YTH結構域家族蛋白2對亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化的影響

中圖分類號：R114文獻標識碼：A文章編號：1000-503X（2025）03-0333-10

DOI：10.3881/j. issn. 1000-503X. 16246

Effect of YTH Domain Family Protein 2 on the Sodium Arsenite-Induced Malignant Transformation ofSkin Cells

XIONG Wenxiao，ZHAO Tianhe，LONG Keyan， ZHANG Zunzhen

Department of Occupational Health and Environmental Hygiene，West China School of Public Health and WestChina FourthHospital，SichuanUniversity，Chengdu61OO41，China

Corresponding author：ZHANG ZunzhenTel：O28-855O1298，E-mail：zhangzunzhen@163.com

ABSTRACT： ObjectiveTo investigate the effect of liquid-liquid phase separation （LLPS）of YTH domain family protein 2（YTHDF2）on the sodium arsenite-induced malignant transformation of skin cells，providinganew intervention target for thepreventionand control ofsodiumarsenite-inducedcarcinogenesis.MethodsThe HaCaT cell model of malignant transformation was constructed by continuous treatment with

1 μmol/L sodium arsenite for 22 weeks， including cells with normal YTHDF2 LLPS （YTHDF2-wt） and cells with inhibited YTHDF2 LLPS（YTHDF2- mut）. Confocal microscopy was employed to observe and characterize the LLPS droplets formed byYTHDF2 during sodiumarsenite-induced malignant transformationof skin cells.Cell proliferation，scratch healing，and colony formation assayswere performed to detect malignant phenotypes.Western blotting，quantitative reverse transcription PCR，and immunofluorescence experiments were conducted to examine the efects of YTHDF2 LLPSon the mRNA and protein levels of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）during sodium arsenite-induced malignant transformation of skin cels. ResultsAfter 4 weeks of sodium arsenite treatment，LLPS droplets of YTHDF2 appeared in YTHDF2-wt cells，and the number of droplets gradually increased as the treatment time was prolonged（ F=35.252 ， Plt; 0.001），while no phase-separated droplets were observed in YTHDF2-mut cels. Compared with YTHDF2-mut cells，YTHDF2-wt cells showed enhanced proliferation at the time points of ^f48h（t=3.654，P=0.006） and 72 h （ t=5.458 ， Plt;0.001 ）after 22 weeks of sodium arsenite treatment.The scratch healing rate of YTHDF2- wt cells was increased at the 8th （ t=12. 137 ， Plt;0.001 ）and 22th （ t=4.484 ， P=0.011 ）weeks of sodium arsenite treatment.The number of colonies formed by YTHDF2-wt cels was higher at the 4th（ t=3.365 ， （204 P=0.027 ），8th（ t=5.580 ，P=0.005），and 22th（ t=3.328，P=0.029， ）weeks of sodium arsenite treatment. Compared with YTHDF2-mut cells，YTHDF2-wt cells showed down-regulated protein （ t=-3.119 ！ P= 0.036）and mRNA（ t=4.051，P=0.015， ）levels of PTEN after 22 weeks of sodium arsenite treatment. Immunofluorescence results showed that after4 weeks of sodium arsenite treatment，YTHDF2LLPS droplets in YTHDF2-wt cells were localized to stress granules， translation-related membrane-less organeles. Conclusions During sodium arsenite-induced malignant transformation of skin cells，YTHDF2 undergoes LLPS and localizes to stress granules，translation-related membrane-less organelles.YTHDF2 LLPS participates insodiumarsenite-induced malignant transformation of skin cels by down-regulating the mRNA level of the key tumor suppressor PTEN.

