兒童暴發性心肌炎miRNA的篩選及生物信息學分析

[摘要] 目的 利用生物信息學對兒童暴發性心肌炎（fulminant myocarditis，FM）患兒血清中差異表達的微RNA（microRNA，miRNA）及其靶基因進行分析，探索其發病機制。方法 選擇高通量公共基因表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中的數據集GSE221090，并利用GEO2R在線工具進行生物信息學分析，篩選出差異表達miRNA。利用在線miRDB數據庫預測差異表達miRNA的靶基因。采用DAVID工具對篩選出的靶基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。通過STRING數據庫和Cytoscape軟件構建與差異表達基因相關聯的蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein interaction networks，PPI），并篩選出核心基因。結果 對FM患兒與健康志愿者血清中差異表達miRNA進行篩選，共獲得148個差異表達miRNA，其中上調109個、下調39個。上調miRNA和下調miRNA各取評分排名前10位，利用在線miRDB數據庫對上述miRNA進行靶基因預測，納入表達上調miRNA所調控的靶基因291個，表達下調miRNA所調控的靶基因290個。對靶基因進行GO和KEGG分析，顯示表達上調miRNA所調控的靶基因主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway，PI3K/Akt）信號通路、叉頭盒O信號通路等相關信號通路，表達下調miRNA所調控的靶基因主要涉及轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等相關信號通路。通過PPI和Cytoscape軟件篩選出相關度評分排名前10位的差異表達基因：沉默調節蛋白1（sirtuin 1，SIRT1）、信號轉導和轉錄激活因子3、雌激素受體1、H3.3組蛋白B、核受體共抑制因子1、干擾素調節因子4、白細胞介素-1β、Dicer1核糖核酸酶Ⅲ、組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）、DEAD盒解旋酶6。結論 miR-22-3p、miR-4284等在兒童FM發病過程中發揮重要作用，可能與其調控的SIRT1和HDAC1表達水平相關，其機制可能通過PI3K/Akt、TGF-β等信號通路發揮生物學效應。

[關鍵詞] 暴發性心肌炎；微小RNA；基因芯片；生物信息學

[中圖分類號] R542.2" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.18.003

Screening and bioinformatics analysis of expressed miRNA in pediatric fulminant myocarditis

WANG Luyin¹， YAO Jiafang²， TANG Kankai¹

1.Department of Critical Care Medicine， the First Affiliated Hospital of Huzhou Normal University， the First People’s Hospital of Huzhou， Huzhou 313000， Zhejiang， China; 2.Department of Cardiology， the First Affiliated Hospital of Huzhou Normal University， the First People’s Hospital of Huzhou， Huzhou 313000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To analyze the differentially expressed microRNA （miRNA） and their target genes in the serum of pediatric patients with fulminant myocarditis （FM） through bioinformatics methods， and to explore the pathogenesis. Methods GSE221090 dataset from the high-throughput Gene Expression Omnibus （GEO） were selected， and bioinformatics analysis was performed by using the GEO2R online tool to screen for differentially expressed miRNA. The online miRDB database was used to predict the target genes of the differentially expressed miRNA. The DAVID tool was employed for gene ontology （GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway analysis of the screened target genes. Additionally， protein-protein interaction networks （PPI） associated with the differentially expressed genes was constructed by using STRING database and Cytoscape software， and core genes were screened. Results A total of 148 differentially expressed miRNA were identified in the serum of pediatric FM group compared to normal children group， including 109 up-regulated and 39 down-regulated miRNA. The top ten up-regulated and down-regulated miRNA based on their scores were selected， and target gene prediction for a forementioned miRNA was conducted by using the online miRDB database， identifying 291 target genes regulated by up-regulted miRNA and 290 target genes regulated by down-regulated miRNA. Subsequent GO and KEGG analyses demonstrated that the target genes of up-regulated miRNA were primarily enriched in signaling pathways including phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B signaling pathway （PI3K/Akt） and forhead box O， whereas the target genes of down-regulated miRNA predominantly participated in the transforming growth factor-β （TGF-β） signaling pathway and related pathways. The top ten differentially expressed genes with the highest relevance scores using PPI and Cytoscape software were identified， including sirtuin 1 （SIRT1）， signal transducer and activator of transcription 3， estrogen receptor 1， H3.3 histone B， nuclear receptor corepressor 1， interferon regulatory factor 4， interleukin-1 Beta， dicer 1 ribonucleaseⅢ， histone deacetylase 1 （HDAC1）， and DEAD-box helicase. Conclusion miR-22-3p， miR-4284， and others are crucial in the pathogenesis of pediatric FM， possibly related to the expression levels of SIRT1 and HDAC1 regulated， with mechanisms that may exert biological effects via the PI3K/Akt， TGF-β， and other signaling pathways.

