組織激肽釋放酶7小分子抑制劑對卵巢癌的影響

中圖分類號：R737.31； R979.1Σ⁺9 （204 文獻標識碼：A 文章編號：1000-503X（2025）03-0366-09

DOI：10.3881/j. issn.1000-503X.16231

Effect of the Small Molecule Inhibitor of Kalikrein-Related Peptidase 7 Against Ovarian Cancer

SHI Hongjuan1，2，LIU Wei3，HU Liling4，TAN Xiao

IubeiKeyLaboratoryofTumorMicroenvironmentandImmunotherapy，CollgeofBasicMedicalScienes，ChinaTreGorgesUivesity Yichang，Hubei 443002，China （204號 ² Health Careand Nursing School，Hubei ThreeGorges Polytechnic，Yichang，Hubei 4300，China

（2號 ³ DepartmentofHepatobiliaryandPanereaticSurgery4Centerof Drug ClinicalTrial，TheFirst Colegeof Clinical MedicalScience， ChinaThreeGorgesUniversity，Yichang，Hubei443OO3，China

Corresponding author：TAN XiaoTel：O717-6486673，E-mail：xiao-tan@ctgu.edu.cn

ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the effect of the small molecule inhibitor C42 of kalikrein-related peptidase 7（KLK7）on ovarian cancer with elevated expression of KLK7 and evaluate the feasibility of C42 as a newtherapeutic strategy for ovarian cancer. MethodsThe CCK-8 assay，flow cytometry，cell scratch assay， Transwell assay，and Western bloting were employed to assessthe effects of C42 on the proliferation，migration， and invasion of the ovarian cancer cell line SKOV3，which was characterized by high KLK7 expression.Additionally，a subcutaneous xenograft model of ovarian cancer was established with SKOV3cels in nude mice to evaluate the effcts of C42 on the tumor growth and metastasis.Theexpression levels of proteins associated with tumor metastasis and invasion in the tumor tisue were examined by immunohistochemical techniques.ResultsThe cellular experiment showed that C42 suppressed the proliferation，migration，and invasion （all Plt;0.001 ）of SKOV3 cells，compared with the control group.The animal experiment showed that compared with the control group，the 10.2mg/kgC42 group exhibited a decreased tumor weight（ P=0.009 ）and attenuated liver metastases.Immunohistochemical staining revealed that the 10.2mg/kgC42 group demonstrated down-regulated expression of the tumor proliferation marker Ki-67（ P=0.002 ）and the tumor metastasis and invasion-associated proteins such as matrix metalloproteinase-9（ P=0.027 ）andVimentin（ P=0.039 ）.Conclusion The small molecule inhibitor C42 of KLK7 efectively suppresss the proliferation，migration， and invasion of ovarian cancer SKOV3 cells.

Key words：ovarian cancer；kallikrein-related peptidase 7；SKOV3 cell； targeted therapy

ActaAcadMedSin，2025，47（3）：366-374

卵巢癌是死亡率較高的婦科惡性腫瘤，組織學類型復雜，其中上皮性卵巢癌最常見，大多數卵巢癌患者確診時處于疾病晚期，腫瘤播散至腹膜腔或上腹部器官，導致治療難度增加，患者5年生存率顯著降低[1]。上皮性卵巢癌的藥物治療方法主要包括傳統化學治療和靶向治療等[2]。盡管化學治療取得了新的進展，但長期使用仍會導致耐藥性等問題。研究表明，卵巢癌細胞對化療藥物產生耐藥的機制較為復雜，主要涉及增強DNA損傷修復、調控細胞周期、促使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶過表達、影響氧化應激、形成促進腫瘤復發和轉移的腫瘤干細胞群、增加腫瘤相關巨噬細胞數量、抑制與細胞凋亡相關的蛋白表達，以及過度激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路等途徑[3]。卵巢癌的靶向治療一線用藥為貝伐珠單抗，通過抑制腫瘤血管生成發揮治療作用，當腫瘤微血管密度較低時，貝伐珠單抗的治療效果也相應減弱[4]。此外，免疫治療在卵巢癌領域已開展相關研究，但目前主要局限于小規模臨床試驗，其臨床應用價值仍需通過大規模隨機對照試驗進一步驗證[5]。盡管在過去幾十年中卵巢癌研究取得了重大進展，但患者的總體生存率并未得到顯著改善[6。因此，迫切需要開發新的卵巢癌治療策略。

