海島棉R2R3-MYB基因家族的鑒定及其在黃萎病脅迫下的表達分析

中圖分類號：S562：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025）06-0001-14

AbstractR2R3-MYB transcription factors play crucial roles in the process of plants responding to stress. In this study，based on the genomic data of Gosspium barbadense，the members of the R2R3-MYB gene family in G .barbadense were systematically identified. Bioinformatics methods were used to analyze the phyletic evolution，structure，physicochemical properties，and cis-acting elements of the promoter of the R2R3-MYB gene family in G . barbadense. Five candidate genes for Verticillium wilt resistance were screened out using transcriptome expression profiles，and the expression patterns of each candidate gene under the induction of Verticillium wilt，salicylic acid （SA）and methyl jasmonate （MeJA） were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that there were 98 R2R3-MYB genes in the genome of G .barbadense，which distributed on 25 chromosomes.The phylogenetic tree analysis indicated that the members of the R2R3-MYB gene family in G. barbadense could be divided into three large subgroups，and they were relatively conserved in evolution.Promoter analysis revealed multiple cis-acting elements related to plant hormonesand stress responses.The expression patern analysis after Verticillium wilt stress showed that all the R2R3-MYB genes in G barbadense had different degrees of diferential expression after Verticillium wilt stress.Five candidate genes for Verticillium wilt resistance in G. barbadense （GbMYB-21，GbMYB-34，GbMYB-39， GbMYB-76，and GbMYB83）were screened out，which were all induced by Verticillum wilt stress，SA and MeJA.In conclusion，this study demonstrated that the R2R3-MYB gene family in G. barbadense played an important role in coton disease resistance，which could provide a theoretical basis for further research on the functions of R2R3-MYB genes in G. barbadense and the molecular mechanism of cotton resistance to Verticillium wilt.

KeywordsGossypium barbadense； R2R3-MYB gene family； Bioinformatics analysis； Verticillium wiltstress ； Expression analysis

棉花是我國重要的經濟作物，在紡織、國防、醫藥和汽車等領域有著重要的用途。然而隨著棉花種植面積的擴大以及連年種植，黃萎病危害越發嚴重，造成棉花產量的損失。由于缺乏可利用的抗性資源且棉花抗黃萎病的分子機制尚不清晰，使棉花抗黃萎病育種成為世界性難題。海島棉具有較高的黃萎病抗性，因此解析海島棉抗黃萎病的分子機制成為了一個熱門且亟需解決的問題。

轉錄因子又稱反式作用因子，通過與真核基因的順式作用元件產生特異性相互作用激活或抑制基因的轉錄[1]。MYB是植物中一類最大的轉錄因子家族，第一個MYB轉錄因子是從玉米中分離鑒定出來的 ZmMYBC1^[2] ?；谄銷端所包含的MYB保守結構域的數目將MYB蛋白歸于4個亞類：1R-MYB（R1/2或R3MYB）、2R-MYB（R2R3-MYB）3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB（R1/R2-like）[3]。每個MYB 保守結構域均由50個左右氨基酸組成并編碼3個a螺旋，形成螺旋-轉角-螺旋結構嵌合在DNA大溝中，而在MYB蛋白的C端通常包含1個轉錄激活域或1個發揮轉錄抑制功能的EAR結構[4]。這4個亞類的MYB蛋白在功能上存在巨大的差異，其中1R蛋白參與次生代謝、響應磷饑餓信號以及花與果實的發育調控[5];3R蛋白通常與細胞周期的調控緊密相關[；4R蛋白是最小的一個亞類，目前尚無功能報道;2R蛋白是成員最多的一個亞類，根據其C端保守氨基酸結構域分為28個亞組，分別參與初生代謝和次生代謝、激素信號傳導、發育調控及生物逆境脅迫和非生物逆境脅迫響應等[7-8]

