高效液相色譜法測定干型葡萄酒中紐甜含量的方法優化

Optimization of a Method for the Determination of Neotame Content in Dry Wine by High Performance Liquid Chromatography

LI Chunmei （Baoji Quality and Technology Inspection and Testing Center， Baoji 721ooo， China）

Abstract： Objective： To establish a method for determining the content of neotame in dry wine by high performance liquid chromatography by optimizing chromatographic conditions and sample pretreatment steps. Method： The samples were extracted with mixed extracts，concentrated and then analyzed by liquid chromatography. Result： Neotame showed a good linear relationship in the concentration range of 0.06μg?mL^-1 to 6.00μg?mL^-1 ，with a correlation coefficient of 0.999 6.The recoveries of neotame in dry wine at different spiked levels were 83.4% to 93.0% ，and the relative standard deviation （RSD） was lt;3% .Conclusion： This method is simple， rapid and accurate， suitable for large-scale sample detection，and has good practicality and promotion potential.

Keywords： food additives; high performance liquid chromatography; neotame; dry wine

隨著生活品質的持續提升，人們對食品的訴求早已跨越單純的溫飽階段，轉而聚焦于健康與安全。這一深刻轉變，有力推動了食品添加劑工業的蓬勃發展。食品添加劑功能多元，不僅能夠提升加工食品的營養價值，維持食品的新鮮度，還能優化食品的色澤、香氣和口感，大幅改善食品的感官特性，同時滿足特殊消費群體的個性化需求。在食品行業中，食品添加劑發揮著不可或缺的作用，成為推動食品行業創新發展的重要力量。

紐甜，化學名稱為N-[N-（3，3-二甲基丁基）-L-α-天冬氨酰]-L-苯丙氨酸-1-甲酯[1]，是一種白色結晶性粉末，約含 4.5% 的結晶水，易溶于水，屬于功能性甜味劑。紐甜甜味純正，清新自然，甜度為蔗糖的 8000～12000 倍，阿斯巴甜的40倍以上[2]。紐甜不會引發蛀牙，在酸性條件下能保持甜味不變，但在水溶液中，其受溫度、pH值、時間等因素影響，甜度會有一定程度的下降。

目前，食品工業常用的甜味劑包括紐甜、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖和阿斯巴甜等。這些甜味劑都有相應的檢測方法，使用量必須遵循《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》（GB2760—2024）的要求。GB2760—2024對酒類產品中紐甜的使用量有嚴格限制，僅允許在發酵酒（葡萄酒除外）中使用，允許最大使用量為 0.033g?kg^-1 ，蒸餾酒和葡萄酒中不得添加。然而，部分不良商家為追求經濟利益，通過非法添加紐甜來提高產品的口感，此舉嚴重擾亂了市場秩序，損害了消費者的權益本研究對《食品安全國家標準食品中紐甜的測定》（GB5009.247—2016）中方法進行優化，旨在提供一種高效、快速的紐甜檢測方法。

1材料與方法

1.1儀器與設備

SPD-20A高效液相色譜儀（配有紫外檢測器），日本島津公司；超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；恒溫電熱板，中興偉業世紀儀器有限公司；渦旋振蕩器，無錫沃信儀器制造有限公司。

1.2材料與試劑

干型葡萄酒，煙臺凱富葡萄酒有限公司。

甲醇，月旭科技公司；辛烷磺酸鈉，迪馬科技公司；磷酸（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；紐甜標準品（ 1 000μg?mL^-1 ），編號為BW902596-1000-L，壇墨質檢科技產品；超純水。

混合提取液：分別吸取 0.80mL 甲酸和 2.50mL 三乙胺，加水定容至 1000mL ，pH值約為4.5。

離子對試劑緩沖液：稱取 2.00g 辛烷磺酸鈉用 500mL 水溶解，加入 1.0mL 磷酸，加水定容至1000mL^[3] C

1.3實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確吸取 2.50mL 紐甜標準品（ 1 000μg?mL^-1 ）于 50mL 容量瓶中，用混合提取液定容，配制成濃度為 50μg?mL^-1 的紐甜標準工作液。分別吸取0.012、0.040、0.200、0.400、0.600、0.800、 1.000mL 和1.200mL 紐甜標準工作液（ 50μgmL^-1 ）于 10mL 容量瓶中用混合提取液定容，配制成濃度分別為0.06、0.20、1.00、2.00、3.00、4.00、 5.00μg?mL^-1 和 6.00μg?mL^-1 的系列標準工作液。

1.3.2 樣品處理

稱取約 10g 混勻試樣于 50mL 具塞塑料離心管中，加入 30mL 混合提取液，振蕩混勻。超聲 15min 后，轉移至 50mL 容量瓶中，用混合提取液定容，混勻后待用。

