雙體積液滴對數字液滴PCR定量檢測能力提升的研究

隨著分子生物學技術[1-2]的不斷發展以及微機電系統與微納制造技術的進步，核酸檢測技術已成為單細胞分析[3]、遺傳病檢測[4]、基因序列分析[5]和食品安全[6]等領域的重要工具。以食品安全檢測為例，凝膠電泳聚合酶鏈式反應（PCR）[6]、實時熒光定量 PCR^[7] 、核酸探針[8-9]、環介導等溫擴增[10-12]、液滴數字 PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）[13-17]和數字芯片 PCR（Chamber digital PCR，cdPCR）[18-21]等均為典型的核酸檢測技術。與實時熒光定量PCR相比，數字PCR技術不依賴于循環閾值[22]和標準曲線[23]，在核酸絕對定量方面具有顯著優勢[24-25]。其中，ddPCR技術通過油包水液滴將樣本分割為成千上萬份的數字樣本，極大地提高了PCR定量檢測的靈活性與定量分析性能，其定量分析原理服從泊松分布，應盡量滿足“單液滴中包裹不超過1個核酸片段”的前提條件。

數字PCR技術的3個核心指標分別是定量上限（Upper limitof quantification，ULQ）、定量下限（Lowerdetection limit，LDL）和動態范圍（Dynamic range，DR）[26]。在待測樣本總體積一定的前提下，ULQ與LDL取決于單個液滴的體積。單個液滴體積越小，說明液滴數量越多，可檢測的核酸片段豐度的定量上限越高；反之，定量下限越低。目前，ddPCR多采用體積一致的液滴單元作為反應腔室，面臨潛在檢測適配性差的問題：對于高濃度核酸樣本，若液滴體積偏大，易導致液滴中包裹核酸片段的數量超過1個；對于低濃度核酸樣本，若液滴體積偏小，導致空液滴概率顯著提高，影響檢測效率。對于未知濃度的樣本，單一體積的數字液滴 PCR 檢測無法兼顧ULQ與LDL[27]，進而影響定量檢測結果的精度，在實際操作中通常需要多次嘗試以確定液滴體積和核酸豐度的最佳適配條件，難以滿足珍貴樣本檢測場景中的“零試錯”需求。

為了降低試錯成本，本研究制備了一步法雙體積ddPCR微流控芯片，單步操作可生成一大一小兩種尺寸的微液滴，分別適配低豐度和高豐度的核酸樣本，適用于對未知濃度的珍貴核酸樣本進行絕對定量檢測。此微流控芯片包括十字流道區、階梯區、倉儲區和觀察區等基本功能單元，其中，十字流道區用于產生柱狀母液滴，階梯區用于母液滴二次乳化生成一大一小兩個子液滴[28-29]，倉儲區用于臨時儲存液滴和后續的核酸擴增熱循環，觀察區用于顯微圖像采集。母液滴和子液滴的尺寸均可以通過調控油水兩相流體的進樣比例實現按需調整。本研究為未知豐度珍貴樣本核酸檢測提供了新的解決方案。

1 實驗部分

1. 1 儀器與試劑

ELVE flow正壓氣源裝置，包含AF1壓力控制器（法國Elveflow公司）和MSF3壓力傳感器（法國Elveflow公司）；30L-S1600W空氣壓縮機（臺州市奧突斯工貿有限公司）；SDC200S接觸角測量儀（東莞西瓦卡精密量儀有限公司）；VR-R3等離子鍵合機（廣州善準科技有限公司）；TG16G高速離心機（江蘇東華分析儀器有限公司）；F-010SD超聲波清洗機（深圳福洋科技有限公司）；Nikon DS-Qi2倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；CKX3-OLYMPUS顯微鏡（奧林巴斯中國公司）；QX200 AutoDG數字PCR擴增儀（美國伯樂生命醫學產品有限公司）。

聚二甲基硅氧烷與固化劑（PDMS與Sylgard184，質量比10：1，美國道康寧公司）；二甲基二氯硅烷（ C₂H₆Cl₂Si ，上海阿拉丁生化科技有限公司）；十四烷（ ΔC₁₄H₃₀ 和異丙醇 ΔC₃H₈O ）（上海阿拉丁生化科技有限公司）；鯨蠟基聚乙二醇（EM90）活性劑（德國 Degussa AG公司）；WLDR21026K48鴨源性核酸恒溫擴增檢測試劑盒（安普未來生物有限公司）；MightyPrep核酸提取液（寶日醫生物技術有限公司）；Rain-X疏水試劑（美國PPG Industries公司）。硅片由武漢簡米科技有限公司生產。實驗用水均為無酶去離子水（天根生化科技（北京）有限公司）；新鮮鴨肉組織購于當地菜市場。