Key words：YTH domain family protein2；phase separation；phosphatase and tensinhomolog deletedon chromosome en；sodium arsenite；malignant transformation

ActaAcadMedSin，2025，47（3）：333-342

砷是廣泛分布于自然界的非金屬元素，主要以三價砷或五價砷等無機態形式存在于土壤和水體中，其中三價砷（如亞砷酸鹽）毒性最大[1-2]。我國存在多個地方性砷中毒病區，當地居民面臨長期砷暴露的健康風險[3]。皮膚是碑中毒的主要靶器官[4]，長期低劑量砷暴露與非癌性皮膚病變及皮膚基底細胞癌、鱗狀細胞癌的發病率增加有關[5]。國際癌癥研究中心早在2004年已將無機砷認定為I類致癌物[6。砷誘導皮膚細胞惡性轉化及致癌的機制復雜，以往的研究未能在亞細胞結構層面闡明生物大分子如何精細調控砷導致的皮膚細胞惡性轉化過程。近幾年發現的生物大分子液-液相分離（liquid-liquid phase separation，LLPS）為深入探究砷誘導皮膚細胞惡性轉化的機制開辟了新思路。

LLPS是指細胞內生物大分子之間相互碰撞、融合形成液滴的相分離過程[7]。具有內在無序區的蛋白質易通過分子間的相互作用聚集形成液滴狀凝聚體[8]而干擾蛋白質內在無序區序列則可以有效抑制LLPS的發生[9]。LLPS形成的凝聚體可以募集翻譯相關因子干預mRNA的翻譯過程，在癌細胞增殖、轉移等多種生物學過程中發揮重要作用[10]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen，PTEN）是磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinaseB，AKT）信號通路上游的關鍵抑制因子，YTH結構域家族蛋白2（YTHdomainfamilyprotein2，YTHDF2）通過調控PTEN的表達水平影響PI3K/AKT信號通路的激活[11]。YTHDF2序列存在內在無序區[12]，具備發生LLPS的必要條件[8]PTENmRNA具有多個N6-甲基腺苷（N6-methylade-nosine， m⁶A ）位點[11]，YTHDF2 可以識別并結合發生 m⁶A 修飾的mRNA 進一步觸發LLPS[13-14]，并定位于與翻譯相關的無膜細胞器應激顆粒中[13，15-16]。由此可以推測YTHDF2LLPS可能通過干預PTEN的翻譯過程，降低細胞內PTEN含量，并激活PI3K/AKT信號通路，從而影響細胞的增殖、代謝及細胞周期等過程，最終促進細胞的惡性轉化。因此，本研究通過構建亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化模型，觀察YTH-DF2LLPS對細胞惡性表型、PTEN水平及翻譯率的影響，深入探索YTHDF2LLPS在亞砷酸鈉誘導細胞惡性轉化中的作用機制。

1材料和方法

1.1 材料

人永生化角質形成細胞系HaCaT購自南京開集生物科技有限公司，DMEM培養基購自塞維爾生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，亞砷酸鈉購自瑞士Fluka化學試劑公司，CCK-8試劑盒購自伊萊瑞特生物科技股份有限公司，PTEN一抗購自英國Abcam公司，G3BP1一抗購自武漢三鷹生物技術有限公司，細胞總RNA提取試劑盒及逆轉錄試劑盒購自北京擎科生物科技股份有限公司。 AlR+ 激光共聚焦顯微鏡購自日本尼康公司，凝膠成像系統及實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1. 2 細胞株構建與培養

1. 2. 1 細胞株構建

采用慢病毒構建綠色熒光蛋白標記的YTHDF2野生型HaCaT細胞系（YTHDF2-wt）和綠色熒光蛋白標記的YTHDF2突變型HaCaT細胞系（YTHDF2-mut），其中突變體是通過將YTHDF2內在無序區（aa230-383）的谷氨酰胺（Q）替換為丙氨酸（A）而獲得。具體構建方法參照本實驗室已發表的文章[17]。