大量文獻表明，組織激肽釋放酶7（kallikrein-relatedpeptidase7，KLK7）在卵巢癌中呈高表達[7-10]。KLK7是一種分泌型絲氨酸蛋白酶，通過特異性水解細胞膜蛋白、細胞外基質成分及細胞因子等多種底物，在腫瘤發生發展中發揮關鍵調控作用。研究顯示，KLK7參與調控腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲、血管生成及代謝重編程等多個惡性生物學過程[1-12]。在上皮性卵巢癌中，KLK7表達上調，其通過促進多細胞聚集物形成，增強整合素黏附受體表達，進而介導卵巢癌細胞的腹膜擴散及紫杉醇耐藥[13]。KLK7 可被釋放至血液和腹水中，其表達水平與卵巢癌病程進展密切相關[14]。KLK7mRNA表達升高是晚期高級別漿液性卵巢癌預后不良的生物標志物[15]。這些發現進一步證實了KLK7作為卵巢癌治療靶點的潛在價值[16]。

本課題組前期研究創新性設計并合成了一類以香豆素為核心結構的特異性靶向KLK7小分子抑制劑C42。香豆素化合物具有不同的生物學特性，如抗菌、抗腫瘤、抗凝血、抗炎等，香豆素及其衍生物在多種類型腫瘤中均表現出顯著的抗腫瘤活性，為新型抗腫瘤藥物的開發提供了重要先導化合物[17]。C42以特定構象結合到KLK7的S1位點，隨后KLK7的Ser195羥基對香豆素內酯環進行親核進攻形成酰化酶，最后氯離子離去后亞甲基與His57的咪唑環形成第2個共價鍵，導致KLK7被永久性抑制。本課題組前期研究結果證實，C42可通過靶向抑制KLK7活性從而抑制高表達KLK7的胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。因此，探索KLK7小分子抑制劑C42對高表達KLK7卵巢癌的影響，有助于開發更有效的治療策略。本研究旨在通過體內和體外實驗，探究C42對高表達KLK7卵巢癌的潛在影響，評估其作為卵巢癌新治療策略的可行性。

1材料和方法

1.1 材料及實驗動物

人卵巢癌細胞株SKOV3購自上海中喬新舟生物科技有限公司，實驗藥物C42由本課題組前期自行設計并合成。3～4周齡 BALB/c-nu 雌性裸鼠（體重 13～ 16g ）購自武漢鼠來寶生物科技有限公司，飼養于三峽大學實驗動物中心。本研究經三峽大學實驗動物倫理委員會批準（倫理審查編號：2022020D1），并根據三峽大學實驗動物操作指南進行規范操作。

1.2 細胞培養

SKOV3細胞使用含 10% 胎牛血清、 1% 青霉素和鏈霉素的McCoy'S5A培養基，置于 37°C 、 5% （ CO₂ 細胞培養箱中培養，以 0.25% 胰酶細胞消化液進行消化傳代。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖

將SKVO3細胞以 4×10³ 個/孔的密度均勻接種至96孔板中，待細胞融合度達到 30%～50% 時，去除培養基，分別加入 100μL 含有25、50、75、 100μmol/L C42的McCoy'S5A完全培養基，孵育培養 ^48h 后，更換為含 10% CCK-8溶液的完全培養基繼續孵育 1.5h 使用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度值。每組設3個復孔。細胞活力 σ=σ （實驗組吸光度值-空白組吸光度值）／（對照組吸光度值-空白組吸光度值）。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡

待SKOV3細胞融合度達 80%～90% 時，收集細胞并制備濃度為 1×10⁶ 個 '_mL 的細胞懸液，分別加人含有50、 100μmol/LC42 的完全培養基，置于細胞培養箱中孵育 48h 。收集待檢測細胞，按照試劑盒說明書配制檢測工作液，每份樣本中加入 300μL 工作液，充分混勻后避光孵育 15min 。每組實驗重復3次。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5細胞劃痕愈合實驗檢測細胞遷移

