食品中沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的能力驗證結(jié)果及分析

Results and Analysis of the Proficiency Testing of Salmonella and Listeria monocytogenes in Food

LYU Zewei，ANXiaowei （Tianjin Hongqiao District Disease Control and Prevention Center， Tianjin 3Ooooo， China）

Abstract： To comprehensively enhance the laboratory's detection capabilities for Salmonell and Listeria monocytogenesinfod，strengthenthelaboratory'scorecompetitiveness intheindustryandattheametimeesure that the test results issued have a high degree of accuracy and validity. In 2O24，the laboratory participated in the detection and verification of two microbial indicators，Salmonella and Listeria monocytogenes in food，organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Inspection and Quarantine Sciences.The results showed that Salmonell was not detected inthe two samplestobe tested，24-K96land24-J554，while Listeria monocytogenes was detected inthe twosamples tobe tested，24-M289and24-Y906.After assssment，thersultof this proficiency test is “satisfactory”， which can provide solid technical support for ensuring food safety.

Keywords： proficiency testing; Salmonella; Listeria monocytogenes

沙門氏菌是全球范圍內(nèi)危害顯著的食源性致病菌之一{，主要存在于禽畜肉類（特別是雞肉）、乳制品、蛋類及水產(chǎn)品等食品中。人們攝入被污染食物感染后，可引起多種臨床癥狀：典型的急性胃腸炎、傷寒型感染、全身性敗血癥及化膿性腦膜炎等。在嬰幼兒、老年人等免疫缺陷群體中，嚴(yán)重感染可能會進(jìn)一步發(fā)展為多器官功能衰竭，具有致命風(fēng)險[2]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（簡稱單增李斯特菌）是能引發(fā)人體李斯特菌病的重要食源性病原體。該菌具有極高的致病性[3]，表現(xiàn)出環(huán)境抗逆性，能在冰箱等低溫環(huán)境、酸性及高鹽等條件下存活。

佘佳芮等[4分析了2022—2024年錫林郭勒盟500份食品樣本中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢出情況，得到其檢出率為 7.20% ，沙門氏菌檢出率為 5.40% 因此，提升沙門氏菌、單增李斯特菌的檢測能力，是防控食源性疾病、保障食品安全的基石。通過定期開展能力驗證活動（如盲樣檢測、實驗室間比對），可長期有效監(jiān)控微生物檢驗?zāi)芰昂饬繉嶒炇业募夹g(shù)能力，系統(tǒng)性解決微生物檢驗中因人員操作差異、方法學(xué)局限導(dǎo)致的結(jié)果偏差問題，為實驗室提供持續(xù)改進(jìn)的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 樣品來源

樣品均采用真空西林瓶密閉包裝，均由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心提供。沙門氏菌定性樣品編號為24-K961、24-J554（以下簡稱“K961”“J554”）；單增李斯特氏菌定性樣品編號為24-M289、24-Y906（以下簡稱“M289”“Y906”）。

1.2 儀器與試劑

蒸汽高壓滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；生物安全柜，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；SPX-80生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；電子分析天平，天津天馬衡基儀器有限公司；生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司；MALDIBiotyper全自動快速微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)，德國布魯克·道爾頓公司；實時熒光定量PCR儀，美國賽默飛世爾科技公司。

緩沖蛋白陳水（BPW）、磷酸鹽緩沖液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、四硫磺酸鈉煌綠增菌液、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、李氏菌增菌肉湯（LB1、LB2）、PALCAM瓊脂、血瓊脂平板、李斯特氏菌顯色平板、含 0.6% 酵母膏的胰酪陳大豆瓊脂（TSA-YE）、SIM動力培養(yǎng)基、腦心浸出液肉湯（BHI）、單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒（北京陸橋）；革蘭氏染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌試劑盒（天隆科技）。

1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC14028）、英諾克李斯特氏菌（ATCC33090）、伊氏李斯特氏菌（ATCC19119）、單增李斯特氏菌（ATCC19115）、斯氏李斯特氏菌（Listeriaseeligeri，ATCC35967），為確保菌株的質(zhì)量符合實驗要求，均進(jìn)行過系統(tǒng)化的生化和形態(tài)學(xué)鑒定。

1.4檢驗方法

依據(jù)天津市疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)實驗室能力驗證參試指導(dǎo)書、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗》（GB4789.4—2016）[5及《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB4789.30—2016）進(jìn)行試驗。

1.5樣品處理及制備

在生物安全柜內(nèi)用 75% 酒精棉球消毒西林瓶表面，無菌條件下開啟西林瓶，加入 5mL 無菌磷酸鹽緩沖液進(jìn)行再水化，渦旋振蕩至完全溶解，將溶液用無菌移液管轉(zhuǎn)移至無菌樣品瓶中，分3次用殘留液體沖洗西林瓶內(nèi)壁，采用旋轉(zhuǎn)瓶體結(jié)合移液管吹吸方式以確保全面清洗，合并所有清洗液至無菌樣品瓶中，終體積為 60mL 。

1.6增菌

無菌移取 25mL 以下樣本至 225mL BPW增菌液：待檢樣品K961、J554、無菌生理鹽水（空白對照）、陽性對照菌株的單菌落懸液，振蕩均質(zhì)器充分振蕩混勻，設(shè)定培養(yǎng)箱溫度 36^°C ，連續(xù)培養(yǎng) 18h 。