吸取 10.0mL 上述樣液于小燒杯中，置于恒溫電熱板上 110^°C 濃縮至近干，用 1.00mL 混合提取液溶解，渦旋混勻，經 0.45μm 濾頭過濾后作為待測液供液相色譜分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱： C₁₈ 色譜柱（ 250mm×4.6mm ， 5μm ）；柱溫： 35°C ；流動相：A相為離子對試劑緩沖液，B相為甲醇；等度洗脫： _A+B=35+65 ；流速：1.0mL?min^-1 ；波長： 210nm ；進樣量： 50μL 。

2 結果與分析

2.1色譜條件的優化

與國標方法相比，本文在以下幾個方面進行了優化： ① 采用等度洗脫替代梯度洗脫，縮短了檢測時間（約 50% ）； ② 將乙腈替換為甲醇，以減少對檢驗人員、色譜柱和儀器的損傷； ③ 通過實驗確定流動相比例為離子對試劑緩沖液 + 甲醇 =35+65 時，目標峰分離效果最佳； ④ 將檢測波長從 218nm 優化至210nm ，以提高目標峰響應。經過優化后，色譜條件顯著提高了效率，標準溶液色譜圖見圖1。

2.2 樣品處理方法優化

本研究以干紅葡萄酒作為基質，向樣品中添加適量紐甜標準工作液對樣品進行污染。按照1.3.2樣品處理流程對污染樣品進行前處理，分別考察了樣品定容后的取樣體積（10、15、 20mL ）和恒溫電熱板加熱溫度（40、50、60、70、80、90、100、110‰ 和 120°C ）、加熱時間等因素對檢測結果的影響。經系統優化與分析，最終確定最佳前處理條件為取樣體積 10mL 、加熱溫度 110^qC 、加熱時間30min （加熱至近干狀態）。

2.3標準曲線與線性范圍

對1.3.1配制的系列標準溶液進行測定，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。線性回歸方程為 y=1.37×10^-5x+9.15×10^-3 ，相關系數為0.9996，可見紐甜在 0.06～6.00μg?mL^-1 內呈現良好的線性關系。標準曲線及相關系數見表 1^[4]

2.4方法的重復性

稱取 10g 干型葡萄酒空白樣品，分別加入0.2、0.4、 2.0mg?kg^-13 個水平的紐甜標準工作液，經前處理后進行測定，計算相對標準偏差（RelativeStandardDeviation，RSD）。如表2所示，3種不同濃度檢測結果的RSD均小于 3% ，表明方法的重復性良好[5]。

2.5方法的準確度

稱取 10g 干型葡萄酒空白樣品，進行0.2、0.4、2.0mg^.kg^-1 加標回收實驗，結果見表3。該方法回收率在 83.4%～93.0% ，說明方法準確度良好。樣品加標回收圖譜如圖2所示[]

3結論

本研究通過優化高效液相色譜分析條件，建立了高效、準確檢測干型葡萄酒中紐甜含量的方法。通過選擇適當的流動相（離子對試劑緩沖液 + 甲醇 =35+65 ）并采用等度洗脫，實驗中獲得了較為理想的出峰時間、峰形及分離度。選擇 210nm 作為檢測波長，不僅能獲得較好的響應值，還能有效提升分離度。同時，本方法顯著降低了對 C₁₈ 色譜柱和高效液相色譜儀的損害，從而延長了色譜柱和單向閥的使用壽命。在樣品前處理方面，采用超聲振蕩萃取，并通過電熱板加熱濃縮。與國家標準方法相比，本研究建立的分析方法在試劑消耗、實驗時間、毒性減少及對實驗人員的身體傷害等方面均表現出顯著優勢。該方法結果準確，重現性良好，且適用于大批量樣品的檢測，具有較高的推廣應用價值。

參考文獻

[1]周魁，黨璐，張存社，等.高效液相色譜法測定紐甜的含量[J].廣東化工，2012，39（5）：203-204.

[2]王齊，朱偉偉，楊俊.高效液相色譜法快速篩查與測定葡萄酒中紐甜[J].食品科學，2013，34（4）：154-156

[3]國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準食品中紐甜的測定：GB5009.247—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[4]蔡基智，林杰，廖金華.高效液相色譜法測定食品中紐甜的含量[J].廣東化工，2009，36（9）：176.

[5]國家衛生健康委員會，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準化學分析方法驗證通則：GB5009.295—2023[S].北京：中國標準出版社，2023.

[6]國家質量監督檢驗檢疫總局.實驗室質量控制規范食品理化檢測：GB/T27404—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

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