1.2 實驗方法

1. 2. 1 微流控芯片的制備

基于兩相流剪切力與水相表面張力相結合的原理，采用液滴制備芯片生成不同體積液滴。將二甲基二氯硅烷試劑滴在真空釜中，并將硅片置于其中，揮發 15min 后即完成易脫模處理，期間注意空氣流通。將PDMS與固化劑按質量比10：1混合，進行真空負壓抽氣泡 30min 后澆筑于硅片，并加熱 40min 。對PDMS進行切片、打孔以及等離子鍵合后，加熱，取 100μL Rain- ?X 疏水試劑，打入PDMS的流道內部，靜置 5min 使壁面疏水化。采用異丙醇沖洗微通道 3min ，并進行加熱干燥。

1.2. 2 核酸樣本的制備

取 25mg 鴨肉組織樣本，剪碎后置于 1mL 離心管中。移取 100μL MightyPrep核酸提取液至離心管中，振蕩，確保核酸提取液與組織碎塊充分混合。在 95‰ 加熱 10min ，使鴨肉組織充分裂解并釋放DNA。 15000r/min 離心 2min ，吸取上清液，得到PCR反應所需的DNA模板。本研究主要的目的是提升ddPCR微流控芯片的定量檢測范圍，因此設計了3種濃度的核酸樣本：樣本一為DNA豐度較高的樣本，用于分析小體積液滴對于大體積液滴的定量上限的優勢；樣本二為DNA豐度較低的樣本，用于分析大體積液滴對于小體積液滴的定量下限的優勢；樣本三為濃度介于二者之間的DNA樣本，用于分析面向中等豐度樣本時的定量檢測能力。

1. 2.3 液滴生成

采用ELVEflowAFI正壓氣源裝置驅動油、水兩相流體進樣。油相為正十四烷與 2% （質量分數）鯨蠟基聚乙二醇（EM90）活性劑的混合物。將油相充滿整個芯片流道后，再將油水兩相樣本流體按照一定的比例（根據液滴尺寸需求，氣壓在 2～20kPa 范圍內調節）加壓注入到微流控芯片中，生成用于ddPCR的液滴。

1.2.4 熒光定量PCR擴增實驗

采用鴨源性成分恒溫擴增檢測試劑盒，反應體系包括 37.5μL 的E緩沖溶液、 2.5μL 的B緩沖溶液（ Mg²⁺ 等）以及 0～10μL 的核酸模板（濃度為 1000000copies/μL ，不足 10μL 以無菌水補齊。擴增反應參數為擴增溫度 39～42^°C ，孵化時間 4min ，檢測通道為FAM，擴增時間 15min 。陰性對照組以 10μL 無菌水代替核酸模板。

1.2.5 微流控芯片檢測

將包含有擴增后鴨源核酸樣本的液滴注入觀察芯片，采用熒光顯微鏡采集熒光圖像。采用Image J軟件處理采集的熒光圖片數據，調整閾值區分液滴的陰陽性，并依據灰度區域的面積區分大小液滴，依據泊松分布原理折算統計計算兩個體積液滴分別對應的核酸豐度。

2 結果與討論

2.1 雙體積芯片的制作與液滴的制備

雙體積液滴微流控芯片的結構如圖1所示，整體結構為“三明治”結構，自下而上由載玻片基底、PDMS 流道和蓋玻片疊加而成。由于芯片的階梯孔為通孔，為方便后續液滴在下游流道順利導出，需要在通孔頂部通過鍵合載玻片將其密封（等離子鍵合機， ，30s）。芯片的油相與水相流道的寬度均為100μm ，高度均為 40μm ，在十字交叉區寬度收縮為寬度 60μm ，階梯孔直徑為 5mm 。