R2R3-MYB轉錄因子在植物抗病過程中發揮著重要作用。有研究表明，在抗疫霉病的辣椒品種中R2R3-MYB轉錄因子的表達量顯著上調[9]。硫化氫氣體信號通過對R2R3-MYB轉錄因子CsMYB30的巰基化修飾增強其對靶啟動子的結合活性，進而促進黃瓜病程相關蛋白PR1的基因表達，提高黃瓜對灰霉病的抗性[10]。在桑樹中R2R3-MYB轉錄因子MaMYB4在病葉中的表達量顯著高于健葉，將MaMYB4轉入煙草中后發現轉基因煙草能夠顯著提高對煙草花葉病毒的抗性[11]。小麥R2R3-MYB轉錄因子 TaMYB28能夠和TaCER1-1互作進而增強小麥蠟質層的厚度，影響蠟質晶體的數量和形態，調控韌皮部防衛反應，提高小麥對白粉病的抗性[12] O

基因組測序在棉花中取得了顯著的成果，使系統鑒定和研究棉花基因家族成為可能[13-16] 。本課題組在之前的研究中通過黃萎病脅迫的轉錄組數據篩選到了一個R2R3-MYB轉錄因子作為候選基因，通過棉花病毒介導的基因沉默（virusinducedgenesilencing，VIGS）和超表達擬南芥發現其能夠通過調控木質素合成來抵御黃萎病。基因序列決定蛋白質氨基酸序列，進而決定蛋白質的空間結構和功能，基因序列間的相似性越高，其在植物中所發揮的功能也越相近。為了篩選更多與黃萎病抗性相關的候選基因，本研究分析了海島棉 R2R2–MYB 基因家族的染色體分布、系統進化關系、基因結構、啟動子順式作用元件和黃萎病脅迫下它們在海島棉根部的表達譜，并通過轉錄組數據、順式作用元件分析、黃萎病脅迫和外源激素誘導表達篩選抗黃萎病相關候選基因，以期為海島棉 R2R3-MYB 基因功能和棉花抗黃萎病分子機制研究提供理論依據。

材料與方法

1.1 材料與處理

選用海島棉品種海7124為試驗材料，盆栽試驗于2023年10月15日在新疆農業大學農業與生物技術重點實驗室棉花栽培實驗室中進行。將海7124種植于蛭石和消毒土壤按 1：2 混合配成的基質中，營養缽直徑為 10cm ，每個營養缽裝入200g 基質，每盆3顆種子。培養條件：溫度 25.0～ 28.0‰ ，以白熾燈為光源，光周期 ^16h 光照 ^′8h 黑暗，相對濕度 80% 。2023年11月5日棉株長至兩葉一心時，使用撕底傷根法對棉株接種大麗輪枝菌V991，分別于接種后 0，1，3，6，12，24，48， ^72h 采集根部組織，每處理重復3次。2023年11月16日將配制好的0.05mmol/LMeJA和SA溶液分別噴施到有3＼～4片真葉的棉花植株上，直至有水珠滴下為止，分別于噴施后0、1、3、6、12、24、48，72h 對棉花真葉取樣，每處理重復3次。

1.2 海島棉 R2R3-MYB 基因的鑒定與生物信息學分析

海島棉全基因組、蛋白質序列和GFF3文件來自于 Cottongen 網站（https：//www.cottongen.org/data/download/genome_tetraploid/AD2），擬南芥基因組和蛋白質序列文件來自于TAIR網站（https：//www.arabidopsis. org/download/index-au-to.jsp？ dir /download_files/Genes），水稻基因組和蛋白質序列文件來自于EnsemblPlants網站（https：//ftp. ebi. ac.uk/ensemblgenomes/pub/re-lease-58/plants/fasta/oryza_sativa/pep/）[17]。使用 Pfam 網站（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載MYB轉錄因子中保守的MYB結合結構域HMM模型文件（PF00249），通過TBtools軟件中的Sim-pleHMMSearch篩選海島棉、擬南芥和水稻中的R2R3-MYB 家族基因[18]。通過 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中保守結構域數據庫（conserveddomaindatabase，CDD）剔除基因結構不完整和序列過短的候選基因[19]，最終得到海島棉、擬南芥和水稻 R2R3-MYB 基因家族成員。利用ExPASy 軟件（http：//cn.expasy.org/tools）計算海島棉R2R3-MYB家族蛋白的氨基酸數量、相對分子質量、理論等電點、不穩定系數、脂肪族氨基酸指數和親疏水性平均系數[20]