將SKOV3細胞懸液以 3×10⁵ 個/孔的密度均勻接種至6孔板中，待細胞融合度達 80% 左右，分別加入25、 50μmol/L C42 溶液，對照組加入相同體積的DM-SO溶液。用 200μL 無菌槍頭尖端在孔內做“十”字劃痕，并用PBS將脫落細胞清洗干凈，每孔加入培養基繼續培養。十字中心為每次拍照的定位點，分別在0、24、 ^48h 拍照記錄。采用ImageJ軟件計算細胞劃痕面積。細胞劃痕愈合率 Σ=Σ （ 0h 面積－不同時間劃痕的面積） /0h 面積 ×100% 。

1.6Transwell遷移、侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲

用含有DMSO，25、 50μmol/L C42溶液的McCoy’S5A培養基重懸SKOV3細胞，調整細胞懸液密度為2.0×10⁵ 個/mL，將 150μL 各組細胞懸液分別接種于無基質膠的上室，培養 ^48h 后取出上室，棄培養基，用棉簽輕輕擦去上層未穿透膜的細胞，PBS清洗后，甲醇固定 30min ，結晶紫溶液染色 20min 。隨機選取5個視野，使用顯微鏡拍照并保存結果。Transwell侵襲實驗的細胞懸液密度為 5.0×10⁵ 個 ^'mL ，將 150μL 各組細胞懸液分別接種于含基質膠的上室，其他操作同遷移實驗。

1.7Westernblot蛋白印跡檢測蛋白表達水平

使用完全培養基將C42母液配置為25、50、75、100μmol/L 濃度，處理SKOV3細胞 ^48h 后，收集細胞提取蛋白。根據標準曲線計算上樣量，采用Westernblot檢測腫瘤增殖抗原Ki-67、N-鈣黏著蛋白（N-cad-herin）、基質金屬蛋白酶9（matrixmetalloproteinase-9，MMP9）、波形蛋白（Vimentin）表達量。

1.8裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型構建及分組

將處于對數生長期的卵巢癌SKOV3細胞制備成濃度為 5×10⁷ 個 /mL 的單細胞懸液，向裸鼠雙側肩胛區皮下各注射 200μL ，待腫瘤體積生長至 1cm³ 后，取出腫瘤組織，置于裝有生理鹽水的冰上無菌器皿中，并使用手術刀迅速將腫瘤切割成 1mm×1mm×1mm 的均勻小塊備用。對實驗裸鼠進行異氟烷氣體誘導麻醉，通過鼻導管低流量持續吸人，使用手術刀切開已消毒的背部一側皮膚后，快速輕柔地夾取腫瘤組織小塊放入切口內，隨后縫合，再次進行消毒處理。以相同方法處理另一側。操作完成后，將實驗鼠置于復溫毯上，待其能夠自由活動時，表明復蘇成功。將移植瘤裸鼠模型隨機分為對照組和 10.2mg/kgC42 組，每組8只，在建模第3天腹腔注射 80μL 劑量 10.2mg/kgC42 溶液，每隔1d注射1次，對照組給予等量DMSO溶液。移植后第15天瘤體開始增長，至第35天結束實驗。

1.9一般情況觀察

術后隔日觀察并記錄裸鼠的生存狀況，包括精神、飲食、睡眠、活動、體重、生存時間等。采用游標卡尺測量并記錄腫瘤的長徑和短徑，根據腫瘤體積描繪腫瘤生長曲線。

1.10 病理學檢查

實驗結束后進行病理大體觀察及HE染色。采用免疫組織化學染色檢測瘤體增殖指標Ki-67蛋白表達情況，并測定肝臟KLK7以及瘤體N-cadherin、MMP9、Vimentin蛋白的表達水平。

1. 11 統計學處理

采用SPSS22.0和GraphPadPrism10軟件，正態性檢驗采用Shapiro-Wilk法，符合正態分布的計量資料以均數 ± 標準差表示，組間比較采用獨立樣本 χ_t 檢驗。 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C42對SKOV3細胞增殖的影響