1.2.2 細胞培養及分組

細胞采用含 10% 胎牛血清的DEME培養基，置于37^qC ！ 5% （2 CO₂ 培養箱中培養。使用 1μmol/L 亞砷酸鈉連續處理YTHDF2-mut及YTHDF2-wt細胞1（未轉化）、4（可能早期轉化）、8（早期轉化）、22周（惡性轉化），建立亞砷酸鈉誘導的皮膚細胞惡性轉化模型。

1.3 細胞LLPS檢測

1.3.1激光共聚焦顯微鏡檢測細胞LLPS

將適量細胞接種于 35mm 直徑玻璃底共聚焦培養皿中，培養至細胞融合度達到 50%～70% 。在激光共聚焦顯微鏡 488nm 激發光下觀察并拍攝圖片。采用NIS-Elements軟件、ImageJ軟件分析處理圖像。

1.3.2熒光漂白恢復實驗檢測YTHDF2蛋白顆粒流動性

采用配備熒光漂白恢復實驗模塊的激光共聚焦顯微鏡選擇細胞中高熒光強度YTHDF2蛋白顆粒，設置100% 功率的 488nm 激光漂白細胞中的高熒光強度顆粒 15s ，并采用NIS-Elements軟件記錄熒光猝滅區域漂白后200s圖像及熒光強度。

1.4 細胞惡性表型檢測

1.4.1細胞增殖實驗檢測細胞增殖能力

將細胞（ 2×10³ 個/孔）接種于96孔板中，分別培養0、24、48、 ^72h 后，PBS沖洗，每孔加入 100μL 含 10μL CCK-8溶液的無血清DEME培養基， 37^qC 避光孵育 1.5h 。采用酶標儀測量 450nm 波長處吸光度，并以培養 ^0h 組的吸光度為基準，計算細胞增殖率。

1.4.2劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力

將適量細胞接種于6孔板中，待細胞生長至100% 融合度后，使用無菌 200μL 槍頭垂直劃線，更換無血清DEME培養基，培養0、 36h 后在同一位置拍照記錄。采用ImageJ軟件計算劃痕面積，以培養0h的劃痕面積為基準計算劃痕愈合率。

1.4.3平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力

將細胞 （ 2×10³ 個/孔）接種于6孔板中，連續培養 14d 。加入 4% 多聚甲醛室溫固定 20min 、 1% 結晶紫染液室溫染色 15min ，PBS沖洗后拍照記錄。計算大于50個細胞的克隆數。

1.5蛋白免疫印跡實驗檢測PTEN含量

根據細胞數量加入適量含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒進行總蛋白濃度定量。各組蛋白樣品（ 25μg ）經過 10% SDS-PAGE分離后，通過濕式電轉印法轉印至PVDF膜上。 5% 脫脂牛奶室溫下封閉PVDF膜 2h 后，將膜與一抗置于 環境下孵育過夜，清洗后加入二抗室溫孵育1.5h ，最后在膜上均勻滴加ECL發光試劑，在凝膠成像系統下觀察拍照。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH蛋白作為內參比較目的蛋白表達水平。

1.6細胞免疫熒光檢測YTHDF2蛋白LLPS液滴與應激顆粒定位

以應激顆粒核心成分G3BP1蛋白作為指示物，檢測YTHDF2蛋白形成的顆粒是否定位于應激顆粒中。將細胞接種于 35mm 玻璃底共聚焦培養皿中，培養至細胞融合度達 50%～70% 。依次使用 4% 多聚甲醛室溫固定 20min 、 0.5% TritonX-100通透 15min 、 10% 山羊血清（溶于 1×PBS ）封閉 ¹h 。隨后加入 1：80 G3BP1一抗 4‰ 孵育 ^12h ，再加入抗兔二抗室溫避光孵育 ¹h ，使用DAPI染液室溫避光染色 8min ，最后滴加抗熒光淬滅封片液封片保存。在激光共聚焦顯微鏡405、488、 590nm 激發光下拍攝圖片，采用ImageJ軟件分析YTHDF2蛋白顆粒與G3BP1蛋白共定位情況。