1.3海島棉 R2R3-MYB 基因家族的系統發育

利用MEGA11軟件中的ClustalW默認設置對擬南芥、水稻和海島棉的R2R3-MYB蛋白序列進行多序列比對，基于序列比對的結果采用鄰近法構建系統進化樹，其中Bootstrap值設定為1 000 ，利用在線工具Evolview（https：//evolgenius.info/）對系統發育樹進行編輯和美化。

1.4海島棉 R2R3-MYB 基因家族的染色體位置、基因結構、motif分析和順式作用元件分析

從海島棉基因組注釋文件中提取海島棉R2R3-MYB基因家族成員的染色體位置信息，利用Mapchart軟件繪制基因的染色體定位圖。通過MEGA11軟件構建海島棉 R2R3-MYB 基因家族進化樹，得到nwk 文件[21]。通過 MEME 程序進行motif分析（設置功能域數為10）[22]。將MEME程序運行后得到的xml文件、進化樹的nwk文件和基因結構的gff文件利用TBtools軟件進行可視化處理[23]。截取海島棉 R2R3-MYB 基因上游200ObpDNA序列，利用PlantCARE數據庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測可能存在的順式作用元件，并使用TBtools軟件進行可視化處理[24] 。

1.5海島棉 R2R3-MYB 基因家族表達模式分析

從NCBI SAR（Sequence Read Archive）數據庫下載海7124黃萎病接菌后的轉錄組數據（基因組測序計劃編號PRJNA234454）。使用fastp軟件（版本0.23.4）進行原始數據過濾，獲得可用于后續分析的cleanreads。以海7124的基因組（ht-tps：//www.cottongen.org/species/Gossypium__bar-badense/ZJU-AD2_v1.1）作為參考，使用HISAT2進行 reads比對，利用StringTie工具對比對上的reads進行定量[25]。用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片（FPKM）衡量基因表達量。

1.6 候選基因表達分析

根據海島棉R2R3-MYB家族基因的cDNA信息，采用PrimerPrimier5.0軟件設計特異區域引物（表1）。分別以海7124黃萎病脅迫的根組織和激素誘導的葉片組織cDNA為模板，利用qRT-PCR方法檢測候選基因的表達情況，每個樣本設置3次重復，內參基因為GbUBQ7。

qRT-PCR按照Zhao 等[26]的方法進行。總RNA提取試劑盒（天根，中國）。使用M-MLVRTasecDNASynthesisKit（TaKaRa，日本）進行反轉錄。在 BioRad CFX96 Real-time System，使用iTaq Universal SYBR Green Supermix（BioRad，美國）試劑盒并按其提供的方法進行qRT-PCR擴增，擴增體系 （ 25μL ）： 2× Taq PCR MasterMix12.5μL ， 模板 9.5μL ，上、下游引物各 1μL ， 。反應程序： 95^°C 預變性 30s;95°C 變性5s， 60^°C 退火30s，40個循環。用 2^-ΔΔCt 方法進行相對定量分析[27] O

2 結果與分析

2.1 海島棉 R2R3-MYB 基因家族的鑒定

通過TBtools的SimpleHMMSearch功能篩選海島棉全基因組中的MYB家族基因，然后通過NCBI網站中的CDD結構域篩選，最終確定了98個海島棉R2R3-MYB家族基因（表2）。這些基因的編碼蛋白氨基酸數目在 147～496 aa 之間，相對分子質量在 之間，理論等電點（pI）在 5.12～9.28 之間，不穩定系數在37.33～77.44 之間，脂肪族氨基酸指數在 50.04～ 83.93之間，所有成員的親疏水性平均系數均小于0，為親水性蛋白，