CCK-8法檢測結果顯示，與對照組比較，50（ 0.81± 0.02 比 1.00±0.07 ， P=0.002 ）、75（ 0.55±0.03 比1.00±0.07 ， Plt;0.001 ）、 100μmol/L C42組（ 0.36± 0.03比 1.00±0.07 ， Plt;0.001 ）SKOV3細胞的增殖能力顯著降低。流式細胞術檢測結果顯示，與對照組比較， 50μmol/LC42 組SKOV3細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率差異無統計學意義（ 5.56% 比 3.34% ， P= 0.080和 2.58% 比 2.08% ， P=0.911 ）， C42組SKOV3細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加（ 14.07% 比 3.34% ， P=0.002 和 8.80% 比2.08% ， P=0.011 ）。Westernblot檢測結果顯示，25、50、75、 100μmol/L C42處理后SKOV3細胞Ki-67蛋白相對表達量分別為 0.45±0.01 ！ 0.31±0.06 、 0.27± 0.04和 0.32±0.02 ，均顯著低于對照組（ 1.00± 0.01）（ P 均 lt;0.001 ）（圖1）。

Mr：相對分子質量

2.2 C42對SKOV3細胞遷移的影響

圖1Westernblot檢測不同濃度C42對SKOV3細胞Ki-67蛋白表達的影響

Transwell遷移實驗檢測結果顯示，與對照組比較，25 （ 0.59±0.01 比 1.00±0.08 ， Plt;0.001 ）、 C42組（ （0.29±0.01 比 1.00±0.08 ， Plt;0.001 ）SKOV3細胞遷移能力顯著降低（圖2A）。細胞劃痕實驗檢測結果顯示，共培養24、 ^48h 后，與對照組比較，25【（ 26.27±2.91）% 比（ 49.83±0.53）% ， Plt; 0.001和（ （56.18±1.44）% 比 （87.04±0.91）% ， Plt; 0.001）]、 50μmol/LC42 組[（ 19.70±5.45）% 比（4 9.83±0.53）% ， Plt;0.001 和 （34.71±1.91）% 比（87.04±0.91）% ， Plt;0.001 SKOV3細胞傷口愈合速率均顯著降低（圖2B）。

A.Transwell遷移實驗檢測不同濃度C42對SKOV3細胞遷移能力的影響以及細胞相對遷移比值的定量分析；B．細胞劃痕實驗檢測

不同濃度C42對SKOV3遷移能力的影響以及細胞劃痕愈合率的定量分析

圖2不同濃度C42對SKOV3細胞遷移的影響

2.3C42對SKOV3細胞侵襲的影響

Transwell侵襲實驗檢測結果顯示，與對照組比較，25（ 0.44±0.01 比 1.00±0.01 ， Plt;0.001 ）、 C42組（ 0.12±0.01 比 1.00±0.01 ， Plt;0.001 ）SKOV3細胞侵襲能力顯著降低（圖3A）。Westemblot檢測結果顯示，25、 50μmol/L C42處理后SKOV3細胞N-cadherin1 0.38±0.01 比 1.00±0.02 ， Plt;0.001 和 0.30±0.02 比1.00±0.01 ， Plt;0.001 ）、MMP9（ 0.23±0.01 比 1.00± 0.03， Plt;0.001 和 0.18±0.01 比 1.00±0.03 ， Plt; 0.001）、Vimentin蛋白相對表達量（ 0.74±0.02 比1.00±0.06 ， P=0.002 和 0.62±0.01 比 1.00±0.06 ， Plt; 0.001）均顯著低于對照組（圖3B）。