[Key words] Fulminant myocarditis; microRNA; Gene chip; Bioinformatics

暴發性心肌炎（fulminant myocarditis，FM）是一種罕見且嚴重的心臟疾病，好發于兒童和青壯年，表現為快速進展的心功能不全和循環衰竭^[1]。兒童FM病程短暫、進展迅速，可導致嚴重并發癥，甚至危及生命。大多數兒童經積極治療預后良好，但仍有部分患兒面臨高死亡率或需心臟移植的風險^[2]。兒童FM的臨床表現多樣且缺乏特異性，早期診斷和及時治療尤為重要^[3]。本研究利用生物信息學篩選并分析FM差異表達微RNA（microRNA，miRNA）及其靶基因，探討其相互作用機制，有助于深入理解兒童FM的發病機制，為生物標志物篩選提供支持，為早期診斷與預防提供理論基礎。

1" 資料與方法

1.1 "數據獲取與miRNA的篩選

從公共基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）獲取基因表達譜數據集GSE221090。數據集由3例FM患兒和3名健康志愿者的血清miRNA表達陣列數據構成。使用GEO2R在線分析工具對數據集進行分析，設置條件|LogFC|gt;2和調整后Plt;0.01，篩選出差異表達的miRNA，同時按miRNA對應的|LogFC|進行評分，其中LogFC是計算FM兒童樣本和對應健康志愿者樣本miRNA表達量的倍數，分別選取評分前10位的上調miRNA和下調miRNA。

1.2" miRNA對應靶基因獲取

使用miRDB數據庫在線預測上調及下調差異表達miRNA的靶基因，通過支持向量機模型整合序列互補性、熱力學穩定性、進化保守性等特征生成目標評分，取每個miRNA目標評分前30位的靶基因，且對應的目標評分gt;80分。

1.3 "基因本體功能和京都基因與基因組百科全書通路富集分析

通過使用DAVID在線分析工具，對與兒童FM相關的靶基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。采用超幾何分布檢驗計算GO和KEGG富集顯著性，并用Benjamini-Hochberg法校正多重假設，Plt;0.05為差異有統計學意義。

1.4" 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建與分析

使用STRING數據庫對上述靶基因構建蛋白質–蛋白質相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網絡圖，并使用Cytoscape3.7.1軟件進行可視化分析。使用Cytohubba插件對PPI網絡上的靶基因與兒童FM的相關性進行評分，篩選出相關度評分排名前10位的核心基因。

2" 結果

2.1" 差異表達miRNA和靶基因的鑒定與篩選

通過GEO2R在線分析工具，對FM患兒及健康志愿者的轉錄組數據進行分析，共篩選出148個差異表達miRNA，其中109個miRNA呈上調狀態，39個miRNA則顯示下調趨勢，見圖1。FM患兒血清miRNA差異表達評分排名前10位的上調miRNA和下調miRNA分析見表1和表2。使用在線miRDB數據庫對上述20個miRNA預測靶基因，取每個miRNA評分排名前30位的靶基因，剔除重復基因后，表達上調miRNA所調控的靶基因共291個，表達下調miRNA所調控的靶基因共290個，共納入581個靶基因。

2.2" GO功能分析與KEGG通路富集分析

通過使用DAVID在線分析工具，分別對291個表達上調和290個表達下調miRNA所調控的靶基因進行GO功能分析與KEGG通路富集分析。表達上調的miRNA所調控的靶基因生物學過程（biological process，BP）分析顯示主要與基因表達負調控、成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）信號通路正調控、RNA聚合酶Ⅱ（polymerase Ⅱ，PolⅡ）對轉錄的正調控作用等相關。細胞成分（cellular component，CC）分析顯示主要影響細胞核、細胞核質、高爾基體等。分子功能（molecular function，MF）分析顯示主要參與蛋白結合、DNA結合轉錄因子活性、序列特異性DNA結合等。KEGG分析結果顯示主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B signaling pathway，PI3K/Akt）信號通路、叉頭盒（forhead box，Fox）O信號通路等，見表3。表達下調miRNA所調控的靶基因BP分析顯示主要與RNA PolⅡ對轉錄的調節、RNA PolⅡ對轉錄的正調控作用、子宮內胚胎發育等相關。CC分析顯示主要影響細胞核質、染色質間顆粒、染色質等。MF分析顯示主要影響金屬離子結合、mRNA結合、RNA PolⅡ順式調控區序列特異性DNA結合等。KEGG分析結果顯示主要富集在轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路，見表4。