雙體積液滴微流控芯片采用標準的軟光刻工藝加工，其工作原理如下：通過調節油/水兩相流體的進樣壓力，在十字流道生成不同尺寸的液柱狀母液滴，其體積可通過顯微圖像中液柱的長度和微流道的高度計算；當液柱狀母液滴接近階梯區，下游階梯結構內流場壓力驟降，在壓力差與表面張力的綜合影響下，母液滴會自發乳化成滴。受到噴嘴處表面張力的約束，液滴的曲率無法無限制增大，因此其尺寸主要取決于噴嘴的幾何尺寸。若階梯結構的上游流體為連續的水相，該過程稱之為階梯乳化。在本研究中，階梯結構上游的水相體積并非無限供給，因此下游子液滴的體積不再遵循階梯乳化的物理規律。根據質量守恒原理，階梯結構下游二次乳化生成的子液滴體積和數量取決于上游母液滴的體積。若液柱母液滴的體積恰好是乳化液滴體積的整數倍（實際上，此處并非需要嚴格遵守理想整數倍，僅需滿足在統計誤差允許的范圍內近似為整數倍即可），則可在下游獲得尺寸均一、單峰正態分布的液滴群；若液柱母液滴的體積不是乳化液滴體積的整數倍，則在階梯處斷裂生成的最后一個子液滴與前序子液滴的體積不再相等，而是取決于液柱狀母液滴內水相流體的殘余量。此過程僅需要一步操作即可得到雙體積的液滴，在下游獲得兩種尺寸、雙峰正態分布的液滴群。通過調節油/水兩相流體的進樣比例控制液柱狀母液滴的體積，即可精準調控下游子液滴的數量和體積。

為驗證上述原理，首先以無菌水溶液為分散相研究雙體積液滴的兩種尺寸關系。將芯片與油相和水相連接后，設置油相壓力為 4.0kPa 、水相壓力為 3.8kPa ，得到顯微圖像序列（圖2）。由圖2A可見，在階梯結構的下游可以觀察到兩種尺寸的子液滴。圖2B＼～2D展示了液柱狀母液滴臨近階梯時的界面演化過程。母液滴頭部首先膨脹，形成舌狀前驅體；而后舌狀前驅體發生頸縮形成球狀前驅體，并從母液滴脫離，形成第一個子液滴。此后，上游母液滴中殘余的水相體積不足以維持前序子液滴的體積，便在下游處生成了較小體積的最末一個子液滴。

通過改變油相與水相驅動壓力的比例，進而調控液柱狀母液滴的體積，進一步印證雙體積液滴的工作原理。如圖3所示，保持油相壓力為 4.0kPa ，調節水相壓力 （3.8～4.0kPa ），液柱狀母液滴的長度逐漸增加。由圖3可以明顯看到，隨著液柱狀母液滴長度增加，下游二次乳化的較大子液滴的尺寸幾乎不變（僅取決于噴嘴尺寸）；由于液柱母液滴內殘余水相體積的增加，下游乳化生成的較小液滴的尺寸也逐漸增加，符合預期。采用本方法可以靈活調整下游子液滴的體積和數量。

在油相壓力 4.0kPa 、水相壓力 3.8kPa 的條件下液滴的顯微圖像和統計直方圖如圖4所示，下游子液滴的直徑均服從雙峰正態分布（ （40.95±1.61 ） μm 和 （51.48±1.29）μm） ，兩種體積液滴直徑的變異系數分別為 3.92% 和 2.51% ，滿足核酸定量實驗需求。圖4A中有極少數的巨型液滴為液滴融合導致，可能是外部振動和微液滴撞融等偶然因素誘導產生的。

2.2 雙體積數字PCR檢測DNA

為了探究兩種體積液滴所具備的不同的絕對定量能力，設計了3種不同豐度的鴨源DNA作為分散相開展核酸檢測ddPCR實驗。3種待測樣本的核酸豐度分別為500、5000 和 20000copies/μL ，并設置不含核酸的無酶去離子水作為空白對照組。通過雙體積微流控芯片制備雙體積液滴，將所生成的液滴導出，使用PCR擴增儀進行擴增后，將液滴導人平鋪層觀察區，選擇FAM熒光通道觀察和分析擴增結果。圖5展示了不同豐度鴨源DNA模板擴增的熒光結果的灰度圖。

使用ImageJ軟件分析并統計各液滴所對應的面積區域值，通過繪制面積區域值確定大小液滴的個數以及陰性概率。圖6展示了核酸豐度為 20000copies/μL 的樣本陰陽液滴面積分布結果，重復上述依據面積劃分大小液滴的工作，得出各個DNA濃度所對應的兩種體積液滴陰性概率，如表1所示。

