology at 10μm level. The arcuate lipid bilayer with the life span of more than 98 h had high biomimetic fluidity and biological activity by which protein channel could be produced and sealed at 18 GΩ level without leakage. When applied +40mV potential， relative standard deviation of single protein α -hemolysin mutant （ α -HL（M113F/K147N）） channel current was less than 0.16pA （n=3） in 10 mmol/L Tris-HCl （pH7.4） buffer containing 1 mol/L NaCl.Single-molecule detection for aptamer and its host-guest interactions with biotin in protein channel demonstrated that this microfluidic tube protein nanopore sensor could well work with high sensitivity without the need of anti-vibration table and shielding cage.