分別吸取 1mL 培養(yǎng)液加人 10mL 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中，于 36°C 培養(yǎng) 24h ；同時取 1mL 培養(yǎng)液加入 10mL 四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于 42°C 培養(yǎng) 24h 分別吸取 25mL 以下樣本置于 225mL LB1增菌液中：待檢樣品M289、Y906、無菌生理鹽水（空白對照）、陽性對照菌株的單菌落懸液（以上步驟為無菌操作）。設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為 30^°C ，連續(xù)培養(yǎng) 24h 后，吸取 0.1mL ，轉(zhuǎn)種于 10mL 的LB2增菌液中，30^qC 連續(xù)培養(yǎng) 24h 。

2 結(jié)果與分析

2.1選擇性分離結(jié)果

用接種環(huán)取增菌后的培養(yǎng)物K961、J554各一環(huán)，劃線接種于XLD平板于 36^qC 培養(yǎng) 24h ；BS平板于36°C 培養(yǎng) 48h 。結(jié)果顯示，K961、J554在XLD及BS平板均無可疑菌落生長，鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC14028在XLD有圓形帶黑心菌落生長；在BS平板上有灰綠色菌落生長。用接種環(huán)取增菌后的培養(yǎng)物M289、Y906各一環(huán)，采用分區(qū)劃線法，接種于PALCAM瓊脂平板和單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基中，置于 36°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h 。對可疑菌落進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。PALCAM瓊脂平板上，M289、Y906為直徑 1～2mm 的圓形灰綠色菌落，菌落周圍可見特征性棕黑色水解圈；在李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，呈現(xiàn)藍(lán)綠色圓形菌落，周圍有白色不透明暈圈，培養(yǎng)基背景潔凈，未觀察到其他雜菌干擾。

2.2 生化鑒定結(jié)果

從李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基平板上和PALCAM培養(yǎng)基上，分別挑取樣品M289、Y906的5個可疑菌落進(jìn)行木糖、鼠李糖發(fā)酵實驗。實驗結(jié)果見表1。

通過對血平血樣本進(jìn)行透光觀察發(fā)現(xiàn)，樣品M289、Y906的溶血特征與單增李斯特氏菌的陽性對照菌株表現(xiàn)一致，均呈現(xiàn)狹窄、清晰、明亮的溶血圈；斯氏李斯特氏菌僅有很微弱的透明溶血現(xiàn)象；英諾克李斯特氏菌未檢測到任何溶血現(xiàn)象；伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生寬的、輪廓清晰的 β 溶血區(qū)域。

2.3 飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果

上機(jī)分析樣品M289、Y906，結(jié)果為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，得分在 2.00～3.00 分，為高置信度鑒定，表示陽性結(jié)果（見表2）。

2.4熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)沙門氏菌和單增李斯特氏菌核酸測定試劑盒（天隆科技）的說明書，將樣品K961、J554的擴(kuò)增液、M289、Y906的菌株進(jìn)行提取擴(kuò)增。結(jié)果顯示，樣品K961、J554為陰性，未檢出沙門氏菌；M289、Y906陽性對照有熒光對數(shù)增長，且出現(xiàn)典型的S型擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值不超過38（見圖1）。因此，可以確定M289、Y906樣品為典型的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

2.5 報告結(jié)果

綜合選擇性分離結(jié)果、生化鑒定指標(biāo)、溶血試驗表現(xiàn)等鑒定結(jié)果，最終判定樣品M289、Y906為單增李斯特氏菌。

3結(jié)論與討論

K961、J554兩個樣品均未檢出沙門氏菌，樣品M289、Y906均檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，最終獲得“滿意”結(jié)果。本次能力驗證采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法為基礎(chǔ)檢測，結(jié)合飛行時間質(zhì)譜和實時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行雙重確認(rèn)，使結(jié)果更加可靠[]。雙平臺檢測可以有效避免傳統(tǒng)方法中因可疑菌落特征模糊導(dǎo)致的誤判風(fēng)險，如樣本K961、J554在培養(yǎng)基中未見典型的陽性菌落，則需要借助熒光定量PCR對增菌液進(jìn)行檢測，以確保結(jié)果準(zhǔn)確無誤。通過實驗室間比對來評價實驗室的檢測能力、驗證方法有效性、改善實驗室管理等具有重要意義，也是食品檢測機(jī)構(gòu)質(zhì)量控制的重要手段[8]。傳統(tǒng)國標(biāo)法中檢測沙門氏菌和單增李斯特氏菌所用的實驗設(shè)備簡單、成本不高，容易開展試驗，但溶血實驗易受培養(yǎng)條件等因素干擾，結(jié)果難以精準(zhǔn)區(qū)分，容易出現(xiàn)假陽性。在日常工作中要做好以下4點。 ① 培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)化管理，包括外觀形狀核查及培養(yǎng)基性能試驗等。 ② 優(yōu)化培養(yǎng)基儲存條件，配置溫濕度自動監(jiān)控裝置等。 ③ 實驗檢測過程雙人復(fù)核，減少人為操作誤差。 ④ 定期開展相關(guān)實驗研討，對關(guān)鍵控制點嚴(yán)格把關(guān)，讓檢測人員意識到微生物檢測工作的重要性，形成積極負(fù)責(zé)的工作態(tài)度。

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