對于數字PCR實驗，假設單個微液滴包含的DNA分子數為 x ，根據數理統計理論， x=k（k=0，1，2 3...）的概率分布函數 p 符合泊松概率模型：

式中， λ_i 為分散微單元所含DNA分子平均拷貝數。對于樣本DNA分子拷貝濃度則有：

式中， u 為單個液滴的體積。由表1中數據可知，每組液滴所對應的陰性液滴概率 p（x=0） ，同時陰性液滴與陽性液滴概率和為1，則有：

由此得出一次數字PCR實驗中樣本DNA分子拷貝濃度為：

通過上述分析與所統計的微液滴數據，得出各組樣本對應的DNA絕對定量濃度，如表2所示。

從上述結果可見，隨著DNA豐度增加，若以小體積液滴作為定量計算的基準，DNA靶標的折算偏差從 7.722% 逐漸減小到 0.281% ；若以大體積液滴作為定量計算的基準，DNA靶標的折算偏差從 0.444% 逐漸增加到 17.822% 。以偏差不超過 5% 的可靠性作為閾值，在檢測低濃度DNA靶標時，小體積液滴的絕對定量能力并不理想。同理，隨DNA濃度增加，大體積液滴的定量偏差逐漸增大，在高濃度時其偏差為 17.882% ，若是繼續增加DNA濃度，大體積液滴將無法實現可靠的絕對定量檢測。因此，在面對未知濃度的DNA靶標時，非常有必要采用不同體積的液滴以滿足檢測可靠性的要求。

3 結論

為降低對未知豐度核酸樣本定量檢測的試錯成本，本研究設計了一款可生成雙體積液滴的微流控芯片，兩種體積液滴的數量與體積可通過改變油水兩相流體的進樣條件靈活調控。上游的十字流道處生成液柱狀母液滴，在下游階梯處二次乳化成兩種尺寸的子液滴群，雙體積液滴群具有優越的分散性，滿足ddPCR實驗需求。以鴨源性DNA的ddPCR核酸檢測為例考察方法的性能，結果表明，不同體積的液滴包裹同一核酸樣本時，折算得到的核酸豐度具有不同的定量精度。后續工作將研究雙體積液滴生成和調控機理，嘗試采用注塑工藝加工雙體積液滴微流控芯片，以滿足更多應用場景的需求。

References

[1]MAO Zhen-Zhen，HU Wen-Qi，TANG Qu，JIANG Wen-Jun，QINYu-Ling， WULi. Chin.J.Anal. Chem.，2024，52（6）： 789-798. 茅珍珍，胡文琪，唐曲，蔣汶君，秦玉嶺，吳麗.分析化學，2024，52（6）：789-798.

[2] ALAMRI A M， ALKHILAIWIF A， ULLAH KHAN N. Curr. Issues Mol. Biol.，2022， 44（10）： 4769-4789.

[3] DAROY M L G，LOPEZ JS，TORRES B C L，LOY M J， TUANO P M C， MATIAS R R. Clin. Microbiol. Infect.，2011， 17（5）： 776-779.

[4] WEI C， YUC，LI S， MENG J，LI T， CHENG J，PAN F， LI J. Anal. Chem.，2022， 94（9）： 3939-3947.

[5] WEI C，YU C，LI S， MENG J，LI T， CHENG J，LIJ. Sens. Actuators，B，2O22，371： 132473.

[6] CAO Xue-Yan， ZHANG Xiao-Dong，FAN Chun-Hai， HU Jun.Prog. Nat.Sci.，20O7， 17（5）： 580-585. 曹雪雁，張曉東，樊春海，胡鈞.自然科學進展，2007，17（5）：580-585. [7] YELIN I， AHARONY N，TAMAR E S， ARGOETTI A， MESSER E， BERENBAUM D，SHAFRAN E， KUZLI A， GANDALI N， SHKEDI O，HASHIMSHONY T， MANDEL-GUTFREUND Y， HALBERTHAL M， GEFFEN Y， SZWARCWORTCOHEN M， KISHONY R. Clin. Infect.Dis.，2020， 71（16）： 2073-2078.

[8] KOLPASHCHIKOV D M. Chem.Rev.，2010，110（8）： 4709-4723.

[9] WOLCOTT MJ.Clin.Microbiol.Rev.，1992， 5（4）： 370-386.

[10] SAFTIG P， BEERTSEN W， ESKELINEN E L. Autophagy， 2008， 4（4）： 510-512.

[11] NOTOMI T，MORI Y， TOMITA N，KANDAH. J. Microbiol.，2015，53（1）： 1-5.

[12] TOMITAN，MORI Y，KANDAH，NOTOMI T.Nat.Protoc.，20O8，3（5）： 877-882.

[13] HINDSON C M， CHEVILLET JR， BRIGGS H A， GALLICHOTTE E N， RUF I K， HINDSON B J， VESSELLA R L， TEWARI M. Nat. Methods，2013，10（10）： 1003-1005.

[14] HOUY，CHEN S， ZHENG Y，ZHENG X，LIN J. TrAC，Trends Anal. Chem.，2023，158：116897.