2.3" 靶基因的PPI分析

本研究使用STRING數據庫對差異表達miRNA的581個靶基因構建PPI網絡圖，并使用Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化，見圖2。使用Cytohubba插件對PPI網絡上的靶基因與兒童FM的相關性進行評分，篩選出相關度評分排名前10位的核心基因，其中表達上調miRNA所調控的靶基因有6個：沉默調節蛋白1（sirtuin 1，SIRT1）、信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、H3.3組蛋白B（H3.3 histone B，H3-3B）、核受體共抑制因子1（nuclear receptor corepressor 1，NCOR1）、干擾素調節因子4（interferon regulatory factor 4；IRF4）；表達下調miRNA所調控的靶基因有4個：白細胞介素-1β（interleukin-1 Beta，IL-1β）、Dicer1核糖核酸酶Ⅲ（dicer 1 ribonuclease Ⅲ，DICER1）、組蛋白去乙酰化酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）、DEAD盒解旋酶6（DEAD-box helicase 6，DDX6），見圖3。

3 "討論

miRNA在基因表達調控中發揮重要作用，且在心肌炎等心血管疾病的發病機制中扮演關鍵角色^[4]。針對兒童FM中miRNA的研究相對匱乏。本研究對納入的581個靶基因進行GO功能分析發現兒童FM相關的miRNA靶基因主要涉及信號傳導、分子結合能力等，包括FGFR的正調控、RNA PolⅡ對轉錄的調控等。FGFR的正調控可能對心肌細胞的存活和功能恢復具有重要影響。研究顯示心肌缺血再灌注損傷后激活FGFR信號通路，從而影響心臟功能恢復和血管重塑能力^[5]。此外，研究發現FGFR可通過調節N-鈣黏附蛋白的穩定性影響細胞間接觸，限制炎癥反應并促進細胞遷移^[6]。RNA PolⅡ是負責轉錄蛋白編碼基因的關鍵酶，通過影響轉錄延伸速率和暫停模式調節mRNA合成維持心臟功能^[7]。RNA PolⅡ的活性可能受病毒感染或免疫反應的影響導致心肌細胞內基因表達異常，并進一步加重炎癥反應和細胞損傷^[8]。未來針對RNA PolⅡ及其調控機制進行深入研究，將有助于揭示其在兒童FM中的具體作用。

本研究KEGG通路富集分析結果發現PI3K- Akt、FoxO及TGF-β信號通路在兒童FM中被大量激活。研究表明PI3K/Akt信號通路可通過抑制凋亡途徑保護心肌細胞，減輕炎癥反應促進修復^[9]；通過抑制PI3K/Akt路徑降低病理狀態下過度活躍的免疫反應，減輕心肌損傷^[10]。FoxO信號通路通過調控多種基因的表達，參與細胞周期停滯、氧化應激反應及細胞凋亡等生物學過程^[11]。在心肌缺氧–再灌注模型中，FoxO信號通路被認為可減輕氧化應激引起的細胞損傷促進細胞存活^[12]。在小鼠模型中，通過抑制FoxO信號通路導致心肌損傷加重，這進一步支持其在保護心臟中的重要角色^[13]。TGF-β信號通路在組織修復和纖維化過程中發揮關鍵作用。研究報道在病毒性心肌炎小鼠模型中，血小板因子4表達顯著增加，通過激活TGF-β1/Smad2/3信號通路，促進心臟成纖維細胞的活化和細胞外基質的合成，最終導致心臟纖維化的發生^[14]。此外，研究指出TGF-β信號通路在心肌炎巨噬細胞中調節細胞因子的產生，尤其是促炎和抗炎細胞因子的生成，表明TGF-β信號在心臟炎癥過程中具有關鍵的調節作用^[15]。通過靶向干預上述信號通路，有望為兒童FM提供新的治療策略。

本研究通過對納入研究的靶基因與兒童FM的相關性進行評分，篩選出相關度排名前10位的核心基因，包括SIRT1、HDAC1等。其中SIRT1是一種依賴于NAD+的去乙酰化酶，參與調節細胞代謝、應激反應和炎癥過程。研究表明SIRT1可通過激活SIRT1/PGC-1α/PI3K/Akt信號通路，降低心肌纖維化和氧化應激，保護心肌細胞功能^[16]。HDAC1是一種關鍵的表觀遺傳調控因子，通過去乙酰化作用影響基因表達，參與細胞增殖、凋亡及免疫反應等生物學過程。研究顯示抑制HDAC1的活性可顯著減輕TGF-β1對過氧化物酶體增殖物激活受體γ轉錄的抑制作用，從而影響心臟的重塑和功能^[17]。本研究顯示SIRT1、HDAC1上游miRNA分別是miR-22-3p、miR-4284，據此推測miR-22-3p/SIRT1/ PI3K-Akt信號軸、miR-4284/HDAC1/TGF-β信號軸可能影響兒童FM的發生發展。

綜上，本研究篩選出差異表達的miRNA及其靶基因，揭示這些分子在兒童FM中的潛在生物學機制。在未來的研究中，本課題組將進一步驗證這些結果并探索其臨床應用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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