2.4C42對裸鼠卵巢癌皮下移植瘤增殖的影響

10.2mg/kgC42 組和對照組裸鼠成瘤率分別為68.75% 和 92.86% 。與對照組比較， 10.2mg/kgC42 組裸鼠移植瘤在第33天[（ 33.51±16.00 ） mm³ 比（ 84.46±63.72 ） mm³ ， P=0.046 、第35天[ ?39.04±18.72? ） mm³ 比（ 98.09±69.99 川 mm³ ， P= 0.037］腫瘤體積均明顯降低（圖4A）。第35天 10.2mg/ kgC42 組腫瘤重量顯著低于對照組[（ 19.38±4.92 ）mg比（ 44.64±12.24. ） mg ， P=0.009 ]（圖4B）。免疫組織化學染色結果顯示， 10.2mg/kgC42 組腫瘤組織中Ki-67蛋白表達較對照組顯著降低（ （0.10±0.12 比 1.00±0.43 ， P=0.002 ）（圖4C）。

2.5C42對裸鼠卵巢癌皮下移植瘤轉移的影響

病理大體標本檢查顯示，對照組中4只、 10.2mg/ kgC42 組中2只裸鼠出現肝臟轉移（圖5A）。HE染色結果顯示，對照組肝臟轉移灶出現大量卵巢癌細胞且部分組織結構紊亂，而 10.2mg/kgC42 組肝臟轉移灶卵巢癌細胞較少，結構未見明顯異常（圖5B）。免疫組織化學染色結果顯示， 10.2mg/kgC42 組肝臟轉移灶中KLK7蛋白表達較對照組顯著降低（ 0.15± 0.19比 1.00±0.44 ， P=0.004 ）（圖5C）。與對照組比較， 10.2mg/kgC42 組腫瘤組織中MMP9（ 0.39±

N-cadherin：N-鈣黏著蛋白；MMP9：基質金屬蛋白酶9；Vimentin：波形蛋白A.Transwell 侵襲實驗檢測不同濃度C42對SKOV3 細胞侵襲能力的影響以及細胞相對侵襲比值的定量分析；B.Westem blot檢測不同濃度C42對SKOV3細胞N-cadherin、MMP9、Vimentin蛋白表達的影響及定量分析圖3不同濃度C42對SKOV3細胞侵襲的影響

與對照組比較， ¹Plt;0.05 A．裸鼠腫瘤生長時間曲線圖；B.對照組和 10.2mg/kg C42 組腫瘤重量比較；C.免疫組織化學染色檢測對照組和 10.2mg/kg C42組腫瘤組織Ki-67蛋白表達水平及定量分析圖4C42對裸鼠移植瘤增殖的影響

圖5裸鼠移植瘤肝臟轉移灶的大體標本（A）、HE染色（B）及免疫組織化學染色（C）檢測KLK7蛋白表達水平

0.08比 1.00±0.49 ， P=0.027 ）和Vimentin（ 0.29± 而N-cadherin蛋白表達差異無統計學意義（ 0.60±0.47比 1.00±0.44 ， P=0.039 ）蛋白表達顯著降低， 0.85比 1.00±1.07 ， P=0.532 ）（圖6）。

圖6免疫組織化學染色檢測腫瘤組織中N-cadherin、MMP9和Vimentin蛋白表達水平

3討論

目前卵巢癌治療面臨化療耐藥、靶向藥物有限、免疫治療響應率低[18]等問題，臨床迫切需要開發新型治療手段，以提高卵巢癌的治療效果。本研究通過體內、體外實驗證實KLK7小分子抑制劑C42可以有效抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

本研究采用高表達KLK7的卵巢癌細胞系SKOV3作為研究對象，通過CCK-8法、流式細胞術和Westernblot檢測等方法發現C42能夠有效抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖。腫瘤增殖抗原Ki-67是一種由MKi-67基因編碼的核蛋白，在細胞周期調控中發揮重要作用，通常被用作細胞增殖的標志物，其表達水平與腫瘤進展密切相關[19]。C42導致卵巢癌 SKOV3 細胞凋亡壞死的分子機制可能與活性氧水平升高、線粒體膜電位下降、凋亡相關蛋白表達異常等有關。體內實驗結果顯示，C42處理后荷瘤小鼠腫瘤生長速度、成瘤率、腫瘤重量以及Ki-67蛋白表達量均顯著下降，這表明C42能夠有效抑制卵巢癌皮下移植瘤的生長。因此，無論是在細胞水平還是動物模型中，KLK7小分子抑制劑均能抑制卵巢癌的增殖。