1.7定量逆轉錄PCR檢測PTENmRNA起始密碼子翻譯率

采用定量逆轉錄PCR檢測PTENmRNA起始密碼子（ATG）翻譯率[18]。根據細胞數量加入適量含有蛋白酶抑制劑的Trizol裂解液、氯仿、冰乙醇等提取細胞總RNA。采用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，使用SYBRgreen試劑進行定量逆轉錄PCR分析。引物序列見表1。PCR反應條件： 95°C 預變性60s ， 95^°C 變性 10s ， 60^°C 退火延伸 30s ，40個循環。以GAPDH蛋白作為內參，采用 2^-ΔΔCt 法計算相對表達水平。

1.8 統計學處理

采用SPSS26.0軟件，經Shapiro-Wilk檢驗符合正態分布的計量資料以均數 ± 標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本 χ_t 檢驗，不同時間點多組間比較采用重復測量方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法檢驗。每組實驗至少重復3次。雙側 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 YTHDF2蛋白LLPS表征

亞砷酸鈉處理4周前，YTHDF2-wt與YTHDF2-mut細胞的YTHDF2蛋白均勻分布在細胞質內。亞砷酸鈉處理4周后，YTHDF2-wt細胞內出現YTHDF2蛋白LLPS液滴，且液滴數隨著亞砷酸鈉處理時間的延長逐漸增多（ F=35.252 ， Plt;0.001 ）；而YTHDF2-mut細胞沒有觀察到LLPS液滴（圖1）。熒光漂白恢復實驗進一步驗證亞砷酸鈉處理YTHDF2-wt細胞過程中形成的YTHDF2蛋白凝聚顆粒是否具有LLPS的特性，結果顯示，亞砷酸鈉處理4、8、22周的YTHDF2-wt細胞內的YTHDF2蛋白顆粒在經過激光漂白處理后，熒光強度在200s 內恢復至漂白前熒光強度的 20% 以上（圖2）。

2.2YTHDF2蛋白LLPS在亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化中對細胞惡性表型的影響

2.2.1YTHDF2蛋白LLPS對細胞增殖能力的影響

細胞增殖實驗檢測結果顯示，亞砷酸鈉處理0、1、4、8周時，YTHDF2-wt與YTHDF2-mut細胞的增殖能力差異無統計學意義（ P 均 gt;0.05 ）；亞砷酸鈉處理22周時，YTHDF2-wt細胞在48（ t=3.654 ， P= 0.006）、 ^72h （ t=5.458 ， Plt;0.001 ）的增殖率顯著高于YTHDF2-mut細胞（圖3）。

表1PCR引物序列

注：PTEN：第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

YTHDF2：YTH結構域家族蛋白2；YTHDF2-wt：YTHDF2野生型 HaCaT細胞系；YTHDF2-mut：YTHDF2突變型 HaCaT細胞系 A．激光共聚焦圖像顯示YTHDF2-wt細胞內出現YTHDF2蛋白液滴（箭頭）；B.YTHDF2蛋白液滴數的定量分析 圖1不同亞砷酸鈉處理時間對YTHDF2- Δ_wt 與YTHDF2-mut細胞YTHDF2蛋白的影響

A.激光共聚焦圖像顯示YTHDF2蛋白液滴漂白區域（紅框）；B.熒光強度的定量分析圖2不同亞砷酸鈉處理時間YTHDF2-wt細胞內YTHDF2蛋白液滴漂白后熒光強度恢復情況

圖3不同亞砷酸鈉處理時間對YTHDF2-wt與YTHDF2-mut細胞增殖能力的影響

2.2.2 YTHDF2蛋白LLPS對細胞遷移能力的影響

劃痕愈合實驗結果顯示，亞砷酸鈉處理8、22周時，YTHDF2-wt細胞 36h 的劃痕愈合率分別是未進行亞砷酸鈉處理的1.92倍和2.10倍，且顯著高于相應處理時間的YTHDF2-mut細胞的劃痕愈合率（ t=12.137 ， Plt;0.001 ； t=4.484 ， P=0.011 ）（圖4）。