98個GbMYB基因分布在海島棉的25條染色體上（A01、A03—A13、D01—D13），其中 A亞組中含有47個基因，D亞組中含有51個基因。在A02染色體上不存在R2R3-MYB家族基因，而在D02 染色體上存在一個基因；A03和 A04號染色體上分別存在2個基因，而D03和D04號染色體上各只有1個基因；D05染色體上含有5個基因，而A05號染色體上只有3個基因；D09號染色體上含有2個基因，而A09號染色體上只有1個基因；D亞組上有兩個基因GbMYB-97和Gb-MYB-98在 super-scaffold_610_D13上，在A亞組上則不存在這樣的基因。這些說明海島棉 R2R3- MYB基因家族在進化過程中可能發生了基因的丟失與復制，但是從整體上來看A亞組基因和D亞組基因之間仍然存在著很強的對應關系，這也與棉花的進化關系相符合，

2.2 海島棉R2R3-MYB家族基因的進化分析

為了更好地理解海島棉R2R3-MYB家族基因的進化關系，基于海島棉的98個、擬南芥的50個和水稻的44個R2R3-MYB蛋白序列的全長構建了系統進化樹。結果（圖2）顯示，海島棉R2R3-MYB家族基因可以分A、B、C三個亞組，其中A亞組中含有33個海島棉R2R3-MYB家族基因，B亞組中含有31個，C亞組中含有34個。A亞組中含有10個擬南芥和29個水稻R2R3-MYB基因；B亞組中含有29個擬南芥和13個水稻 R2R3- MYB基因；在C亞組中擬南芥和水稻R2R3基因數量最少，分別只有11個和2個

Gb：海島棉；At：擬南芥；Os：水稻。

2.3 海島棉R2R3-MYB家族基因的進化樹、基因結構和motif分析

根據海島棉R2R3-MYB家族基因的全長、CDS和蛋白質序列進行進化樹、基因結構和motif分析。結果如圖3所示，絕大部分基因包含3個外顯子和2個內含子，3個外顯子中第1個和第 2個外顯子較短，第3個外顯子要遠長于第1個和第2個外顯子。所有基因中都含有motif1、2、3、4、5、7，除GbMYB-93外都含有motif8，大部分基因含有motif6和motif9。說明這些基序在進化過程中較為保守，同一家族可能存在功能相似性。根據進化樹結果將海島棉R2R3-MYB家族基因分為3個亞組，A亞組中大部分基因含有motif10；B亞組中大部分基因含有多個motif9，還發現了一個特殊的基因GbMYB-78，其他基因中motif1、2、3、4、5、7位于基因的起始位置，而GbMYB-78中這些motif基序則位于基因的中間；C亞組中所有的基因中都含有motif6，而A亞組和B亞組的部分基因中不含有motif6。motif是蛋白質分子中具有特定空間構象和功能的結構組分，是結構域的亞單位，與基因特定的功能聯系在一起。這

3個亞組之間motif分布存在著差異，說明它們可能在進化過程中出現了基因結構和功能的變化。

2.4 海島棉R2R3-MYB家族基因啟動子順式作用元件分析

通過PlantCARE數據庫分析了海島棉R2R3-MYB家族基因上游 2000bp 的啟動子區。如圖4所示，在海島棉R2R3-MYB家族基因啟動子中發現了數量眾多的與植物激素反應和生物脅迫相關的順式作用元件，主要包括參與類黃酮生物合成調控的順式作用元件以及參與MeJA、水楊酸、防御和應激反應的順式作用元件。其中65個 R2R3-MYB 基因啟動子含有參與SA反應的順式作用元件，47個基因含有參與MeJA反應的順式作用元件，5個基因含有參與類黃酮反應的順式作用元件，38個基因含有參與應激與防御反應的順式作用元件，32個基因同時含有參與SA和MeJA反應的順式作用元件。這些順式作用元件都與抗病密切相關，說明海島棉 R2R3-MYB 基因家族中可能存在許多抗病相關基因，其中GbMYB-85基因同時存在上述4個抗病相關的順勢作用元件，表明其可能在棉花抗病過程中發揮著重要作用。而且不同基因啟動子中順式作用元件的種類和數量不同，表明它們可能通過不同的信號通路在生物脅迫反應中發揮作用。