在研究C42對卵巢癌轉移和侵襲的影響時，選用對細胞活力無明顯抑制作用的25、 50μmol/L 藥物濃度，從而排除因細胞活力下降而導致細胞遷移侵襲能力降低的干擾。Transwell遷移、侵襲實驗和細胞劃痕實驗結果顯示，C42可抑制SKOV3細胞的遷移和侵襲，顯著降低細胞遷移侵襲相關蛋白N-cadherin、

MMP9、Vimentin的表達水平。N-cadherin是一種鈣依賴性單鏈跨膜糖蛋白，介導同型和異型細胞間的黏附作用，增強細胞集體遷移能力，并通過局部腫瘤宿主微環境促進上皮細胞的侵襲，從而加速卵巢癌的轉移[20]。N-cadherin的異常表達與惡性腫瘤的轉化、黏附、凋亡、血管生成、侵襲和轉移密切相關[21]。MMP9可降解多種細胞外基質成分，例如惡性腫瘤細胞表面的黏附蛋白[22]，通過將細胞黏附于細胞外基質蛋白，促進腫瘤轉移[23]。Vimentin是蛋白質中間絲家族的關鍵成員，與腫瘤的生長加速和浸潤過程密切相關[24]。在動物模型中，C42組肝臟轉移灶的數量和嚴重程度均低于對照組。正常肝臟不表達KLK7，但當高表達KLK7的卵巢癌轉移至肝臟時，轉移灶KLK7表達可呈陽性。本課題組前期研究結果表明，KLK7小分子抑制劑可抑制KLK7活性，但對KLK7蛋白表達水平的影響尚需進一步驗證。本研究結果顯示，C42組中KLK7蛋白的相對表達量相較于對照組顯著降低，這表明KLK7小分子抑制劑能夠有效抑制KLK7蛋白的表達。Bisyris等[25]開發出一種混合烷基芳基麟酸酯猝滅活性探針，可標記小鼠體內有活性的KLK7，利用該探針能夠精準定位并定量活性KLK7，從而進一步分析KLK7表達量下降的機制。本研究發現，C42處理后腫瘤組織中MMP9、Vimentin蛋白相對表達量顯著降低，且與轉移侵襲相關的蛋白含量也下降，這提示KLK7小分子抑制劑C42可抑制卵巢癌的轉移侵襲。KLK7小分子抑制劑C42是一類香豆素類衍生物，這類化合物通過弱鍵與癌細胞中多種酶和受體相互作用，從而共同抑制癌細胞的增殖，是新型抗癌藥物中一個具有高度特效的藥效團。目前臨床已用于癌癥治療的香豆素衍生物較多，例如苯乙烯基香豆素雜交體12（結腸腺癌）、香豆素-雙氫青蒿素雜種13（結腸腺癌）、香豆素-肼雜種15（乳腺癌）等，但在卵巢癌治療中的應用較少[26]。本研究證實C42 能夠抑制卵巢癌的增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與抑制KLK7的活性及表達有關。

本研究存在一定的局限性。首先，僅對高表達KLK7的卵巢癌細胞系SKOV3細胞進行分析，而C42對其他低表達KLK7卵巢癌細胞系的作用尚待驗證。其次，在細胞實驗中，雖然觀察到多個C42藥物濃度均能產生抑制效果，但未確定最佳刺激濃度，后續實驗可進一步分析。此外，C42抑制卵巢癌SKOV3細胞的具體作用機制仍需更深入地探索。

綜上，本研究結果表明，KLK7小分子抑制劑C42能夠顯著抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖、遷移和侵襲，可作為卵巢癌潛在的治療手段，其分子機制值得進一步深入研究。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明時鴻娟：研究設計、數據收集分析、起草論文和修改；劉偉：對重要內容做出修訂；胡麗玲：對學術問題進行解答；譚瀟：研究選題、論文修改定稿、對學術問題進行解答、同意對研究工作各方面的誠信問題負責

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（收稿日期：2024-06-17）