2.2.3YTHDF2蛋白LLPS對細胞克隆形成的影響

細胞平板克隆形成實驗結果顯示，亞砷酸鈉處理4（ t=3.365 ， P=0.027 ）、8（ t=5.580 ， P=0.005 ）、22周（ t=3.328 ， P=0.029 ）時的YTHDF2-wt細胞克隆形成數顯著高于YTHDF2-mut細胞（圖5）。

A.不同亞砷酸鈉處理時間的劃痕愈合圖像；B.細胞劃痕愈合率的定量分析圖4不同亞砷酸鈉處理時間對YTHDF2- Δ_wt 與YTHDF2- 細胞遷移能力的影響

2.3YTHDF2蛋白LLPS在亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化中對PTEN表達的影響

蛋白免疫印跡實驗結果顯示，隨著亞砷酸鈉處理時間的延長，YTHDF2-wt細胞（ F=14.858 ， Plt;0.001 ）

和YTHDF2-mut細胞（ F=6.435 ， P=0.013 ）的PTEN表達均降低。亞砷酸鈉處理22周時，YTHDF2-wt細胞內的PTEN表達顯著低于YTHDF2-mut細胞（ t= -3.119， P=0.036 ）（圖6）。

A.不同亞砷酸鈉處理時間的平板克隆圖像；B.克隆形成數的定量分析圖5不同亞砷酸鈉處理時間對YTHDF2-wt與YTHDF2- 細胞克隆形成能力的影響

A.蛋白免疫印跡圖；B.PTEN蛋白表達的定量分析圖6不同亞砷酸鈉處理時間對YTHDF2-wt與YTHDF2- 細胞PTEN表達的影響

Mr ：相對分子質量

2.4YTHDF2蛋白LLPS在亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化中對PTENmRNA翻譯的影響

定量逆轉錄PCR實驗結果顯示，亞砷酸鈉處理8、22周時，YTHDF2-wt細胞內PTENmRNA起始密碼子（ATG）的翻譯率顯著低于YTHDF2-mut細胞（ t= 3.320， P=0.029 ； t=4.051 ， P=0.015 ）（圖7）。

圖7不同亞砷酸鈉處理時間對YTHDF2-wt與YTHDF2-mut細胞PTENmRNA翻譯的影響

2.5亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化過程中YTH-DF2蛋白LLPS液滴的定位

免疫熒光結果顯示，亞砷酸鈉處理4、8、22周時，YTHDF2-wt細胞中YTHDF2蛋白LLPS液滴與應激顆粒的標志蛋白G3BP1熒光強度分布曲線存在顯著相關性（ P 均 lt;0.001 ）（圖8）。

3討論

多項研究顯示，使用高濃度亞砷酸鈉（ ?0.5mmol/L ）處理后， m⁶A 修飾的mRNA驅動YTHDF2蛋白快速（ 30～60min ）發生 LLPS[13，15-16]。但這些研究更關注亞砷酸鈉誘導YTHDF2蛋白LLPS的條件，并且采用的亞砷酸鈉濃度遠高于地方性砷中毒病區人群的實際暴露水平，亞砷酸鈉處理時間也較短，不能反映人群實際暴露條件下YTHDF2蛋白是否發生LLPS、是否參與亞砷酸鈉誘導的皮膚細胞惡性轉化或皮膚癌的發生。本研究發現，亞砷酸鈉持續處理4周后YTHDF2蛋白形成LLPS液滴，且隨著亞砷酸鈉處理時間的延長，YTHDF2蛋白LLPS液滴數也逐漸增多；此外，在干預YTHDF2蛋白LLPS后，逆轉了亞砷酸鈉誘導皮膚細胞的惡性表型，提示YTHDF2蛋白LLPS參與了亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化過程。