2.5 海島棉R2R3-MYB家族基因在黃萎病脅迫下的表達模式分析

為了明確海島棉R2R3-MYB家族基因在黃萎病脅迫處理下的表達模式，利用轉錄組測序數據對接種大麗輪枝菌后不同時間的棉花根部R2R3-MYB家族基因的表達模式進行分析。結果（圖5）表明，大部分基因在黃萎病脅迫后表達量升高，其中，11個基因 Φ_GbMYB-OI，O2，O3，2O， （2026、27、33、48、50、74 和 79）在脅迫后 6h 表達量量急劇上升，隨后逐漸下降；14個基因（GbMYB-05、13、14、15、39、40、42、43、51、53、84、89、91 和92）在脅迫后 12h 表達量快速上升，隨后逐漸降低； GbMYB-37 在脅迫后 24h 表達量大幅上升，隨后開始下降；4個基因 （GbMYB-52，55，81 和85）在脅迫后 ^72h 表達量才開始上升；另外還有11個基因 （GbMYB-O8，22，30，3I，36，4I，46，70， （2080、81和90）在 0h 時處于高表達，在黃萎病脅迫后表達水平開始急劇下降。表明海島棉R2R3-

MYB家族基因在黃萎病脅迫后的表達量變化存在著差異，這些基因可能在海島棉響應黃萎病脅迫中起重要作用

2.6 候選基因在黃萎病脅迫以及SA和MeJA誘導下的表達模式分析

結合海島棉R2R3-MYB家族基因在黃萎病脅迫處理下的表達模式及基因順式作用元件分析結果，篩選出5個在黃萎病脅迫后差異表達且啟動子區含有參與SA和MeJA反應順式作用元件的基因，分別為 GbMYB-2I，34，39，76，83 。qRT-PCR分析發現，黃萎病脅迫后各候選基因都被誘導表達，其中GbMYB-21和GbMYB-34在脅迫后^48h 表達量最高， GbMYB-2I 表達量達 0h 時的16.8倍; GbMYB-39 和 GbMYB-76 在黃萎病脅迫后 12h 表達量達到最高；而GbMYB-83被誘導表達的速度最快，在脅迫后 6h 表達量就達到頂峰（圖6）。

外源SA噴施后5個候選基因表達量均上升，其中 GbMYB-34，GbMYB-76 和GbMYB-83均在誘導后 6h 達到頂峰，GbMYB-34表達量達到0h 時的7.2倍； GbMYB-2I 響應較為遲緩，在SA誘導后 12h 表達量水平才達到頂峰；而GbMYB-39能夠迅速響應SA的誘導，在誘導后 ¹h 表達量急劇上升并達到頂峰（圖7）。

外源噴施MeJA后5個候選基因也被誘導，表達量顯著上升。其中 均在誘導后 24h 表達量達到頂峰，GbMYB-21表達量增幅較大，達到了 ^0h 時的14.9倍，相較于SA誘導， GbMYB-76 響應MeJA誘導的速度更為緩慢； GbMYB-34 和 GbMYB-83 均在誘導后 ³h 表達量達到頂峰，與SA誘導相比，它們對MeJA誘導的響應速度更快。 GbMYB-34 在MeJA誘導³h 后表達量就急劇上升達到頂峰，同SA誘導類似，GbMYB-39是5個基因中最快響應MeJA誘導表達的基因（圖8）。

3討論與結論

本研究從海島棉中鑒定到98個R2R3-MYB家族基因，分布在25條染色體上，A亞組和D亞組上的基因數量基本一致，但部分染色體上的基因數量存在差異，這表明海島棉R2R3-MYB家族基因與進化關系相符合，但在進化過程中仍發生了基因的丟失與復制。將海島棉、擬南芥以及水稻R2R3-MYB基因家族構建進化樹，可以將98個海島棉R2R3-MYB家族基因分為三個亞組，各亞組中基因數量相近，但A亞組中水稻R2R3-MYB家族基因的數量是B亞組的近3倍，是C亞組的近15倍，而B亞組中的擬南芥R2R3-MYB家族基因數量分別是A亞組和C亞組的近3倍