[15] FLOREN C， WIEDEMANN I， BRENIG B， SCHUTZ E， BECK J. Food Chem.，2015，173： 1054-1058.

[16] JOHANN D J， SHIN I J， PETERSON E， STELIGA M V， MUESSE J， MARINO K， LAUN S， GREISMAN V， EMMERTBUCK M， TANGREA M. J. Clin. Oncol. ，2021， 39（15）： e15083.

[17] YAN D， POMICTER A D， O'HARE T， DEININGER M W. Clin. Cancer Res.， 2019， 25（22）： 6561-6563.

[18] MORCIA C， CARRARA I， GHIZZONI R， TERZI V， BOLLI G， CHIUSA G. Horticulturae， 2024， 10（1）： 91.

[19] KLINE M C， DUEWER D L. Anal. Chem. ，2017，89（8）： 4648-4654.

[20] DONG X， GAO D， DONG J， CHEN W， LI Z， WANG J， LIU J. Anal. Bioanal. Chem. ，2020， 412（7）： 1701-1707.

[21] DUEWERDL，KLINE MC，ROMSOSEL.Anal.Bioanal.Chem.，2015，407（30）： 9061-9069.

[22] RHOADS D，PEAPER DR，SHE R C，NOLTE FS， WOJEWODA C M，ANDERSON N W，PRITT B S. Clin. Infect.Ds.， 2020，72（10）： e685-e686.

[23] KURNIKRT.IEEE/EMBSSpec.Top.Conf.Microtechnol.Med.Biol.，3rd.，2007：1977-1980.

[24] YUN J， ZHENG X， XU P， ZHENG X， XU J， CAO C，FU Y， XU B，DAI X， WANG Y，LIUH， YI Q， ZHU Y， WANG J， WANGL，DONG Z，HUANGL，HUANGY，DUW. Small，2020，16（9）：1903739.

[25] LUY，CHENS，WEIL，SUNL，LIUH，XUY.Anal.Chem.，2019，91（9）： 6111-6117.

[26] KREUTZ JE， MUNSON T，HUYNH T，SHEN F，DUW，ISMAGILOVRF. Anal. Chem.，2011，83（21）： 8158-8168.

[27] WEIC，YUC，MENGJ，LIJ，LIQ，LIS.Sens.Actuators，B，2024，412：135013.

[28] SCHULZ M， PROBST S， CALABRESE S， R. HOMANN A， BORST N， WEISS M， VON STETTEN F， ZENGERLE R， PAUSTN.Molecules，2020，25（8）：1914.

[29] SCHULER F，SCHWEMMER F，TROTTER M， WADLE S， ZENGERLE R， VON STETTEN F， PAUST N. Lab Chip，2015， 15（13）： 2759-2766.

Study on Improvement of Quantitative Capacity of Digital Droplet PCR by Double-Volume Droplets

LI Shan-Shan ^1，2，3 ， CAO Yun-Liang122， ZHAO Xue-Yi ^1，2 ， LI Jun-Wei ^*4，5 （20 1（School of Mechanical Engineering， Hebei University of Technology， Tianjin 3004O1， China） 2（Hebei Key Laboratory of Intelligent Sensors and Human-Machine Integration，Tianjin 30o130， China） 3（State Key Laboratory of Reliability and Intelligence of Electrical Equipment， Tianjin 300132， China） ⁴ （Institute of Biophysics， School of Life Science and Biomedical Engineering， Hebei University of Technology， Tianjin 300401， China） 5（Key Laboratory of Molecular Biophysics of Hebei Province， Tianjin 30O401， China）

AbstractDigital polymerase chain reaction （dPCR） enables absolute quantitative detection of nucleic acid samples.Since the quantitative upper and lower limits of detectable samples mainly depend on the volume and number of single droplets，the abundance of thesample to be tested，the volume of single droplets，and the number of droplets need to be adapted.For samples with unknown abundance，repeated adjustment of droplet size is not allowed.In this study，aone-step double-volume droplet generation method was proposed，and a double-volume droplet microfluidic chip was developed to verify the quantitative detection capability of the chip using a duckderived kit.The results showed that the droplets with diffrent volumes had different quantitative capabilities. Large-volume droplets had higherreliability for low-abundancesample concentrations，while small-volume droplets had advantages in detecting high-abundance sample concentrations.The double-volume droplets produced by the double-volume droplet microfluidic chip proposed inthis study greatly improved the reliability of quantitative capabilities，and had broad application prospects in detection of precious nucleic acid samples with unknown abundance in the field of microfluidic PCR.

KeywordsDouble-volume droplets; Digital polymerase chain reaction; Absolute quantification; Dynamic detection range