A.免疫熒光圖顯示YTHDF2-wt細胞內YTHDF2蛋白（綠色熒光）、應激顆粒標志蛋白G3BPI（紅色熒光）與細胞核（藍色熒光）的定位情況；B.熒光強度的定量分析圖8不同亞砷酸鈉處理時間YTHDF2-wt細胞中YTHDF2蛋白與應激顆粒的定位情況

生物大分子LLPS在細胞生命活動的各個方面發揮著重要作用，LLPS具有在特定空間內富集生化反應的成分增加反應效率[19]，隔離分子使其失活或抑制反應及招募特定蛋白質，RNA定位至已存在的LLPS顆粒或無膜細胞器[8]等生物學作用。近期研究發現，在小鼠精子發生后期，脆性X相關家族的FXR1表達顯著增加，發生LLPS形成顆粒，富集EIF4G3等翻譯起始因子，激活mRNA翻譯，從而促進精子形成所需蛋白的合成，保障精子發育[9]。本研究結果顯示，抑制YTHDF2蛋白LLPS可以有效阻止亞砷酸鈉誘導的皮膚細胞惡性轉化過程中PTEN含量的降低，促進PTENmRNA翻譯，并且YTHDF2蛋白LLPS液滴定位于與翻譯相關的無膜細胞器應激顆粒中，提示YTH-DF2蛋白可能通過LLPS募集翻譯抑制因子抑制PTENmRNA的翻譯，并在轉錄后下調PTEN蛋白的表達。

本研究發現在亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化過程中，YTHDF2蛋白LLPS促進了細胞惡性轉化，并且由于LLPS凝聚物的形成是一個可逆的、受到多種小分子精準調控的過程[20]，因此，通過小分子藥物干預YTHDF2蛋白LLPS有望成為防治亞砷酸鈉所致皮膚癌的新策略。LLPS過程依賴于生物大分子間的相互作用，在亞砷酸鈉的刺激下，mRNA上形成多個 m⁶A 修飾位點，驅動YTHDF2蛋白與發生 m⁶A 位點修飾的mRNA結合，發生 LLPS^[21] 。最新研究發現，小分子化合物DC-Y13可以阻斷YTHDF2蛋白與發生 m⁶A 修飾的RNA之間的特異性識別，進而改善小鼠放療或放療/免疫聯合療法的抗腫瘤治療效果[22]。此外，一些小分子可以通過物理化學作用改變大分子疏水特性調控LLPS 發生[23]，具有一定的治療潛力。

本研究主要分析了YTHDF2蛋白的LLPS在亞碑酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化及致癌過程中的作用，在后續研究中，可以檢測亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化過程中PTENmRNA的水平及穩定性，以驗證YTH-DF2蛋白LLPS對PTENmRNA翻譯的抑制作用；其次，深人挖掘YTHDF2蛋白LLPS所募集的翻譯因子，明確其是否靶向調控PTEN表達來影響細胞惡性轉化；此外，還可以更廣泛地探索YTHDF2蛋白LLPS是否影響其他抑癌因子，進而參與亞砷酸鈉誘導的細胞惡性轉變及致癌過程。

綜上，本研究結果表明，YTHDF2蛋白LLPS抑制抑癌因子PTENmRNA翻譯，下調細胞內PTEN含量，促進細胞增殖、遷移與克隆形成。本研究初步探索YTHDF2蛋白LLPS在亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化中的生物學意義，為解讀亞砷酸鈉誘導皮膚細胞惡性轉化與致癌的機制開辟了新思路。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明熊文曉：實施實驗、統計分析、論文撰寫；趙田禾：實驗設計、論文修改；龍科言：實驗數據整理、作圖；張遵真：研究指導、論文修改

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（收稿日期：2024-06-28）