SA、MeJA和乙烯（ET）被認為是參與調節植物對病原菌防御反應的三種主要的植物激素。擬南芥轉錄因子AtWRKY75通過激活SA抗病途徑提高擬南芥對核盤菌的抗性[28]；過表達煙草轉錄因子NtWRKY50能夠使煙草中SA含量迅速增加，激活下游PR基因的表達，從而使煙草能夠抵御青枯病菌的入侵[29]，茉莉酸（JA）能夠在維管束和空氣中進行遠距離運輸，將病原體入侵信號從感染部位傳遞到整個植株，使植株產生系統性抗性，還能夠在病原體入侵后誘導植物大量合成木質素、類黃酮和萜類等物質，提高植株的抗病性。植物體內JA含量上升后還能夠加速植物表皮毛的生長及次生壁的加厚，導致病原體難以入侵和定植[30-32]。本研究從海島棉R2R3-MYB家族基因的啟動子區鑒定到65個基因中含有參與SA反應的順式作用元件，47個基因中含有參與MeJA反應的順式作用元件，32個基因同時含有參與SA反應和MeJA反應的順式作用元件。這些基因可能通過SA和MeJA的誘導激活表達來參與海島棉對黃萎病的抗性。

R2R3-MYB轉錄因子在植物中的作用多種多樣，其中許多因子與植物抗病性密切相關。例如，在棉花和擬南芥中過表達陸地棉R2R3-MYB家族基因GhMYB36能夠提高棉花和擬南芥對黃萎病的抗性，將GhMYB36沉默后棉花對黃萎病抗性顯著降低，且GhMYB36能與病程相關蛋白基因PRI的啟動子結合，通過激活PR1的表達來提高棉花對黃萎病的抗性[33]。在葡萄中，VqMYB14和 VqMYB15 轉錄因子可增強苯丙氨酸代謝途徑上游基因PAL及STSs的表達，提高具有抗菌功能的5類黃芪類物質的含量，進而提高葡萄對白粉病的抗性。在葡萄和擬南芥中過表達VqMYB15基因，可正向調控SA途徑中抗病基因的表達，提高葡萄和擬南芥中活性氧的含量，誘導植物細胞產生超敏反應，增加胼抵質的含量，激活JA/ET途徑相關基因的表達，從而提高葡萄和擬南芥對白粉病的抗性[34]。GhMYB4 是棉花中一個負調控木質素合成的R2R3-MYB轉錄因子，研究發現

GhMYB4抑制棉花中木質素的積累但增強棉花抗病性，進一步的研究表明，GhMYB4通過降低棉花次生壁中木質素含量破壞細胞壁完整性，導致細胞壁發生破裂，從而釋放更多的損傷相關的分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP）分子，激活JA生物合成及信號轉導途徑及下游防御基因的表達，提高棉花對黃萎病的抗性[35]。本研究通過對海7124接種黃萎病病菌（大麗輪枝菌V991）后不同時間點根部組織的轉錄組數據分析和海島棉R2R3-MYB家族基因順式作用元件分析，從海島棉中篩選出5個黃萎病抗性候選基因，分別為 GbMYB-2I，GbMYB-34，GbMYB-39，Gb- （204號MYB-76和GbMYB-83。表達模式分析結果表明，5個候選基因均能響應黃萎病脅迫及SA和

MeJA的誘導，表達量也顯著上升，表明這些基因 可能被SA和MeJA誘導激活表達，進而激活下游 防御基因的表達，從而增強海島棉對黃萎病的抗 性。

綜上，本研究在海島棉中鑒定到98個R2R3-MYB家族基因，進化分析顯示可分為3個亞組?；蚪Y構分析表明絕大部分基因都包含3個外顯子和2個內含子。啟動子分析發現這些基因含有較多與抗病相關的順式作用元件。通過黃萎病脅迫及SA和MeJA誘導表達篩選到5個黃萎病抗性候選基因（GbMYB-21、GbMYB-34、GbMYB-39、GbMYB-76和GbMYB-83）。本研究結果可為進一步研究 R2R3-MYB 基因在海島棉抗病中的作用及分子機制奠定基礎。

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